三氯乙酰亞胺酯法合成紫草素-1′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

李龍珠，張玉心，吳成柱，李紅梅，馬 濤

紫草素是從我國(guó)傳統(tǒng)中藥紫草中分離得到的一種脂溶性萘醌類(lèi)化合物[1]，是紫草的主要活性成分。研究表明紫草素具有抗腫瘤[2-4]、抗炎[5]、抗病毒[6]、抗菌[7]、促進(jìn)傷口愈合[8]等藥理作用。與其他萘醌類(lèi)化合物類(lèi)似，紫草素的穩(wěn)定性較差，且在水中的溶解度低，這在一定程度上阻礙了紫草素的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用[9]。

糖是自然界中存在最為廣泛的生物分子，幾乎存在于所有生命體中，通過(guò)糖苷化修飾可以提高化合物的水溶性和穩(wěn)定性[10-11]。本課題組前期采用酶催化法已經(jīng)制得兩種紫草素吡喃葡萄糖苷，其穩(wěn)定性均顯著高于紫草素，水溶性相較紫草素增加上千倍，兩種紫草素吡喃葡萄糖苷在體外抗腫瘤作用相較紫草素有所下降[12]，但在后續(xù)開(kāi)展的肝癌裸鼠移植瘤預(yù)實(shí)驗(yàn)中，紫草素-1′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的抑腫瘤作用明顯優(yōu)于紫草素。為了對(duì)其體內(nèi)抗腫瘤作用進(jìn)行全面研究，需要大量制備紫草素-1′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷用于裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)及藥代動(dòng)力學(xué)研究。但是在實(shí)驗(yàn)室條件下，通過(guò)酶催化法所得糖苷化合物的量只有微克級(jí)，難以滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的需要，而且酶的制備需要經(jīng)過(guò)菌群培養(yǎng)、基因表達(dá)、構(gòu)建重組質(zhì)粒、提純等多個(gè)步驟，這也導(dǎo)致了酶的制備成本高[13]，因此迫切需要建立一種成本低、操作簡(jiǎn)便且適于大量制備紫草素-1′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的方法。

目前已有研究[14]采用三氯乙酰亞胺酯法將多種乙?；〈奶腔釉谧喜菟?′-OH上，制得了11種紫草素苷，尚未見(jiàn)化學(xué)法合成紫草素-1′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的報(bào)道。本研究選擇β-D-吡喃葡萄糖為起始原料，經(jīng)選擇性乙?；?，再進(jìn)一步制得糖基三氯乙酰亞胺酯作為糖苷供體，選擇催化效能更佳的三氟甲磺酸三甲基硅脂來(lái)催化紫草素糖基化反應(yīng)，制得紫草素-2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖苷，利用甲醇鈉/甲醇醇解脫乙?；笾频米喜菟?1′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，并采用核磁共振法、質(zhì)譜法對(duì)各產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 IKA RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó) IKA 公司)；LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；B23-2型恒溫磁力攪拌器(上海碩光司樂(lè)儀器有限公司)；梅特勒-托利多XP250型天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；BRUKER ASCENDTM400 MHz核磁共振光譜儀(美國(guó)Bruker公司)；Thermo TSQ quantis液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。

甲醇、乙酸乙酯、石油醚、乙醇、無(wú)水乙醚(上海泰坦化學(xué)有限公司)均為分析純；左旋紫草素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110769-200506)；乙酸酐(江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司)；4A分子篩、吡啶(薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司)；β-D-葡萄糖、四氫呋喃、1,8-二氮雙環(huán)(5,4,0)-7-十一烯、三氯乙腈、乙酸肼、碳酸氫鈉(上海麥克林生化科技有限公司)；三氟甲磺酸三甲基硅脂(阿達(dá)瑪斯試劑有限公司)。

1.2 方法 以二氯甲烷為溶劑，三氟甲磺酸三甲基硅脂為催化劑，在嚴(yán)格無(wú)水和N2保護(hù)下，通過(guò)自制的2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D吡喃糖酰基2,2,2-三氯乙酰亞胺酯與紫草素發(fā)生糖苷化反應(yīng)，有效合成了紫草素-2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖苷，并在甲醇鈉/甲醇體系中將乙?；冀鉃榱u基，最終得到目的產(chǎn)物紫草素-1′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(見(jiàn)圖1)。

1.2.1 1,2,3,4,6-五-O-乙?；咸烟?1)的合成 取乙酸酐56.7 mL和吡啶5 mL混勻后分多次加入至18 gβ-D-葡萄糖中，冰浴條件下攪拌，并緩慢升至室溫反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束加入25 mL蒸餾水?dāng)嚢瑁儆?5 mL乙酸乙酯萃取2～3次，取有機(jī)相用10%飽和碳酸氫鈉水溶液中和反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物醋酸及過(guò)量的乙酸酐，再用水洗3次，每次20 mL，上層有機(jī)層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，得到的粗產(chǎn)物于室溫下用75 mL乙醇結(jié)晶，得到白色粉末，采用核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)和電噴霧-質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)表征其結(jié)構(gòu)。

1.2.2 2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖(2)的合成 將20 g化合物(1)和5.2 g乙酸肼加入到10 mL四氫呋喃中溶解，室溫下反應(yīng)4 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用10 mL二氯甲烷溶解殘余物，將有機(jī)相用水洗3次，每次5 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得粗產(chǎn)物，加入20 mL無(wú)水乙醚和20 mL石油醚后于冰水浴下析出結(jié)晶，得到白色粉末，采用NMR和ESI-MS表征其結(jié)構(gòu)。

1.2.3 2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D吡喃糖?；?,2,2-三氯乙酰亞胺酯(3)的合成 取9 g化合物(2)和10 mL三氯乙腈依次加入至有50 mL無(wú)水二氯甲烷的燒瓶中，冰浴條件下攪拌30 min，再緩慢滴加1.5 mL的1,8-二氮雙環(huán)(5,4,0)-7-十一烯，撤除冰浴，在N2保護(hù)下室溫反應(yīng)過(guò)夜。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑后得黃褐色油狀物，油狀物經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=8∶1)純化，最終得白色粉末，采用NMR和ESI-MS表征其結(jié)構(gòu)。

1.2.4 紫草素-2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)的合成 將10 g紫草素和18.8 g化合物(3)溶解于70 mL無(wú)水二氯甲烷中，加入4A分子篩粉末，N2保護(hù)下室溫?cái)嚢?0 min，然后緩慢滴加0.63 mL三氟甲磺酸三甲基硅脂，于-20 ℃反應(yīng)8 h。抽濾除去分子篩，將有機(jī)相用水洗3次，每次50 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后，將粗產(chǎn)物用乙酸乙酯復(fù)溶，經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1)純化，最終得紅色粉末，采用NMR和ESI-MS表征其結(jié)構(gòu)。

1.2.5 紫草素-1′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)的合成 取10 g化合物(4)溶解于50 mL甲醇中，向其中緩慢滴加甲醇鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液pH至8～9，室溫回流反應(yīng)2 h，加入冰醋酸調(diào)pH為中性并終止反應(yīng)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑后，將粗產(chǎn)物用二氯甲烷復(fù)溶后經(jīng)硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇=10∶1)純化，最終得紅色粉末，采用NMR和ESI-MS表征其結(jié)構(gòu)。

1.2.6 化合物5純度測(cè)定 取適量化合物5，加入適量甲醇配制成溶液，取20 μL化合物5的甲醇溶液進(jìn)高效液相色譜儀分析，以峰面積歸一化法測(cè)定化合物5純度。采用SunFireTMprep C18(10 mm×250 mm) 色譜柱，以水-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(0～20 min，20%乙腈→100%乙腈)，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2 結(jié)果

化合物1為白色粉末，得到28.5 g，收率73.1%。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.73 (d,J=8.0 Hz,1H),5.27 (t,J=9.4 Hz,1H),5.15 (m,2H),4.30 (dd,J=4.6,12.5 Hz,1H),4.13 (dd,J=2.2,12.5 Hz,1H),3.86 (m,1H),2.13 (s,3H),2.10 (s,3H),2.05 (s,6H),2.03 (s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ：170.6,170.1,169.4,169.2,168.9,91.7,72.8,72.7,70.2,67.8,61.5,20.8,20.7,20.6,20.6,20.5。ESI-MS(m/z)：413.15[M+Na]+。

化合物2為白色粉末，得到12.8 g，收率71.7%。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.27 (t,J=9.5 Hz,1H),5.10 (t,J=9.9 Hz,1H),4.90 (dd,J=8.0,9.7 Hz,1H),4.76 (t,J=8.6 Hz,1H),4.25 (m,2H),3.77 (m,1H),3.66 (d,J=8.8,1H),2.11 (d,J=1.4,6H),2.04 (d,J=3.8,6H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:170.9,170.7,170.1,169.6,169.5,95.6,73.3,72.2,68.5,62.0,20.7,20.7,20.6,20.6。ESI-MS(m/z)：371.13[M+Na]+。

化合物3為白色粉末，得到12.4 g，收率57.8%。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ：8.69 (s,1H),6.63 (d,J=4.0 Hz,1H),5.58 (dd,J=1.2,3.1 Hz,1H),5.45 (dd,J=3.1,10.8,1H),5.39 (dd,J=3.5,10.8 Hz,1H),4.46 (t,J=6.6 Hz,1H),4.15(m,2H),2.19 (s,3H),2.05 (s,3H),2.03 (s,3H),2.04(d,J=2.1,6H)。13C NMR (100 MHz,CDCl3)δ：170.3,170.1,170.1,169.9,161.0,93.6,90.8,69.0,67.5,67.4,66.9,61.2,20.7,20.6,20.6,20.5。ESI-MS(m/z)：514.08[M+Na]+。

化合物4為紅色粉末，得到8.7 g，收率68.3%。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ：12.48(s,1H),12.42 (s,1H),7.14 (m,3H),5.15 (m,1H),5.03 (m,3H),4.89 (m,1H),4.58 (d,J=8.1 Hz,1H),4.01 (m,2H),3.57 (m,1H),2.4(m,1H),2.24 (m,1H),2.12 (s,3H),1.98 (s,3H),1.95 (s,3H),1.87(s,3H),1.60 (s,3H),1.47 (s,3H)。13C NMR (100 MHz,CDCl3)δ：181.2,178.6,170.2,170.0,169.1,168.5,165.1,164.8,149.2,135.0,134.1,13.7,131.5,119.2,112.1,111.6,101.7,75.5,73.2,72.0,71.4,69.1,61.9,33.5,25.8,20.8,20.6,20.4,20.3,17.8。ESI-MS(m/z)：641.26[M+Na]+。

化合物5為紅色粉末，得到4.9 g，收率67.3%。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ：7.28(s,3H),7.21(s,3H),5.37(t,J=14.8,1H),5.14(br s,1H),4.64(d,J=7.7,1H),3.23(m,1H),3.26(m,2H),3.27(m,2H),3.53(m,1H),3.72(m,1H),2.63(s,1H),2.62(m,1H),2.64(m,1H),2.53(m,1H),1.66(s,3H),1.52(s,3H)。13C NMR (100 MHz,CDCl3)δ:183.5,183.3,175.2,174.4,151.7,136.8,135.6,135.0,133.8,120.7,115.6,113.5,104.7,79.6,78.4,75.2,73.5,71.8,63.8,35.5,26.7,18.8。ESI-MS(m/z)：473.19[M+Na]+。

根據(jù)ESI-MS和NMR結(jié)果分析其分子式為C22H26O10，其共振譜與紫草素相似，除了來(lái)自葡萄糖基部分的額外核磁信號(hào)，基于葡萄糖異頭位質(zhì)子的耦合常數(shù)(為7.7 Hz)，包括從δH 4.64(d,J=7.7,1H,H-1″)到δC 75.2(C-1′)的異核多鍵關(guān)聯(lián)表明葡糖基部分已經(jīng)連接到紫草素C-1′處，化合物5的結(jié)構(gòu)被鑒定為紫草素-1′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。總收率為38.9%，峰面積歸一化法測(cè)定其純度為96.7%，色譜圖見(jiàn)圖2。

3 討論

相較于酶催化法，化學(xué)合成法制備糖苷類(lèi)化合物具有原料易得，成本低的優(yōu)勢(shì)。常用的化學(xué)糖基化方法主要有Koenig-Knorr法[15]、三氯乙酰亞胺酸酯法[16]和相轉(zhuǎn)移催化法[17]等。Koenig-Knorr法產(chǎn)率低、區(qū)域選擇性差、反應(yīng)后處理繁瑣，并且使用價(jià)格昂貴且環(huán)境污染較大的汞、銀鹽作催化劑，近年來(lái)該方法的使用在逐漸減少。相轉(zhuǎn)移催化法具有反應(yīng)速度快，反應(yīng)條件溫和，后處理簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，但是Koenig-Knorr法和相轉(zhuǎn)移催化法在合成糖基供體時(shí)常以苯乙?；蛞阴；Ｗo(hù)的溴代糖作中間體，溴代糖對(duì)制備和貯藏的條件要求十分苛刻，且極易分解，會(huì)給下一步的糖基化反應(yīng)帶來(lái)很大影響。

三氯乙酰亞胺酯法制備糖苷類(lèi)化合物不需要重金屬催化劑，多采用糖基三氯乙酰亞胺酯作為糖苷供體，與其他糖基給體相比，糖基三氯乙酰亞胺酯更適合于氧苷類(lèi)化合物的合成且不易形成原酸酯副產(chǎn)物，由于有鄰基參與效應(yīng)，糖基三氯乙酰亞胺酯法具有高立體選擇性和高收率的優(yōu)點(diǎn)[18]，近年來(lái)在寡糖和糖苷的合成中得到了廣泛的應(yīng)用，逐漸成為首選方法[13]。

三氯乙酰亞胺酯法對(duì)底物的要求較高，反應(yīng)體系要嚴(yán)格除水，因此在合成化合物4時(shí)采用加入分子篩的方法以除去反應(yīng)體系中的水，經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)探索，最終選擇了除水效果最好的4A分子篩。在前期實(shí)驗(yàn)摸索時(shí)，采用了文獻(xiàn)[14]中的三氟化硼乙醚溶液作為糖基化反應(yīng)催化劑，反應(yīng)得到較多副產(chǎn)物，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率低，不易純化，后將催化劑更換為三氟甲磺酸三甲基硅脂，化合物4的得率顯著提高，收率達(dá)到57.8%，且副產(chǎn)物減少。考慮到糖苷鍵易斷裂，在化合物4除去乙?；苽浠衔?時(shí)不可采用水解的方式，本研究選擇無(wú)水甲醇為溶劑，采用甲醇鈉/甲醇體系對(duì)化合物進(jìn)行醇解，且反應(yīng)需要在低溫、無(wú)水的條件下進(jìn)行，達(dá)到減少脫水物雜質(zhì)，提高產(chǎn)物收率的目的。

三氯乙酰亞胺酯法用于紫草素-1′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷合成，具有反應(yīng)溫和、操作簡(jiǎn)單、高立體選擇性的優(yōu)點(diǎn)，也為其他天然物質(zhì)的糖基化修飾提供了參考。