大鼠carabin腺病毒干擾載體構(gòu)建及功能鑒定

程闊菊，吳 慶，羅健華，魏譚軍，周殿儒，肖 成,黃 河，羅 云，王 毅

carabin是2007年在人T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一個新的鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin，CaN)結(jié)合蛋白，主要表達(dá)于脾臟及血液中[1]，同時可與Ras結(jié)合，基于其與CaN和Ras均能相互作用的特性，將其命名為carabin[1]。前期研究[1-4]表明，carabin作為CaN的內(nèi)源性負(fù)反饋抑制蛋白，通過CaN和Ras信號通路負(fù)反饋抑制T細(xì)胞及B細(xì)胞的持續(xù)活化，在機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要作用。最近研究[5-6]表明，carabin在心肌細(xì)胞中亦有表達(dá)，可通過負(fù)性調(diào)節(jié)CaN和Ras信號通路抑制心肌細(xì)胞的肥大，并有可能成為診治心衰引起心肌肥厚的靶點。我們的前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，carabin在小鼠梗死心臟及經(jīng)缺血/缺氧處理的人心室肌細(xì)胞株AC16中表達(dá)均顯著下調(diào)，提示carabin在心肌梗死及缺血中可能起到一定的作用，但目前尚無相關(guān)研究報道。本研究擬采用腺病毒載體系統(tǒng)，設(shè)計針對大鼠carabin基因的干擾序列，構(gòu)建carabin腺病毒干擾載體(Ad-carabin-shRNA)，感染H9C2心肌細(xì)胞篩選針對大鼠carabin基因干擾效果最佳的Ad-carabin-shRNA，為進(jìn)一步觀察carabin信號通路在心肌梗死及缺血中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及載體質(zhì)粒 細(xì)胞株293A、293T及H9C2購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，ADV4-U6-CMV重組穿梭質(zhì)粒和pGp-Ad-pac載體骨架質(zhì)粒購自吉瑪基因。

1.1.2 主要試劑與儀器 RNA引物合成及DNA測序(美國，Invitrogen公司)。限制性內(nèi)切酶EcoRI(NEB，R0101M)、BamHⅠ(NEB，R0136S)，T4 DNA連接酶(NEB，M0202L)，RNAi-Mate轉(zhuǎn)染試劑(吉瑪基因，G04001)，Polybrene(Sigma，H9268)、carabin抗體(Abcam，ab77625)、β-actin抗體(Abcam，ab115777)、山羊抗兔IgG(碧云天，WSA0208)。二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-15AC)，生物安全柜(上海上凈凈化設(shè)備有限公司，BSC-ⅡA2)，熒光顯微鏡(Motic，AE31-252B)。

1.1.3 引物設(shè)計及合成 針對大鼠carabin基因，設(shè)計3對carabin-shRNA寡核苷酸序列(carabin-shRNA-1：5′-GAC CTT ACA CTG GGA GAA GAC-3′；carabin-shRNA-2：5′-GTC TAC CTC CCT GGC TAC TAT-3′；carabin-shRNA-3：5′- AGC TGC AGG AAG AGG TCT TCA -3′)，分別插入ADV4-U6-CMV穿梭質(zhì)粒的EcoRⅠ與BamHⅠ酶切位點，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成3對寡核苷酸，規(guī)格為2A。

1.2 方法

1.2.1 ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA重組穿梭干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及篩選 將3對carabin-shRNA寡核苷酸退火形成雙鏈，EcoRⅠ與BamHⅠ酶切寡核苷酸和ADV4-U6-CMV穿梭質(zhì)粒，T4 DNA連接酶連接酶切后的寡核苷酸和ADV4-U6-CMV穿梭質(zhì)粒。將3組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，接種于含氨芐西林的培養(yǎng)基平板，次日挑選陽性單克隆菌群，藥液培養(yǎng)過夜，菌液送上海生工生物測序，將序列無誤的質(zhì)粒分別命名為ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA-1、ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA-2、ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA-3。

1.2.2 AD-carabin-shRNA包裝、收毒及擴(kuò)增 將制備的ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA腺病毒穿梭質(zhì)粒與pGp-Ad-pac載體骨架質(zhì)粒經(jīng)高純度無內(nèi)毒素抽提后，用轉(zhuǎn)染試劑RNAi-Mate進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周，每7 d左右補(bǔ)充一次新鮮培養(yǎng)基，然后收集細(xì)胞和上清液置于離心管中，凍融3次，2 000 r/min離心5 min，取上清即為病毒液初代原液。連續(xù)三代反復(fù)擴(kuò)增收集病毒后，行病毒的大量擴(kuò)增，然后對其純化和濃縮后得到高滴度的腺病毒濃縮液。

1.2.3 AD-carabin-shRNA滴度測定 參考復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所方法[8]，在293T細(xì)胞中測定并標(biāo)定病毒滴度，采用微量全細(xì)胞病變法檢測病毒滴度。取96孔板，每孔加入0.5×104～1×104293T細(xì)胞，48 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL經(jīng)10倍梯度稀釋的病毒液(每排8孔為一稀釋梯度)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后觀察熒光表達(dá)情況。正常情況下，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而相應(yīng)減少，計數(shù)最后2排含有熒光細(xì)胞的孔中的熒光細(xì)胞個數(shù)，將得到的數(shù)值除以各自相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可計算出病毒原液的滴度值。病毒滴度=(X+Y×10)×1 000/2V (X、Y分別為最后兩排有熒光的熒光細(xì)胞克隆數(shù)，V為病毒液的含量)。

1.2.4 AD-carabin-shRNA功能鑒定 H9C2心肌細(xì)胞傳代至108時接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長至90%融合時，每孔加入含1×105病毒的100 μL病毒液，孵育4 h后更換培養(yǎng)基，44 h后檢測H9C2心肌細(xì)胞的carabin RNA及蛋白表達(dá)。采用實時熒光定量PCR及Western blotting檢測carabin mRNA和蛋白表達(dá)。其中3孔棄去培養(yǎng)液后，每孔按1 mL/10 cm2加入分離試劑tripure isolation reagent，按照說明書提取總RNA，接著按照Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，然后用LightCycler 480 PCR儀對carabin進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 10 s～60 ℃ 10 s(熒光檢測)，40個循環(huán)。carabin引物序列，上游引物：5′-GGT GCA GCA AGG AGC CTG-3′，下游引物：5′-TGA GTC GGA CCC TAG AGA GC-3′，產(chǎn)物長度118 bp。內(nèi)參β-actin引物序列，上游引物：5′-GGA GCA ATG ATC TTG AT-3′，下游引物：5′-CCT TCC TGG GCA TGG AGT C-3′，產(chǎn)物長度202 bp。另外3孔棄去培養(yǎng)液后，每孔加入500 μL細(xì)胞裂解液RIPA，超聲裂解細(xì)胞收集蛋白，加入SDS煮沸變性蛋白，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗、孵育二抗、顯色、成像，觀察carabin蛋白表達(dá)，內(nèi)參為β-actin。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA重組穿梭干擾質(zhì)粒的構(gòu)建 DNAMAN比對分析ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA重組穿梭干擾質(zhì)粒的基因測序結(jié)果，挑選與設(shè)計的3對carabin-shRNA寡核苷酸序列一致者，分別命名為ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA-1、ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA-2、ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA-3(見圖1)。

2.2 Ad-carabin-shRNA包裝、收毒、擴(kuò)增及滴度測定 將制備的ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA腺病毒穿梭質(zhì)粒與pGp-Ad-pac 載體骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A 細(xì)胞后，2周左右時顯微鏡下觀察細(xì)胞出毒情況，待出現(xiàn)明顯噬斑、細(xì)胞大部分病變從底部脫落時進(jìn)行收毒。采用微量全細(xì)胞病變法檢測病毒滴度，以倒數(shù)第二列(10-3)含有熒光細(xì)胞孔中的熒光細(xì)胞個數(shù)計算，病毒滴度為9×108TU/mL(見圖2)。

2.3 Ad-carabin-shRNA功能鑒定 與對照組相比，Ad-carabin-shRNA-1和Ad-carabin-shRNA-2均可明顯干擾carabin mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.01)(見圖3、表1)。

3 討論

經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定，carabin蛋白含有一個CaN 結(jié)合區(qū)域和一個Ras結(jié)合區(qū)域：CaN結(jié)合區(qū)域位于羧基端，其最小結(jié)合區(qū)域為羧基末端的41個氨基酸殘基(aa 406～446)；Ras結(jié)合區(qū)域為氨基端的89位到294位氨基酸序(aa 89～294)[1]。經(jīng)在體和離體實驗的功能鑒定：(1)CaN 結(jié)合區(qū)域，carabin的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)依賴于CaN信號通路的活化，而產(chǎn)生的carabin可與CaN結(jié)合，進(jìn)而抑制CaN信號通路，因此carabin是作為CaN的負(fù)反饋抑制蛋白來發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用的；(2)Ras結(jié)合區(qū)域，具有Ras GAP活性，可特異性地抑制Ras/ERK1/2信號通路。前期研究[1-4]表明，在T細(xì)胞及B細(xì)胞中carabin作為CaN的內(nèi)源性負(fù)反饋抑制蛋白通過CaN-NFAT和Ras/ERK1/2信號通路負(fù)反饋抑制T細(xì)胞及B細(xì)胞的持續(xù)活化，在機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要作用。

表1 Ad-carabin-shRNA在H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)的干擾效應(yīng)

最近研究[5-6]表明，carabin在心肌細(xì)胞中亦有表達(dá)，可抑制心臟肥厚，并有可能成為診治心衰的新靶點。我們的前期研究[7]顯示，在小鼠冠狀動脈左前降支結(jié)扎誘導(dǎo)的心肌梗死動物模型中，術(shù)后7 d及14 d梗死區(qū)域carabin的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(約7倍)，同時經(jīng)缺血/缺氧處理的人心室肌細(xì)胞株AC16中表達(dá)均亦顯著下調(diào)。那么下調(diào)的carabin在心肌梗死中是否會起到一定的作用呢，目前尚無相關(guān)研究報道。 carabin為一新發(fā)現(xiàn)的蛋白，目前尚未發(fā)現(xiàn)其特異性抑制劑，鑒于此，本研究利用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)，針對carabin蛋白構(gòu)建相應(yīng)干擾載體，以達(dá)到特異性抑制carabin的作用，為carabin的研究奠定基礎(chǔ)。

RNAi技術(shù)是一種由外源性或內(nèi)源性雙鏈DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)綠后基因沉默技術(shù)。短發(fā)夾RNA(short-hairpin RNA,shRNA)是根據(jù)小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)設(shè)計的類似雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA。相比于siRNA，shRNA隨載體進(jìn)入細(xì)胞后具有更高的內(nèi)在穩(wěn)定性，并且shRNA根據(jù)其特性可以在細(xì)胞內(nèi)快速合成大量的shRNA，其沉默作用更加持久[9]。目前，用于目的基因轉(zhuǎn)移的病毒載體主要包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。與其他病毒載體系統(tǒng)相比，腺病毒載體具有遺傳毒性低、不整合基因組、寄主范圍廣、感染效率高、可感染分裂期和靜止期細(xì)胞、理化性質(zhì)穩(wěn)定及包容量大等優(yōu)點，在分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[10]。因考慮后期研究涉及動物及細(xì)胞實驗，對干擾效率要求高，因此本研究采用腺病毒載體構(gòu)建carabin干擾載體。

在Ad-carabin-shRNA 構(gòu)建過程中，我們首先合成3對carabin-shRNA寡核苷酸，退火形成雙鏈后定向克隆至ADV4-U6-CMV穿梭質(zhì)粒，經(jīng)測序驗證后與pGp-Ad-pac Vector骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293A 細(xì)胞，培養(yǎng)2周后收集病毒原液，再連續(xù)三代反復(fù)行病毒擴(kuò)增。病毒滴度測定后，感染H9C2心肌細(xì)胞行Ad-carabin-shRNA功能鑒定，鑒定結(jié)果表明，AD-carabin-shRNA-1和AD-carabin-shRNA-2具有干擾效果。