E003對(duì)RSA 模型小鼠蛻膜組織超微結(jié)構(gòu)的影響

龍生根，章志琴，黃志輝，夏雷震，唐亮，伍瓊芳，黃歐平

江西省婦幼保健院 1.婦科腫瘤，2.輔助生殖中心，3.婦科，南昌 330006

反復(fù)自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）又稱習(xí)慣性流產(chǎn)，是指連續(xù)發(fā)生兩次及以上的妊娠20 周以內(nèi)妊娠損失，發(fā)病率為1%～5%，60%以上原因不明，稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA），RSA 是全世界共同關(guān)注的疑難雜癥[1～3]。E003 即瑞香素（daphnetin）作為我國(guó)首創(chuàng)的天然藥物，其藥理作用十分廣泛，主要包括：抗炎、抗氧化、抗病原微生物、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等[4～8]，但其在流產(chǎn)方面的作用尚未見(jiàn)任何報(bào)道。本研究通過(guò)觀察RSA 模型小鼠蛻膜組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，首次探討瑞香素對(duì)RSA 模型小鼠的可能治療作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

將雌性CBA/J 與雄性BALB/c 小鼠按2：1 合籠交配建立正常妊娠小鼠模型，雌性CBA/J 小鼠與雄性DBA/2 小鼠按2：1 比例合籠交配建立RSA 小鼠模型，檢出陰栓者計(jì)為妊娠第0 d。實(shí)驗(yàn)共分4 組：正常妊娠組、RSA 模型組、E003 低劑量組（1 mg·kg-1·day-1）、E003 高劑量組（4 mg·kg-1·day-1），每組10 只雌鼠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RSA 模型小鼠制備及大體胚胎觀察 各組從妊娠第0 d 開(kāi)始灌胃給藥，E003 高劑量組和低劑量組灌胃容積均為0.4 ml/20 g[9]，正常妊娠組和RSA 模型組給予相同體積蒸餾水，連續(xù)給藥14 d，末次給藥1 h后處死小鼠，打開(kāi)腹腔，暴露子宮，觀察子宮生長(zhǎng)情況，記錄胚胎著床數(shù)目和胚胎吸收數(shù)目并取其蛻膜組織。

1.2.2 蘇木精-伊紅（HE）染色 分離蛻膜組織，4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定24 h，水洗，固定，脫色，包埋，切片，經(jīng)HE 染色后BX51 熒光顯微鏡觀察。

1.2.3 透射電鏡標(biāo)本制備 新鮮組織確定取材部位，組織體積≤1 mm×1 mm×1 mm，迅速投入電鏡固定液4 ℃固定2～4 h。0.1 mol/L 磷酸緩沖液PB（pH 7.4）漂洗3 次，每次15 min；1%的鋨酸0.1 mol/L 磷酸緩沖液PB(pH 7.4)室溫（20 ℃）固定2 h。0.1 mol/L 磷酸緩沖液PB(pH 7.4)漂洗3 次，每次15 min；組織依次入50%-70%-80%-90%-95%-100%-100%酒精-100%丙酮-100%丙酮上行脫水，每次15 min；丙酮：812 包埋劑=1：1 2～4 h，丙酮：812 包埋劑=2：1 滲透過(guò)夜，純812 包埋劑5～8 h，將純812 包埋劑倒入包埋板，樣品插入包埋板后37 ℃烤箱過(guò)夜；60 ℃烤箱聚合48 h；超薄切片機(jī)切取60～80 nm 超薄切片；鈾鉛雙染色（2%醋酸鈾飽和酒精溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min），切片室溫干燥過(guò)夜；HT7700 透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠子宮胚胎形態(tài)

正常妊娠組小鼠子宮胚胎形狀似串珠，色澤光鮮，大小均一；RSA 模型組子宮呈黑紫或褐色，內(nèi)可見(jiàn)陳舊性出血或伴血凝塊，體積變小，部分胚胎萎縮或消失；E003 處理組（低劑量組和高劑量組）胚胎吸收率低于RSA 模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；E003 高劑量組胚胎吸收率與正常妊娠組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05（表1，圖1）。

表1 各組小鼠胚胎吸收率（%，n=10）Tab.1 Comparison of embryo absorption rate in each group(%，n=10)

2.2 小鼠子宮蛻膜組織形態(tài)學(xué)

正常妊娠組可見(jiàn)蛻膜細(xì)胞排列整齊，間隙緊密，大小均勻，數(shù)量正常；RSA 模型組蛻膜細(xì)胞碎裂，數(shù)量明顯減少；E003 低劑量組蛻膜細(xì)胞數(shù)量較模型組增多，排列較整齊；E003 高劑量組蛻膜細(xì)胞數(shù)量較模型組增多，排列更整齊（圖2）。

2.3 小鼠蛻膜組織超微結(jié)構(gòu)

正常妊娠組可見(jiàn)體積較大的蛻膜細(xì)胞，細(xì)胞排列整齊，間隙緊密，細(xì)胞核大而圓、核內(nèi)以常染色質(zhì)為主，細(xì)胞漿內(nèi)含豐富的細(xì)胞器；RSA 模型組蛻膜細(xì)胞體積減小，細(xì)胞間隙明顯增大，細(xì)胞核曲度增加，異染色質(zhì)增多且靠近核膜，胞漿致密，可見(jiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和少量空泡樣變的線粒體；E003 低劑量組相較模型組，蛻膜細(xì)胞體積增大，細(xì)胞間隙變??；E003 高劑量組相較模型組，蛻膜細(xì)胞體積增大，細(xì)胞間隙更?。▓D3）。

2.4 小鼠蛻膜組織血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)

圖1 各組小鼠胚胎形態(tài)A：正常妊娠組, 胚胎形似串珠，大小均一，色澤光鮮 B：RSA 模型組,呈褐色，內(nèi)可見(jiàn)陳舊性出血或血凝塊，體積變小，部分胚胎萎縮、消失 C：E003 低劑量組,胚胎吸收率低于RSA 模型組 D：E003 高劑量組,形態(tài)接近正常妊娠組Fig.1 Embryos morphology of each groupA: normal pregnancy group,the embryos were beaded,uniform in size and bright in color; B: RSA model group,the embryos were brown with old bleeding or blood clots,it was small in volume,and some embryos atrophied and disappeared; C:E003 low-dose group,embryo absorption rate was lower than that of the RAS model group; D:E003 high-dose group,morphology was close to the normal pregnancy group

圖2 各組小鼠子宮蛻膜細(xì)胞組織形態(tài)A：正常妊娠組, 細(xì)胞排列整齊，間隙緊密，大小均勻，數(shù)量正常 B：RSA 模型組,細(xì)胞碎裂，數(shù)量明顯減少 C：E003 低劑量組,細(xì)胞數(shù)量較模型組增多，排列較整齊 D：E003 高劑量組,細(xì)胞數(shù)量較模型組增多，排列更整齊Fig.2 Morphology of the uterus decidual tissues of mice in each groupA: normal pregnancy group,the cells were in alignment,the space was close,the size was uniform and the number was normal; B: RSA model group,the cells were broken up and the number significantly reduced; C:E003 low-dose group,the cells number was larger than that of the model group and the cells were in alignment; D:E003 high-dose group,the cells number was larger than that of the model group and the cells were more neatly arranged

圖3 各組小鼠蛻膜組織超微結(jié)構(gòu)A：正常妊娠組,蛻膜細(xì)胞排列整齊，間隙緊密 B：RSA 模型組,細(xì)胞體積減小，細(xì)胞間隙明顯增大，少量空泡樣變的線粒體 C：E003 低劑量組,相較模型組細(xì)胞體積增大，細(xì)胞間隙變小 D：E003 高劑量組,相較模型組細(xì)胞體積增大，細(xì)胞間隙更小箭頭指向蛻膜細(xì)胞Fig.3 Ultrastructure of decidual tissues of mice in each groupA: normal pregnancy group,the decidual cells were neatly arranged and closely spaced; B: RSA model group,the volume of decidual cells decreased,the intercellular space significantly increased,and a small number of vacuol-like mitochondria were observed; C:E003 low-dose group,the volume of decidual cells was larger than that in the model group,and the intercellular space was smaller than that in the model group; D:E003 high-dose group,the volume of decidual cells was larger than that in the model group,and the intercellular space was smaller than that in the model groupArrows were indicated by decidual cells

正常妊娠組血管壁完整，由單個(gè)或多個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)繞而成，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜向腔面突起，核膜完整。RSA 模型組血管壁不完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞核呈梭形。相較模型組，E003 低劑量組血管壁較完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞間隙稍增寬；E003 高劑量組血管壁更完整，由單個(gè)或多個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)繞而成，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)更完整，細(xì)胞膜向腔面突起，核膜較完整（圖4）。

3 討論

圖4 各組小鼠蛻膜組織血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)A：正常妊娠組,血管壁完整，由單個(gè)或多個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)繞而成，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整 B：RSA 模型組,血管壁不完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞核呈梭形 C：E003 低劑量組,血管壁較模型組完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形 D：E003 高劑量組,血管壁接近正常妊娠組箭頭指向血管內(nèi)皮細(xì)胞Fig.4 Ultrastructure of vascular endothelial cells in decidual tissues of mice in each groupA: normal pregnancy group,the vascular wall was intact,and surrounded by a single or multiple vascular endothelial cells.The vascular endothelial cells were intact in structure; B:RSA model group,the vascular wall was incomplete,the vascular endothelial cell structure was incomplete,and the nucleus was fusiform; C:E003 low-dose group,the vascular wall was more complete than that of the model group,and the vascular endothelial cells were long fusiform;D:E003 high-dose group,the vascular wall was close to the normal pregnancy group

RSA 不僅對(duì)患者的健康和心理狀況產(chǎn)生重大影響，甚至可能引發(fā)一系列家庭問(wèn)題，因此RSA也被認(rèn)為是一個(gè)影響婚姻關(guān)系的生活事件，或給社會(huì)帶來(lái)不穩(wěn)定因素；并與胃病或特應(yīng)性皮炎的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[10～12]，所以尋找一種有效防止流產(chǎn)的方法，提高治療策略和診斷至關(guān)重要，具有積極的臨床和社會(huì)意義。

瑞香素化學(xué)名7，8-二羥基香豆素（7，8-dihydmxycoumarin），又名祖師麻甲素，是香豆素類(lèi)化合物的代表性單體成分，為典型的香豆素衍生物，來(lái)源廣泛，藥用價(jià)值大。雖然其部分藥理作用目前僅限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞層面研究，但也為深入探明瑞香素的潛在藥理活性奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

子宮內(nèi)膜是胚胎種植、從中吸取營(yíng)養(yǎng)并得以繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育的重要組織，其正常發(fā)育、對(duì)胚胎的良好接受性以及與胚胎之間的相互協(xié)調(diào)，對(duì)于成功妊娠具有重要意義。蛻膜基質(zhì)細(xì)胞（DSCs）是人蛻膜的主要細(xì)胞成分，在胚胎著床、維持妊娠、母胎免疫耐受過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13,14]。在卵巢激素的作用下，這些DSC前體離開(kāi)血管，分化為蛻膜細(xì)胞，并在黃體后期（蛻膜期）擴(kuò)散至基質(zhì)。易流產(chǎn)的雌性CBA/J 小鼠與雄性DBA/2 小鼠交配是由免疫介導(dǎo)的自然流產(chǎn)動(dòng)物模型，其母體和胎兒的免疫耐受已經(jīng)破壞[15]。董立軍等[16]發(fā)現(xiàn)RSA 患者蛻膜細(xì)胞失去細(xì)胞間連接及發(fā)生細(xì)胞解體、嗜酸性增強(qiáng)等變化，從而使胚胎發(fā)育的正常環(huán)境被破壞，導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。楊美霞等[17]同樣發(fā)現(xiàn)RSA 患者蛻膜細(xì)胞有明顯壞死，細(xì)胞連接消失，血管內(nèi)皮受損，嚴(yán)重破壞了胚胎發(fā)育所需內(nèi)環(huán)境，從而導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)首次通過(guò)瑞香素灌胃制作RSA 模型小鼠，解剖小鼠子宮計(jì)算胚胎吸收率結(jié)果顯示E003 處理組（低劑量組和高劑量組）胚胎吸收率低于RSA 模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；E003 高劑量組胚胎吸收率與正常妊娠組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。同時(shí)光鏡下可見(jiàn)RSA 模型組蛻膜細(xì)胞碎裂，數(shù)量較正常妊娠組明顯減少；E003 低劑量組和高劑量組均較模型組蛻膜細(xì)胞數(shù)量增多，排列較整齊。電鏡下RSA 模型組較正常妊娠組蛻膜細(xì)胞體積減小，細(xì)胞間隙明顯增大，細(xì)胞核曲度增加，異染色質(zhì)增多且靠近核膜，胞漿致密，可見(jiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和少量空泡樣變的線粒體，血管壁不完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞核呈梭形；E003 低劑量組較模型組蛻膜細(xì)胞體積增大，細(xì)胞間隙增大，血管壁較完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞間隙稍增寬；E003 高劑量組較模型組蛻膜細(xì)胞體積增大，細(xì)胞間隙增大，血管壁較完整，由單個(gè)或多個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)繞而成，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞膜向腔面突起，核膜較完整。

綜上所述，本研究認(rèn)為瑞香素可能通過(guò)作用于RSA 模型小鼠蛻膜細(xì)胞和子宮內(nèi)膜血管形成，從而對(duì)RSA 達(dá)到一定的治療作用。但其具體機(jī)制需繼續(xù)研究。相信瑞香素作為我國(guó)自主創(chuàng)新的藥物，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和學(xué)者的不斷探尋，其多種藥理機(jī)制也會(huì)進(jìn)一步闡明，拓展其應(yīng)用，發(fā)揮我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢(shì)。