枸杞芽葉高純度有效成分的制備及抗氧化活性研究△

欒倩，樊毅，張淼，許露露，張元強，潘杉，哈成勇，張玉彬*

1.中國藥科大學，江蘇 南京 210009；2.銀川中科元昊科技有限公司，寧夏 銀川 750000；3.江蘇省人民醫(yī)院 浦口分院，江蘇 南京 211800

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實，具有極高的藥用價值，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品。《中華人民共和國藥典》2020年版中記載其性平，味甘，歸肝、腎經(jīng)，具有滋補肝腎、益精明目的功效[1]。長期以來，人們的注意力主要集中在枸杞子有效成分和生物活性的研究上，對于枸杞葉研究相對較少，其藥用價值未得到充分發(fā)揮。近年來，人們受到銀杏葉有效成分研發(fā)成功的啟發(fā)，開始關(guān)注枸杞葉加工與研發(fā)，成功研制了枸杞芽茶等相關(guān)保健品，但對枸杞葉中有效成分及其抗氧化活性的研究并不充分。

《本草綱目》記載：“春采枸杞葉，名天精草”，枸杞葉俗稱地仙苗、天精草、枸杞尖[2]。《藥性論》中記載：“葉和羊肉作羹，益人，甚除風，明目。若渴，可煮汁飲，代茶飲之；發(fā)熱諸毒煩悶，可單煮汁解之，能消熱面毒”[3]。枸杞葉中含有豐富的營養(yǎng)成分，包括蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、多糖、微量元素等。枸杞葉蛋白含量高達14%,高于枸杞子，且無膽固醇，因此極具藥用價值。除此外，枸杞葉中還含有多種人體必需的氨基酸(如蘇氨酸、色氨酸、賴氨酸等)，并含有豐富的維生素(如核黃素、抗壞血酸、硫胺素等)[4]。枸杞葉中還有含量極為豐富的黃酮類化合物。陳瑾等[5]通過乙醇回流的方法從枸杞葉片中得到黃酮提取物，檢測枸杞葉中的黃酮質(zhì)量分數(shù)為347 mg·kg-1。Mohammed等[6]研究了枸杞葉黃酮抗腫瘤活性，通過薄層色譜法從枸杞葉中分離出了蘆丁、槲皮素、山柰酚、木犀草素等黃酮類化合物，并發(fā)現(xiàn)枸杞葉中的黃酮能通過線粒體途徑誘導人肝癌細胞HepG2死亡。本研究中，枸杞芽葉經(jīng)過乙醇回流提取和大孔樹脂分離，純化制得枸杞芽葉高純度有效成分，并經(jīng)鑒定其主要為黃酮類化合物。體外抗氧化活性研究表明，枸杞芽葉高純度有效成分具有很強的抗氧化活性，為進一步開展體內(nèi)藥理活性研究和相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 試藥

無水乙醇(批號：P1668399，上海Titanic科技有限公司)；石油醚(批號：20170720，無錫市亞盛化工有限公司)；乙腈(色譜純，批號：0113200604，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；硝酸鋁(批號：180506495E、乙酸銨(批號：20140422)購于國藥集團化學試劑有限公司；亞硝酸鈉(批號：170503-2)、氫氧化鈉(批號：140929-1)購于廣東汕頭西隴科學股份有限公司；蘆丁對照品(HPLC級，批號：170312，北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司)；HP-20型大孔樹脂(批號：20180122，上海摩速科學器材有限公司)；D101型大孔樹脂(批號：C0046740)、HPD-100型大孔樹脂(批號：C0047823)、AB-8型大孔樹脂(批號：C0046922)、HPD-400型大孔樹脂(批號：C0045637)、HPD-600型大孔樹脂(批號：C0047311)均購自河南鄭州勤實科技有限公司；鐵離子還原抗氧化能力法(FRAP)檢測總抗氧化能力試劑盒(批號：20180316，南京建成生物工程研究所)。

無果枸杞芽葉由寧夏杞芽食品科技有限公司提供，經(jīng)中國藥科大學生藥學張勉教授鑒定為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的葉。

1.2 儀器

XM-150T型高速多功能粉碎機(永康市鑫之鴻電器有限公司)；AF-1型電熱恒溫鼓風干燥箱(江蘇東臺電器廠)；HCJ-4E型磁力攪拌水浴鍋 (常州朗越儀器制造有限公司)；DK-S 26型電熱恒溫水浴鍋(太倉精宏儀器設(shè)備有限公司)；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵[鄭州長城科工貿(mào)有限公司(獅鼎)]；BS 124S型分析天平 (天津市天馬儀器廠)；GL224i-ISCN型電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；752 UV/Vis型紫外-可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)；1100系列高效液相色譜儀、ZORBAX SB-C18型色譜柱、6520型質(zhì)譜儀；冷凍干燥機(無錫市金利大紙塑制品有限公司)；紅外光譜、質(zhì)譜和核磁共振儀(中國藥科大學分析測試中心)。

2 方法2.1 枸杞芽葉粗提液的制備及黃酮提取率分析

將枸杞芽葉用高速多功能粉碎機進行粉碎，采用乙醇提取法制備其提取液。制備流程如下：

2.1.1總黃酮提取率測定 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[7]，取枸杞芽葉粗提液約0.3 g，加入蒸餾水4 mL，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，混勻，放置6 min，其次加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，混勻，放置6 min，再加入10%的氫氧化鈉溶液4.0 mL，最后用蒸餾水定容至10 mL，搖勻，靜置15 min后，用酶標儀于510 nm處掃描。以蘆丁對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標 (X)，吸光度(A)為縱坐標 (Y)，分析得出線性回歸方程。

黃酮質(zhì)量分數(shù)=(黃酮質(zhì)量濃度×稀釋倍數(shù)×提取液體積)/樣品質(zhì)量

(1)

黃酮提取率=黃酮質(zhì)量分數(shù)/1000×100%

(2)

2.1.2單因素試驗 以枸杞芽葉粗提液中總黃酮提取率為指標，考察提取時間 (0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)、提取溫度 (50、60、70、80、90 ℃)、乙醇體積分數(shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50) 4個因素對總黃酮提取率的影響。

2.1.3響應面優(yōu)化試驗 選擇提取時間(A)、提取溫度(B)、乙醇體積分數(shù)(C)、料液比(D)為實驗因素，以枸杞芽葉粗提液中黃酮提取率為響應值，設(shè)計響應面試驗[8]，因素水平見表1。

表1 枸杞芽葉黃酮提取率的響應面分析因素和水平

2.1.4驗證實驗 采用Design-Expert軟件分析，得到枸杞芽葉粗提液的最佳提取工藝，在此條件下，平行重復提取3次，按2.1.1項下方法測定粗提液中黃酮提取率。

2.2 枸杞芽葉高純度有效成分的制備

制備流程如下：

按2.1項下方法得到枸杞芽葉粗提液，采用HP-20型大孔樹脂對其分離提純，考察上樣質(zhì)量濃度(1.006、3.019、6.037、9.056、12.075、15.093、18.112 mg·mL-1)、上樣流速(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL·min-1)、上樣體積、洗脫液(30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇)、洗脫流速(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL·min-1)和洗脫劑用量，6個因素對總黃酮提取率的影響，最終得到最佳優(yōu)化條件。參考2.1.1項下NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法，測定最佳純化工藝得到的枸杞芽葉高純度有效成分中總黃酮的提取率。

2.3 枸杞芽葉高純度有效成分中蘆丁的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

采用HPLC對枸杞芽葉高純度有效成分進行分析，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，色譜柱溫度為30 ℃，樣品盤溫度為4 ℃，檢測波長為360 nm，流動相A為1 mmol·L-1乙酸銨水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫(0～10 min，98%A；10～11 min，91%A；11～20 min，91%A)，進樣體積為5 μL，流速為1.0 mL·min-1。通過HPLC分析，比較蘆丁對照品溶液和樣品溶液的HPLC圖，收集樣品與對照品出峰時間相同的流出液，經(jīng)濃縮和重結(jié)晶純化得到淡黃色粉末。取重結(jié)晶后的樣品適量，通過物理化學性質(zhì)進行初步鑒定，再用質(zhì)譜、紅外光譜及核磁共振等方法對其進行分析，鑒定結(jié)構(gòu)。

2.4 枸杞芽葉高純度有效成分的體外抗氧化活性

采用FRAP，體外檢測高純度有效成分的抗氧化活性[9]。以Trolox溶液和蘆丁溶液為參考標準，Trolox是一種水溶性維生素E，其抗氧化能力與維生素E類似[10]。采用96孔酶標板，分別設(shè)定空白對照孔、Trolox和蘆丁陽性對照孔及樣品檢測孔。按照FRAP試劑盒的操作方法，用移液槍精確取蒸餾水5 μL 于空白孔中，取不同濃度的Trolox溶液和蘆丁溶液5 μL于陽性對照孔中，取不同濃度的樣品溶液5 μL 于檢測孔中，最后每孔加入FRAP工作液180 μL，混勻，于37 ℃放置3～5 min后，用酶標儀于593 nm下檢測各孔A，A越大，表明抗氧化能力越強。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 枸杞芽葉粗提液的制備

3.1.1測定總黃酮提取率 以蘆丁對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標 (X)，A為縱坐標 (Y)，分析得出線性回歸方程為Y=9.59X+0.009，r=0.999 6。

3.1.2單因素試驗 A、B、C、D 4個因素對總黃酮提取率的影響見圖1。由圖1A可知，在0.5～2.0 h，隨著時間的增加，枸杞芽葉粗提液中黃酮的提取率逐漸升高，在2.0 h時，黃酮提取率達到最大，2.0 h后，隨著提取時間的增加，黃酮提取率開始慢慢降低。由圖1B可知，在50～70 ℃，隨著溫度的升高，枸杞芽葉粗提液中黃酮的提取率逐漸升高，在70 ℃時，黃酮提取率達到最大，達到70 ℃后，隨著溫度的升高，黃酮提取率有所下降。由圖1C可知，乙醇體積分數(shù)為50%～70%時，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，枸杞芽葉粗提液中黃酮的提取率逐漸升高，70%時，黃酮提取率達到最大，乙醇體積分數(shù)達到70%后，隨著乙醇體積分數(shù)增大，黃酮提取率不但沒有上升，反而有下降的趨勢。由圖1D可知，在料液比1∶10～1∶30時，隨著料液比的增加，枸杞芽葉粗提液中黃酮提取率逐漸升高，在料液比為1∶30時，黃酮提取率達到最大，之后，黃酮提取率逐漸趨于穩(wěn)定。

3.1.3響應面試驗結(jié)果 響應面試驗方案及其結(jié)果見表2，枸杞芽葉粗提液中黃酮提取率響應面模型方差分析結(jié)果見表3。

以枸杞芽葉粗提液中黃酮提取率(Y)為響應值，對表2中的29組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，得到枸杞芽葉粗提液中黃酮得率對各實驗因素的回歸方程：Y=20.76+0.13A+0.17B+0.38C+0.046D+0.11AD-0.21BC+0.035BD-0.36CD-0.69A2-1.06B2-1.70C2-0.34D2。由表3可知，回歸方程的P<0.000 1，表明所選模型差異有統(tǒng)計學意義；模型的失擬項P=0.833 5>0.05，差異無統(tǒng)計學意義；模型r=0.959 4，表明所選模型擬合度較好。因此，可以用該回歸方程對不同實驗條件下的枸杞芽葉粗提液中黃酮提取率進行預測和分析。此外，模型中一次項C、B差異有統(tǒng)計學意義；二次項中CD差異有統(tǒng)計學意義；交互項差異均有統(tǒng)計學意義。通過回歸系數(shù)檢驗值F可以得出，各實驗因素對枸杞芽葉粗提液中黃酮提取率影響大小順序為：C>B>A>D。

3.1.4最佳條件驗證 響應面優(yōu)化提取枸杞芽葉粗提液中黃酮的最佳條件為提取時間2.25 h、提取溫度75.6 ℃、78%乙醇、料液比1∶31.2。為便于實際操作，將條件調(diào)整為提取時間2.5 h、提取溫度75.0 ℃、78%乙醇、料液比1∶30，在此條件下，平行重復提取3次，計算出枸杞芽葉粗提液中黃酮平均提取率為(19.85±2.87)%，與理論黃酮得率20.79%基本一致，說明該響應面模型合理可靠。

圖1 提取時間、提取溫度、乙醇體積分數(shù)和料液比對黃酮提取率的影響

表2 枸杞芽葉黃酮提取率的響應面試驗方案和結(jié)果

表3 枸杞芽葉粗提液中黃酮提取率響應面模型方差分析結(jié)果

3.2 枸杞芽葉高純度有效成分的制備

上樣濃度(a)、上樣流速(b)、上樣體積(c)、洗脫液(d)、洗脫流速(e)、洗脫劑用量(f) 6個因素對HP-20樹脂吸附性能的影響見圖2。由圖2A可知，在上樣質(zhì)量濃度為1.006～9.056 mg·mL-1時，HP-20型樹脂對枸杞芽葉粗提液的吸附率逐漸升高，上樣質(zhì)量濃度達到9.056 mg·mL-1以后，吸附率趨于平衡。上樣質(zhì)量濃度小，不但吸附率低，而且會增加分離純化的時間，降低工作效率，上樣質(zhì)量濃度過大，容易堵塞柱子，故綜合考慮選用9.056 mg·mL-1為最佳的上樣質(zhì)量濃度。由圖2B可知，在上樣流速為0.5～2.0 mL·min-1時，HP-20型樹脂對枸杞芽葉粗提液的吸附率緩慢降低，上樣流速達到2.0 mL·min-1后，吸附率快速下降。上樣流速過小，會使分離純化周期加長，嚴重影響工作效率，流速過大會降低樹脂的吸附率，造成粗提液的浪費，故綜合考慮選用2.0 mL·min-1為最佳的上樣速度。由圖2C可知，從上樣體積為9 BV起，HP-20樹脂開始出現(xiàn)明顯的泄漏，繼續(xù)增加上樣體積，泄漏越來越厲害，當上樣體積為11 BV時，泄漏液中的黃酮濃度與上樣液中的黃酮濃度接近，表明樹脂已經(jīng)達到吸附飽和。為了避免造成粗提液不必要的損失，控制每克HP-20型樹脂上樣的枸杞芽葉粗提液黃酮含量不超過72.44 mg。由圖2D可知，在洗脫液體積分數(shù)為30%～60%時，HP-20型樹脂對枸杞芽葉粗提液的解吸率逐漸升高，洗脫液體積分數(shù)達到60%以后，解吸率不增反減，故選用60%乙醇為洗脫液。由圖2E可知，在洗脫流速為0.5～3.0 mL·min-1時，HP-20型樹脂對枸杞芽葉粗提液的解吸率緩慢降低，洗脫流速達到3.0 mL·min-1后，解吸率快速下降，故選用3.0 mL·min-1為最佳的洗脫速度。由圖2F可知，隨著乙醇洗脫體積的逐漸加大，流出液中黃酮含量逐漸升高，繼續(xù)增加乙醇洗脫液體積，黃酮含量增加減慢，洗脫液體積達3 BV時，色譜柱上吸附的黃酮已經(jīng)基本被洗脫完全。因此，乙醇洗脫體積選擇3 BV是合理的。

綜上，得到最佳純化枸杞芽葉高純度有效成分的方法：選用HP-20型大孔樹脂，枸杞芽葉粗提液上樣質(zhì)量濃度9.056 mg·mL-1，上樣液流速2.0 mL·min-1，上樣體積8 BV，60%乙醇為洗脫液，洗脫流速3 mL·min-1，洗脫劑用量3 BV。經(jīng)純化工藝后黃酮提取率為(97.19±1.89)%，由3.1.4可知,枸杞芽葉粗提液中黃酮平均提取率為 (19.85±2.87)%，純化后黃酮提取率顯著提高。

注：A.上樣濃度對吸附效果的影響；B.上樣流速對吸附效果的影響；C.HP-20型樹脂的動態(tài)吸附曲線；D.洗脫液濃度對洗脫效果的影響；E.洗脫流速對洗脫效果的影響；F.HP-20型樹脂的動態(tài)解吸曲線。

3.3 枸杞芽葉高純度有效成分中蘆丁的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

采用Agilent 1100系列高效液相色譜儀對蘆丁進行分離純化與制備(圖3)，收集樣品中出峰時間為7.906 min的流出液，經(jīng)濃縮和重結(jié)晶純化得到淡黃色粉末。此物質(zhì)可溶于熱水，易溶于甲醇、乙醇及堿性溶液，不溶于乙醚、石油醚等親脂性有機溶劑，熔點為187～190 ℃，鹽酸-鎂粉反應陽性，Molish反應陽性，表明該化合物為黃酮苷。紅外光譜圖顯示，3 424.8 cm-1強吸收峰為羥基的伸縮振動吸收峰，1 656.0 cm-1為羰基伸縮振動吸收峰，1 601.0、1 506.3、1 456.9 cm-1為苯環(huán)伸縮振動吸收峰，表明分子中含有酚羥基和芳香環(huán)等特征結(jié)構(gòu)基團，與已報道蘆丁的紅外光譜圖相似[7，11]。經(jīng)質(zhì)譜分析表示，ESI-MSm/z：609.2[M-H]-，可以確定化合物的相對分子質(zhì)量為610，其分子式為C27H30O16[12]。將樣品10 mg溶于DMSO中分別進行核磁共振氫譜和碳譜分析，分析值與文獻做對比[13-14]，數(shù)據(jù)基本一致，進一步確定該化合物為蘆丁。其氫譜和碳譜分別見圖4～5，數(shù)據(jù)歸屬見表4。

注：A.0.05 mg·mL-1蘆丁對照品溶液；B.4.0 mg·mL-1枸杞芽葉高純度有效成分。

3.4 枸杞芽葉高純度有效成分的體外抗氧化活性

FRAP檢測總抗氧化的實驗結(jié)果見圖6，結(jié)果表明，與枸杞芽葉粗提液的抗氧化能力相比，枸杞芽葉高純度有效成分的抗氧化能力顯著提高。在相同質(zhì)量濃度條件下，各檢測化合物的總抗氧化活性順序為Trolox>枸杞芽葉高純度有效成分>蘆丁>枸杞芽葉粗提液。

圖4 目標峰的1H-NMR圖譜

圖5 目標峰的13C-NMR圖譜

4 討論

枸杞是經(jīng)典中藥之一，在《詩經(jīng)》《神農(nóng)本草經(jīng)》《藥性論》中經(jīng)常出現(xiàn)。研究結(jié)果表明，枸杞具有多種藥學功效，例如抗氧化、神經(jīng)保護、清除自由基、調(diào)血糖、抗炎等。相對于枸杞子，枸杞葉中的黃酮含量高于枸杞子?，F(xiàn)代藥理學研究表明，黃酮類化合物作為一類重要天然化合物，在化學性、免疫性、藥物性和酒精性肝損傷等方面療效顯著。因此，枸杞葉有效成分將是開發(fā)天然防治肝病藥物的天然藥物資源，亟待加以研究。

本研究通過單因素分析、響應面優(yōu)化等實驗建立枸杞芽葉高純度有效成分的制備方法，明確最佳提取枸杞芽葉高純度有效成分的方法：提取時間2.5 h、提取溫度75.0 ℃、乙醇體積分數(shù)78%、料液比1∶30。最佳純化枸杞芽葉高純度有效成分的方法：枸杞芽葉粗提液上樣質(zhì)量濃度9.056 mg·mL-1，上樣液流速2 mL·min-1，上樣體積8 BV，60%乙醇為洗脫液，洗脫流速為3 mL·min-1，洗脫劑用量為3 BV。經(jīng)過本實驗建立的方法提取獲得的枸杞芽葉粗提液中黃酮質(zhì)量分數(shù)為 (19.85±2.87)%，與理論黃酮得率20.79%基本一致。經(jīng)純化工藝后黃酮質(zhì)量分數(shù)為 (97.19±1.89)%，相比純化前黃酮含量顯著提高。這種枸杞葉高純度有效成分對未來產(chǎn)品的進一步開發(fā)具有重要的指導意義。

表4 目標峰的氫譜、碳譜數(shù)據(jù)對比

圖6 FRAP法檢測樣品的抗氧化活性

本研究利用超高效液相-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀8030 (UPLC-MS/MS 8030) 初步鑒定枸杞芽葉高純度有效成分中含有蘆丁。蘆丁是最具有抗氧化活性的黃酮類化合物。為了對蘆丁進行深入研究，本研究還采用Agilent 1100系列高效液相色譜儀對蘆丁進行分離純化與制備，首次從枸杞葉中分離、純化得到淡黃色晶體，通過物理化學性質(zhì)、質(zhì)譜、紅外光譜及核磁共振等方法確定其為蘆丁。此外，體外抗氧化活性研究表明，枸杞芽葉高純度有效成分具有很強的抗氧化活性，這為進一步開展體內(nèi)藥理活性研究和相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。