Ki-67、p63、bcl-2蛋白在葡萄胎妊娠與水腫性流產(chǎn)中的診斷價(jià)值

李 燁，賀峻祎，祁明美，張友忠，郝春燕**，崔保霞

(1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 a.婦產(chǎn)科;b.病理科，濟(jì)南 250012；2.莒縣人民醫(yī)院病理科，莒縣 276522)

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病是一組臨床上較為罕見的妊娠相關(guān)性疾病。葡萄胎(hydatidiform mole，HM)為最常見的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病，其典型病理組織學(xué)特征為不同程度的滋養(yǎng)細(xì)胞增生和胎盤絨毛水腫[1-4]。根據(jù)病理形態(tài)、遺傳和臨床特征，HM又分為完全性葡萄胎(complete hydatidiform mole，CHM)和部分性葡萄胎(partial hydatidiform mole，PHM)。水腫性流產(chǎn)(hydropic abortion，HA)是一種在組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)上類似于HM的非葡萄胎異常妊娠。CHM進(jìn)展為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(gestational trophoblastic neoplasia，GTN)的風(fēng)險(xiǎn)約為15%～20%，PHM進(jìn)展為GTN的風(fēng)險(xiǎn)約為0.5%～5%[4]，HA繼發(fā)惡變的情況極為罕見，風(fēng)險(xiǎn)約為0.0002%。由于CHM、PHM和HA的臨床管理及預(yù)后不同，在臨床實(shí)踐當(dāng)中準(zhǔn)確地鑒別三者非常重要。隨著超聲診斷技術(shù)的不斷提高及血HCG值的監(jiān)測(cè)，孕周較早的葡萄胎妊娠能夠及時(shí)得以清宮處理。但是對(duì)于早孕期的組織樣本，由于形態(tài)學(xué)上的重疊，單純依靠病理組織學(xué)檢查并不能完全區(qū)分CHM、PHM、HA這三種病變類型[5]。細(xì)胞遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)分子基因分型技術(shù)對(duì)于鑒別三者具有重要意義，但是由于經(jīng)濟(jì)和技術(shù)等方面的原因，使得該方法在臨床使用受限。因此，臨床上需要一種快速、簡(jiǎn)便、低價(jià)的檢測(cè)手段對(duì)葡萄胎各亞型之間、葡萄胎與水腫性流產(chǎn)之間進(jìn)行精準(zhǔn)鑒別。本研究旨在通過免疫組化染色檢測(cè)Bcl-2、p63、Ki-67蛋白在CHM、PHM和HA中的表達(dá)情況，以評(píng)價(jià)它們?cè)阼b別妊娠早期的CHM、PHM和HA中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院病理科2012年1月至2018年6月的妊娠早期(<14周)CHM、PHM與HA樣本共139例。由兩位病理科醫(yī)生分別對(duì)139例樣本重新閱片，剔除形態(tài)學(xué)存在爭(zhēng)議的樣本14例，得到病理組織學(xué)診斷結(jié)果一致的樣本125例。對(duì)125例樣本行p57免疫組化染色,最后篩選出p57陰性的CHM 55例，p57陽性的PHM 29例，p57陽性的HA 40例，剔除1例p57陰性的HA。將最后篩選出的CHM、PHM及HA樣本作為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組。

1.2 主要試劑 鼠單克隆抗體Ki-67(1∶100稀釋，UMAB107)、鼠單克隆抗體抗p57kip2(即用型，Kp10)、通用二步法檢測(cè)試劑盒(PV9000)、DAB底物液(ZLI-9018)及EDTA抗原修復(fù)液(ZIL-9067)購(gòu)自北京中杉金橋公司。兔單克隆抗體抗Bcl-2(即用型，SP66)與鼠單克隆抗體抗p63(即用型，4A4)購(gòu)美國(guó)文塔納醫(yī)療系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色 采用免疫組化PV二步法。組織蠟塊3μm厚連續(xù)切片，將切片置于60℃恒溫箱中烘烤2h，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，置于EDTA抗原修復(fù)液(pH 8.0，1∶49稀釋)高溫高壓修復(fù)抗原3min，自然冷卻至室溫。滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫放置10min，滴加一抗4℃孵育過夜，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。復(fù)溫后，滴加反應(yīng)增強(qiáng)液37℃孵育30min，滴加二抗37℃孵育30min。DAB顯色7～8min，蘇木素復(fù)染，酒精梯度脫水、透明、封片。

1.3.2 結(jié)果評(píng)分 免疫組化染色結(jié)果由兩位醫(yī)師交叉雙盲判定。p57絨毛間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞陽性細(xì)胞百分比>10%為陽性,≤10%為陰性。Ki-67與p63選取絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞著色最密集的部分，高倍鏡(×400)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞百分比(陽性著色細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù))。Bcl-2采用免疫反應(yīng)積分(immunoreactivity score，IRS)來評(píng)分，即著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比的乘積。陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)視野，陽性細(xì)胞百分比<5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。著色強(qiáng)度評(píng)分：不著色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、深褐色為3分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)及Bonferroni校正。受試者工作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲線用于分析3種蛋白在不同實(shí)驗(yàn)組鑒別診斷的預(yù)測(cè)價(jià)值。對(duì)PHM與HA組p63、Ki-67蛋白表達(dá)情況行逐步logistic回歸分析，兩模型ROC曲線下面積的比較采用Mann-Whitney法。數(shù)據(jù)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 p57、Ki-67、p63、Bcl-2蛋白表達(dá)情況

2.1.1 p57表達(dá) p57主要表達(dá)于絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、絨毛間質(zhì)細(xì)胞和中間型滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核，合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核不表達(dá)。p57在PHM與HA的絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中彌漫性表達(dá)，而在CHM的絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)或極少量表達(dá)(圖1A～B)。

2.1.2 Ki-67表達(dá) Ki-67主要表達(dá)于細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞及中間型滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核，合體滋養(yǎng)層細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核極少量表達(dá)(圖1C～D)。Ki-67在HA、PHM、CHM組中的表達(dá)比較，差異顯著(P<0.05)。CHM組中Ki-67蛋白表達(dá)顯著高于PHM組(P<0.017),PHM組中Ki-67蛋白表達(dá)顯著高于HA組(P<0.017)。見表1。

2.1.3 p63表達(dá) p63主要表達(dá)于絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核(圖1E～F)，p63蛋白在HA、PHM、CHM組中的表達(dá)比較，差異顯著(P<0.05)。HA組中p63蛋白表達(dá)顯著高于PHM(P<0.017),而PHM與CHM組中p63蛋白表達(dá)無顯著差異(P>0.017)。見表1。

表1 Ki-67、p63、Bcl-2蛋白在CHM、PHM及HA中的表達(dá)

2.1.4 Bcl-2表達(dá) Bcl-2主要表達(dá)于所有的合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，絨毛間質(zhì)細(xì)胞及蛻膜細(xì)胞不著色(圖1G～H)。Bcl-2蛋白在HA、PHM、CHM組中的表達(dá)差異顯著(P<0.05)。Bcl-2蛋白在HA組的表達(dá)顯著高于PHM組(P<0.017)，而在CHM與PHM組的表達(dá)無顯著差異(P>0.017)。見表1。

2.2 ROC曲線分析

2.2.1 Ki-67用于鑒別CHM與PHM、PHM與HA的ROC曲線分析 ROC曲線分析Ki-67鑒別CHM與PHM的預(yù)測(cè)價(jià)值，Ki-67陽性百分比68.5%為最佳截?cái)嘀?，Ki-67陽性百分比>68.5%診斷CHM，AUC為0.666，95%置信區(qū)間0.533～0.799，敏感度為87.3%，特異性為55.2%，PPV 78.7%，NPV 69.6%，診斷的準(zhǔn)確性較低。ROC曲線分析Ki-67鑒別PHM與HA的預(yù)測(cè)價(jià)值，Ki-67陽性百分比48.5%為最佳截?cái)嘀?，Ki-67陽性百分比<48.5%診斷HA，AUC為0.757，95%置信區(qū)間為0.626～0.888，敏感度為82.5%，特異性為72.4%，PPV 80.5%，NPV 75.0%，診斷具有一定的準(zhǔn)確性。見圖2。

2.2.2 p63用于鑒別PHM與HA的ROC曲線分析 ROC曲線分析p63鑒別PHM與HA的預(yù)測(cè)價(jià)值，p63陽性百分比為83.5%為最佳截?cái)嘀?，p63陽性百分比>83.5%診斷HA，AUC為0.898，95%置信區(qū)間為0.820～0.976，敏感度為95.0%，特異性為79.3%，PPV 86.4%，NPV 92.0%，診斷具有一定的準(zhǔn)確性。見圖2。

2.2.3 Bcl-2用于鑒別PHM與HA的ROC曲線分析 ROC曲線分析Bcl-2鑒別PHM與HA的預(yù)測(cè)價(jià)值，Bcl-2的IRS=8.5為最佳截?cái)嘀?，IRS>8.5診斷HA，AUC為0.680，95%置信區(qū)間為0.552～0.808，敏感度為45.0%，特異性為82.8%，PPV 78.3%，NPV52.2%，診斷的準(zhǔn)確性較低。見圖2。

2.2.4 Ki-67聯(lián)合p63用于鑒別PHM與HA的ROC曲線分析 采用逐步logistic回歸分析構(gòu)建Ki-67聯(lián)合p63鑒別PHM與HA的預(yù)測(cè)模型，同時(shí)獲得該模型的相關(guān)預(yù)測(cè)概率。ROC曲線進(jìn)一步分析此預(yù)測(cè)概率用于鑒別PHM與HA的預(yù)測(cè)價(jià)值，得到AUC為0.934，95%置信區(qū)間為0.868～0.999，敏感度為95.0%，特異性為79.3%，PPV 86.4%，NPV 92.0%，診斷的準(zhǔn)確性較高。Ki-67聯(lián)合p63用于鑒別PHM與HA的AUC(0.934)顯著高于單獨(dú)p63鑒別PHM與HA的AUC(0.898)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 ROC曲線A：Ki-67在鑒別CHM與PHM的ROC曲線；B：Ki-67、p63及bcl-2分別在鑒別PHM與HA的ROC曲線；C：p63聯(lián)合Ki-67與單獨(dú)p63分別在鑒別PHM與HA的ROC曲線

3 討 論

3.1 p57輔助診斷完全性葡萄胎 p57具有印記基因的遺傳特征，通常情況下為父源性等位基因被印跡，母源性等位基因得以表達(dá)。由遺傳學(xué)可知，CHM的基因組主要來自于父方，通常是由1個(gè)空卵受精形成的雙雄二倍體(46，XX或46,XY)。PHM的基因組來源于雙親，通常是由1個(gè)卵子和2個(gè)精子同時(shí)受精形成的孤雌雙雄三倍體(69，XXX，69，XXY，69，XYY)。HA的基因組來源于雙親，是由1個(gè)精子和1個(gè)卵子受精形成的正常二倍體(46，XX或46，XY)。由于CHM不含母源性染色體成分，p57蛋白不表達(dá)，而PHM與HA的基因組均含母源性染色體成分，p57蛋白陽性表達(dá)。因此，p57免疫組化染色可輔助診斷CHM[6]，但是不能鑒別PHM與HA。

3.2 Ki-67在葡萄胎診斷中的研究 Ki-67基因參與了滋養(yǎng)細(xì)胞分化的調(diào)控，其表達(dá)的產(chǎn)物Ki-67蛋白是一種反應(yīng)組織細(xì)胞增生程度的極佳標(biāo)志物。有文獻(xiàn)報(bào)道Ki-67在CHM、PHM與HA的表達(dá)情況，但并未得出一致結(jié)論。Moussa等[7]在運(yùn)用p57染色與DNA倍體分析準(zhǔn)確診斷CHM、PHM、HA的基礎(chǔ)上，對(duì)這三組樣本進(jìn)行Ki-67染色，發(fā)現(xiàn)Ki-67蛋白在HA、PHM與CHM中表達(dá)逐漸增加，CHM表達(dá)顯著高于PHM，PHM表達(dá)顯著高于HA。本研究與Moussa等的研究結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)Ki-67抗原主要免疫定位于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核，CHM組中的Ki-67表達(dá)顯著高于PHM組(P<0.017)，PHM組顯著高于HA組(P<0.017)，診斷PHM與HA的ROC曲線下面積為0.757，具有一定的準(zhǔn)確性。Khooei等[8]研究也證實(shí)了上述結(jié)論。但是，一項(xiàng)大樣本分析[1]發(fā)現(xiàn)，Ki-67蛋白在HA、PHM與CHM中表達(dá)逐漸增加，但CHM與PHM之間，PHM與HA之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不認(rèn)為Ki-67能鑒別診斷PHM與HA。

3.3 p63在葡萄胎診斷中的研究 p63在葡萄胎妊娠中的具體作用機(jī)制，目前還不十分清楚，國(guó)內(nèi)外已有一些文獻(xiàn)研究p63在CHM、PHM與HA鑒別診斷中的作用，但是尚未得出一致結(jié)論。Ramalho等[9]和Masood等[10]通過p63免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的p63著色強(qiáng)度在HM組顯著高于HA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故認(rèn)為p63可作為鑒別HM與HA的輔助診斷方法。Chen等[11]報(bào)道，PHM和HA的p63免疫表達(dá)結(jié)果無顯著差異。Heidarpour等[3]研究發(fā)現(xiàn)，p63的核免疫反應(yīng)性在葡萄胎妊娠高于非葡萄胎妊娠，在PHM組高于CHM組，但是對(duì)于上述鑒別診斷的進(jìn)一步ROC分析結(jié)果卻具有低的敏感度和特異性，因此并不推薦單獨(dú)使用p63來鑒別HM與HA。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p63在HA組大部分為極高表達(dá)，僅有1例樣本為中等程度表達(dá)，表達(dá)顯著高于葡萄胎妊娠組(P<0.017)。本研究結(jié)果顯示，PHM中p63蛋白表達(dá)高于CHM，但無顯著差異(P>0.017)。進(jìn)一步ROC曲線分析p63在診斷PHM與HA的預(yù)測(cè)價(jià)值，得到AUC為0.898，敏感度為95.0%，特異性為79.3%，PPV 86.4%，NPV 92.0%，診斷具有一定的準(zhǔn)確性。因此推薦使用p63作為輔助鑒別PHM與HA的方法之一。

3.4 Bcl-2在葡萄胎診斷中的研究 Bcl-2基因通過抑制細(xì)胞程序性凋亡而緊密參與了胎盤穩(wěn)態(tài)、生長(zhǎng)、重塑等過程。Erol等[2]研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在HA、PHM和CHM中的表達(dá)逐漸減少，HA組Bcl-2表達(dá)顯著高于PHM組，PHM組顯著高于CHM組。因此，Erol等認(rèn)為Bcl-2可作為一種相對(duì)可靠、經(jīng)濟(jì)且高效的輔助診斷方法來鑒別CHM、PHM和HA。但最近一項(xiàng)大樣本研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在HA、PHM與CHM中的表達(dá)逐漸增加，與Erol等結(jié)果完全相反[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白在HA、PHM與CHM的絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)逐漸減少；Bcl-2蛋白的表達(dá)在PHM與HA之間差異顯著(P<0.017)，但在CHM與PHM組之間無顯著差異(P>0.017)。進(jìn)一步的ROC曲線分析Bcl-2在鑒別PHM與HA中的預(yù)測(cè)價(jià)值，AUC為0.680，診斷的準(zhǔn)確性較低。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白在3組的合體滋養(yǎng)細(xì)胞中幾乎均呈陽性表達(dá)，3組的Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞百分比無明顯差別(P>0.05)，差別主要表現(xiàn)在Bcl-2著色強(qiáng)度不同(P<0.05)?？紤]到僅憑Bcl-2著色強(qiáng)度差異輔助鑒別PHM與HA，受觀察者的主觀影響較大，并且Bcl-2用于診斷的準(zhǔn)確性較低，所以不推薦使用Bcl-2來鑒別診斷PHM與HA。

3.5 p63聯(lián)合Ki-67對(duì)于PHM與HA的鑒別診斷價(jià)值 在臨床實(shí)踐當(dāng)中，對(duì)于PHM與HA的診斷，除了分子基因分型之外，目前尚無較為特異的輔助鑒別方法，仍需進(jìn)一步探究。本研究結(jié)果顯示，Ki-67、p63用于鑒別PHM與HA具有一定的準(zhǔn)確性，而Bcl-2用于鑒別PHM與HA的準(zhǔn)確性較低，臨床應(yīng)用價(jià)值有限。本結(jié)果表明，相比于Ki-67染色，p63染色能以更高的準(zhǔn)確性將PHM與HA鑒別開(p63/Ki-67的AUC、敏感度、特異性、PPV、NPV分別為：0.898/0.757，95.0%/82.5%，79.3%/72.4%，86.4%/80.5%，92.0%/75.0%)；聯(lián)合Ki-67與p63染色組與單獨(dú)p63染色組在敏感度、特異性、PPV及NPV方面結(jié)果完全相同，但是Ki-67聯(lián)合p63組的AUC(0.934)顯著高于單獨(dú)p63組的AUC(0.898),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，對(duì)于PHM與HA的鑒別診斷，聯(lián)合使用Ki-67與p63比單獨(dú)使用p63或單獨(dú)使用Ki-67具有更高的準(zhǔn)確性及應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，在無分子基因檢測(cè)設(shè)備或患者因價(jià)格昂貴、耗時(shí)等原因不愿意接受分子基因檢測(cè)情況下，對(duì)于葡萄胎妊娠與水腫性流產(chǎn)的診斷，臨床上可結(jié)合病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與p57免疫組化染色輔助診斷CHM，同時(shí)加用Ki-67與p63免疫染色輔助鑒別PHM與HA。