表觀遺傳學(xué)在過敏性紫癜中的應(yīng)用現(xiàn)狀及中醫(yī)藥研究思考*

蔡明陽，蘇杭，張博，李盼盼，任獻(xiàn)青

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

過敏性紫癜（henoch-schonlein purpura，HSP）是一種以全身小血管炎為主要病變的系統(tǒng)性血管炎［1］，以皮膚對稱部位出現(xiàn)紫癜，或可伴有腹痛、關(guān)節(jié)腫痛為特點，易反復(fù)發(fā)作，遷延難愈［2］。中醫(yī)學(xué)根據(jù)臨床表現(xiàn)，將其命名為“肌衄”“斑毒”“紫癜風(fēng)”“葡萄疫”。如“皮膚出血曰肌衄”（《證治針經(jīng)·吐血》），“夫小兒斑毒之病者……狀如蚊蚤所嚙，赤斑遍體?！保ā短绞セ莘健ぶ涡喊忒徶T方》）。近年來，本病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢［3］，目前認(rèn)為該病發(fā)病率的升高與飲食結(jié)構(gòu)的改變、環(huán)境污染的加重有著密不可分的關(guān)系，且有報道稱HSP的反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致腎臟損傷［4］。研究表明，中醫(yī)藥辨證施治對于HSP臨床癥狀的緩解、復(fù)發(fā)率的降低以及腎臟損傷概率的減少等方面有較大的優(yōu)勢［5-6］。

目前HSP的發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，但近年來，越來越多的研究表明，表觀遺傳機(jī)制參與HSP的發(fā)病。本文擬總結(jié)表觀遺傳學(xué)修飾包括DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA調(diào)控在HSP中最新的研究進(jìn)展，并分析這些表觀修飾在中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中的應(yīng)用，以期為完善HSP的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供思路，為HSP的中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供研究方向。

1 表觀遺傳學(xué)概述

Conrad Waddington于1939年提出表觀遺傳學(xué)（epigenetics），并于1942年首先將其定義為研究生物發(fā)育機(jī)制的學(xué)科［7］。隨著生命科學(xué)研究的發(fā)展，基因組學(xué)所不能解釋的問題日益增多。作為新興學(xué)科，表觀遺傳學(xué)為生命科學(xué)研究提供了新的思路并不斷推動其發(fā)展。目前普遍認(rèn)為，表觀遺傳學(xué)是在基因組DNA序列不發(fā)生變化的條件下所發(fā)生的基因表達(dá)改變，導(dǎo)致可遺傳的表現(xiàn)型變化，是不涉及DNA序列改變的影響基因表達(dá)和調(diào)控的可遺傳修飾，該修飾受到遺傳及外界因素的調(diào)控。表觀遺傳調(diào)控在生物體細(xì)胞的生長分化及凋亡中發(fā)揮著重要的作用，因其可受外界因素的調(diào)控，正常的表觀遺傳狀態(tài)會發(fā)生改變，在某些疾病中發(fā)揮重要作用，故現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于探究某些疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制［8-13］。

2 表觀調(diào)控在過敏性紫癜中的研究進(jìn)展

作為最常見的系統(tǒng)性血管炎之一，迄今為止HSP的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，可能涉及體液免疫紊亂、T細(xì)胞亞群功能失調(diào)、細(xì)胞因子分泌異常、凝血與纖溶機(jī)制紊亂等多方面［14］，其中異常糖基化IgA1介導(dǎo)的異常免疫是其公認(rèn)的主要發(fā)病機(jī)制［15］。然而近年來越來越多的研究顯示，表觀遺傳學(xué)參與HSP的發(fā)病機(jī)制。

2.1 DNA甲基化與HSP作為表觀遺傳機(jī)制中最早被發(fā)現(xiàn)與基因沉默相關(guān)的表觀修飾方法之一［16］，DNA甲基化不僅起調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，對于染色體維持穩(wěn)定同樣發(fā)揮了重要的作用。DNA甲基化受到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和甲基化結(jié)合蛋白的調(diào)控，通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)和基因組的完整性，進(jìn)而影響細(xì)胞的功能［17-18］。隨著對甲基化研究的增多，DNA的異常甲基化現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)在越來越多的疾病中起關(guān)鍵作用［19-21］。

大量研究顯示，外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）在HSP的發(fā)病過程中發(fā)揮了十分重要的作用［22-24］。馬樂［25］發(fā)現(xiàn)全基因組DNA的廣泛高甲基化，可導(dǎo)致某些基因的異常表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致HSP發(fā)生。同時也發(fā)現(xiàn)HSP患兒PBMCs中白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2RG啟動子區(qū)域甲基化水平顯著低于對照組，相應(yīng)的IL-2RG的mRNA表達(dá)量明顯高于對照組，提示IL-2RG啟動子區(qū)域的低甲基化可能參與疾病的發(fā)生發(fā)展。IL-2RG是IL-2受體的γ鏈，與IL-2受體的β鏈共同構(gòu)成具有功能活性的IL-2R，當(dāng)其與IL-2結(jié)合時，可激活多條不同信號通路發(fā)揮作用［26］，若IL-2與Teffs表面IL-2R結(jié)合，則可激活Teffs并誘導(dǎo)其表達(dá)，加強(qiáng)Teffs的殺傷作用，即免疫激活；IL-2與Tregs表面IL-2R結(jié)合，則是維持Tregs細(xì)胞存活及發(fā)揮作用的必要條件，即維持免疫耐受［27］。

另有研究發(fā)現(xiàn)，HSP患兒外周血中細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子SOCS1和SOCS3的基因甲基化程度較健康對照組升高［28］。SOCS是由細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的信號通路中非常重要的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，其中SOCS1和SOCS3對T淋巴細(xì)胞的發(fā)育、分化有著重要的調(diào)節(jié)作用［29-30］。相較于健康組兒童，HSP患兒的SOCS1和SOCS3基因處于相對的高甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致其表達(dá)的相對不足，進(jìn)而影響IL-6/STAT3負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路，抑制Foxp3的表達(dá)，降低Treg細(xì)胞分化，從而導(dǎo)致Th17/Treg細(xì)胞失衡，參與HSP的發(fā)生。

以上研究均說明DNA甲基化程度的改變，可通過影響細(xì)胞因子進(jìn)而參與HSP的發(fā)生發(fā)展。

2.2 組蛋白修飾與HSP組蛋白是哺乳動物基因組中染色體核小體的重要組成部分，擁有一個含有多個殘基的氨基酸尾部，其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有利于細(xì)胞正常的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄［31］。組蛋白修飾就是在其殘基上發(fā)生的翻譯后修飾，常見的修飾方式有甲基化、乙?；土姿峄?2-34］。組蛋白修飾以乙?；顬槌Ｒ?，該過程是由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferases，HATs）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）二者共同催化完成，以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。修飾后的組蛋白與DNA雙鏈的親和性發(fā)生改變，導(dǎo)致染色質(zhì)的疏松或凝結(jié)狀態(tài)發(fā)生相應(yīng)的改變，或通過影響其他轉(zhuǎn)錄因子與對應(yīng)基因啟動子的親和性發(fā)揮調(diào)控作用。

目前基于組蛋白修飾的研究主要集中于乙?；c甲基化，其他組蛋白修飾如泛素化、脫氨基、羰基化等在其他疾?。?5-37］中均有報道，但卻鮮有與HSP相關(guān)的報道。

Luo等［38］通過研究發(fā)現(xiàn)，在HSP患者PBMCs中，H3的乙酰化與H3K4甲基化在全基因組范圍內(nèi)的增加，并且與疾病的活動呈正相關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)在HSP患者CD4+T細(xì)胞中，IL-4的啟動子區(qū)和兩個IL-4位點調(diào)控區(qū)，即DNaseⅠ超敏位點（hypersensitive site，HSS）和第二內(nèi)含子的DNaseⅠ-超敏位點2（HS2），均呈現(xiàn)出H3的乙酰化水平和H3K4的甲基化水平顯著升高。而研究表明，HSS和HS2在IL-4表達(dá)的調(diào)控中起著重要的作用，其中HS2作為一種嚴(yán)格受GATA-3結(jié)合控制的關(guān)鍵增強(qiáng)子，其缺乏可影響IL-4位點H3的三甲基化和H3在Lys9和Lys14的乙?；?，特異性地導(dǎo)致IL-4的生成受損，對其他TH2細(xì)胞因子無反應(yīng)［39-40］。以上結(jié)果說明HSP患者PBMCs中的組蛋白異常修飾可導(dǎo)致特異性轉(zhuǎn)錄因子失衡，而這種失衡所引起的Th1/Th2失衡可能是HSP發(fā)生發(fā)展的原因。

2.3 miRNA調(diào)控與HSP非編碼RNA（ncRNA），是不直接轉(zhuǎn)錄編碼蛋白質(zhì)的RNA，這些RNA雖然不直接編碼蛋白質(zhì)，卻參與了蛋白質(zhì)翻譯過程［41］。研究表明，在已完成測序的人類基因組中，ncRNA占88.5%，僅有1.5%RNA編碼蛋白質(zhì)［42］。ncRNA大多在蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄過程中及轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮其調(diào)控作用。作為ncRNA的一員，miRNA近年來因其與疾病發(fā)生的密切相關(guān)性［43-45］，具有較高的分子穩(wěn)定性，越來越受到人們的重視，以期用于疾病的早期診斷中。

越來越多的研究表明，miRNA在HSP的發(fā)病過程中發(fā)揮作用。曾輝等［46］利用miRNA基因芯片技術(shù)檢測HSP患兒與健康兒童外周血中miRNA表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)較正常兒童，HSP患兒外周血中miRNA上調(diào)16個，下調(diào)12個，其中上調(diào)倍數(shù)最大的是miR-122，下調(diào)倍數(shù)最大的為miR-149。亦有研究表明，在HSP患者受影響皮膚組織中，miR-146a-5p和miR-148b-3p的表達(dá)降低［47］。有12個miRNAs表達(dá)水平顯著增加，其中表達(dá)增高的miRNAs有：let-7a，為健康對照組的15.1倍，miR-223-3p，為健康對照組的17.8倍，miR-21-3p，為健康對照組的25.1倍。miR-146a-5p、miR203-3p和miR-223-3p的相對表達(dá)水平與粒細(xì)胞浸潤和纖維蛋白樣壞死強(qiáng)度的相關(guān)性最高，其中miR-223-3p是唯一一個表達(dá)水平與粒細(xì)胞浸潤和纖維蛋白樣壞死血管平均數(shù)呈顯著正相關(guān)的miRNA，且其表達(dá)隨著組織病理學(xué)評分的增加而增加。

2.3.1 miR-223-3p與HSPmiR-223-3p在中性粒細(xì)胞中的大量表達(dá)［48］，提示其過度表達(dá)可能與中性粒細(xì)胞在受累皮膚中增加有關(guān)。另外miR-223-3p通過參與NF-κB-IL-6-STAT3途徑介導(dǎo)血管炎癥，通過PPARα以調(diào)節(jié)IL-6表達(dá)以及高度特異性調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞成熟和衰老等［49-52］。

2.3.2 miR-146a-5p與HSPmiR-146a-5p作為天然免疫過程的重要調(diào)節(jié)因子，主要通過阻斷TLR-核因子κB（NF-κB信號通路）發(fā)揮作用，對TNF-a、IL-1b、IL-6和IL-8的表達(dá)產(chǎn)生抑制［53］，這些細(xì)胞因子在HSP患者血液中的表達(dá)明顯高于健康人［54］。在HSP患者受累皮膚組織中，miR-146a-5p與粒細(xì)胞浸潤和纖維蛋白樣壞死程度呈顯著負(fù)相關(guān)，提示miR-146a-5p通過影響NF-κB通路參與HSP發(fā)病的可能性。

2.3.3 miR-203與HSPmiR-203在皮膚中的表達(dá)水平高于其他器官，在皮膚愈合過程中起著重要作用［55］，并且可通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)IL-6的表達(dá)［56］，并且參與了銀屑病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病等自身免疫病的免疫改變［56-57］。故miR203-3p可能同樣參與了HSP的免疫紊亂過程。

2.3.4 let-7a與HSPlet-7家族可調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的激活［58］，且參與了狼瘡腎［59］及IgA腎病［60］的發(fā)病，其中l(wèi)et-7a參與了NF-κB信號通路及血管生成信號通路，并且在細(xì)胞凋亡中起重要作用［61］。

此外，let-7b被證實為IgA1糖基化過程的調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶2的表達(dá)［60］。IgA1的O-糖基化缺陷形成的低糖基化IgA1是HSP發(fā)病的關(guān)鍵因素［62］，而N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶2作為關(guān)鍵酶調(diào)控催化IgA1的糖基化過程的第一階段，故let-7b可通過調(diào)節(jié)N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶2的表達(dá)影響IgA1的糖基化過程，進(jìn)而參與HSP的發(fā)病。

2.3.5 miR-148b與HSPmiR-148b同樣通過調(diào)節(jié)β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)影響IgA1的糖基化過程，被證實為IgA1糖基化過程的調(diào)控因子［60］，miR-148b-3p在HSP患者受累皮膚組織中的顯著表達(dá)不足，使3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)不足，進(jìn)而導(dǎo)致IgA1的O-糖基化缺陷，促使HSP發(fā)病，同時還可能與miR-148/miR152家族成員在先天性免疫應(yīng)答中負(fù)性調(diào)節(jié)作用［63］相關(guān)。

3 表觀遺傳學(xué)與中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究

隨著國家在世界范圍內(nèi)大力推廣中醫(yī)藥，中醫(yī)證候標(biāo)準(zhǔn)化研究以及中醫(yī)藥療法作用機(jī)制的現(xiàn)代化研究變得越發(fā)重要。然而由于缺乏統(tǒng)一的客觀標(biāo)準(zhǔn)及充足的數(shù)據(jù)支持，中醫(yī)藥的標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化研究進(jìn)展緩慢。各個證型所歸納的內(nèi)容、理論的特點及適用的范圍均不完全相同，各有特點，較難單獨理解和應(yīng)用，無疑加大了中醫(yī)證型數(shù)據(jù)挖掘的難度［64-66］，而中藥的療效已被證明不是單味藥物作用的疊加，而是以組方為單位發(fā)揮作用，其中加減變化無疑加大了中醫(yī)藥療法作用機(jī)制的現(xiàn)代化研究的難度。隨著表觀遺傳學(xué)的出現(xiàn)及其研究方法的成熟，其越來越多被應(yīng)用于中醫(yī)藥的標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化研究，并取得了初步成果。

3.1 表觀遺傳學(xué)與中醫(yī)證型的標(biāo)準(zhǔn)化研究“證”是中醫(yī)診療的入手點與立足點，是中國古代醫(yī)家在長期實踐中，對大量有序穩(wěn)定聯(lián)系的癥狀進(jìn)行歸納闡釋，而形成的一種不同于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)疾病診斷的癥狀群模型。隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等新興學(xué)科的出現(xiàn)，中醫(yī)證型物質(zhì)基礎(chǔ)研究進(jìn)入組學(xué)時代，但其研究方法仍具有局限性，所得結(jié)果較為片面、單一，無法突出中醫(yī)證型的整體性、動態(tài)性以及特異性等特點。因此表觀遺傳學(xué)越來越多被應(yīng)用于中醫(yī)證型的標(biāo)準(zhǔn)化研究，并取得了初步成果。

劉亞飛等［67］通過構(gòu)建大鼠模型探究風(fēng)寒濕對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎證屬風(fēng)寒濕者DNA甲基化及組蛋白修飾的影響，得出風(fēng)寒濕病證組PBMCs中DNA甲基化水平顯著下降，而在組蛋白修飾方面，觀察組PBMCs中組蛋白H3乙酰化水平較對照組有所升高的結(jié)論，提示風(fēng)寒濕的外界因素可能通過影響機(jī)體的表觀遺傳修飾，進(jìn)而誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病。張紹杰［68］通過高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)狼瘡性腎炎患者中hsa-miR-127-3p及hsa-miR-4497在脾腎陽虛證型中的表達(dá)顯著增高，對其輔助診斷及辨證有一定的意義。李峻等［69］則通過實驗發(fā)現(xiàn)，在慢性再生障礙性貧血患者中，證屬腎陰虛、腎陰陽兩虛者miRNA-155-5p與miRNA-1260b的表達(dá)水平較證屬腎陽虛者明顯升高且具有更明顯的細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)，提示miRNA-155-5p與miRNA-1260b的表達(dá)對于其辨證有意義。

3.2 表觀遺傳學(xué)與中醫(yī)藥作用機(jī)制的研究除了研究中醫(yī)證型標(biāo)準(zhǔn)化的物質(zhì)基礎(chǔ)，因表觀遺傳調(diào)控可受外界因素的影響而發(fā)生改變，亦應(yīng)用于中醫(yī)藥作用機(jī)制的研究。許鳴等［70］發(fā)現(xiàn)以扶正、祛邪為治則應(yīng)用中藥治療后，骨髓增生異常綜合征患者BMMNCs中的HDAC1 miRNA及蛋白水平顯著下調(diào)，GATA-1 miRNA及蛋白水平升高，提示以扶正、祛邪為治則應(yīng)用中藥治療，可通過調(diào)控組蛋白乙?；教岣呒t系轉(zhuǎn)錄水平，從而改善紅系增殖。陳漢裕［71］則發(fā)現(xiàn)慢性心功能衰竭患者經(jīng)益氣養(yǎng)陰活血利水法辨證施治后，hsa-miR-27b-3p等12個miRNA表達(dá)趨勢上調(diào)，影響DNA模板化、蛋白質(zhì)和ATP結(jié)合等重要生命過程。

4 總結(jié)與展望

遺傳因素與環(huán)境因素在HSP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了相當(dāng)重要的作用，而這正是表觀遺傳調(diào)控的特點，受控于遺傳因素的同時還受環(huán)境因素的影響。并且由于表觀遺傳修飾通常為可逆性改變，這為中醫(yī)藥治療HSP從干預(yù)異常表觀遺傳修飾以糾正病理狀態(tài)，從而治療疾病方面闡釋其作用機(jī)理提供了可能性。表觀遺傳學(xué)在中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究方面的應(yīng)用，為中醫(yī)藥辨證施治的客觀化提供了理論依據(jù)，有利于中醫(yī)藥在世界范圍內(nèi)的推廣。

近年來，有許多學(xué)者嘗試從DNA甲基化、組蛋白修飾、miRNA等方面闡明表觀遺傳修飾與HSP發(fā)病及其病理過程的關(guān)系，對于HSP的表觀遺傳調(diào)控分子機(jī)制有了一定的了解。在HSP的表觀遺傳調(diào)控相關(guān)研究中，miRNA的相關(guān)研究最為突出，組蛋白修飾及DNA甲基化修飾的研究相對較少。通過對明顯異常表達(dá)miRNA進(jìn)行分析，不難發(fā)現(xiàn)，大多異常表達(dá)的miRNA通過直接或間接調(diào)控NF-κB信號通路或調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡進(jìn)而發(fā)揮作用。表觀遺傳修飾在HSP中的異常表達(dá)，提示其可作為HSP發(fā)病、消化道及腎臟損傷風(fēng)險的潛在生物標(biāo)志物。但目前，雖然表觀遺傳學(xué)在HSP的發(fā)病機(jī)制研究中取得了一定成果，發(fā)現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控參與了HSP的病理生理過程，但是仍處于較初級階段，不足以完全明確表觀遺傳修飾在HSP發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。并且表觀遺傳機(jī)制之間的交互作用機(jī)制與途徑尚不明確。

目前基于組蛋白修飾及DNA甲基化修飾的HSP相關(guān)研究相對較少，通過對上述兩方面進(jìn)一步的研究，或許可以將組蛋白-DNA甲基化-miRNA的表觀遺傳調(diào)控整合在一起，將轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾途徑聯(lián)系起來，進(jìn)而結(jié)合HSP表觀遺傳調(diào)控的下游蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)，構(gòu)建完整的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。并且以表觀遺傳修飾為說理工具，客觀闡釋中醫(yī)藥辨證施治在HSP治療方面的優(yōu)勢。高通量測序技術(shù)的發(fā)展及新技術(shù)的出現(xiàn)，必將為HSP及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制研究以及利用中醫(yī)藥治療難治性HSP、預(yù)防腎臟損傷帶來新的思路。