噬菌體對奶牛乳房炎主要致病菌生物被膜防控的研究進展

宋軍，阮紅日 綜述，武瑞 審校

黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院黑龍江省牛病防制重點實驗室,黑龍江大慶163319

奶牛乳房炎(bovine mastitis)在世界范圍內(nèi)發(fā)病率很高,是奶牛養(yǎng)殖業(yè)最常見的疾病之一,也是危害奶牛生產(chǎn)最嚴重的一種疾病,會導致奶牛產(chǎn)奶量下降,牛奶品質(zhì)降低,給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失［1］。因此,有效防治奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展亟待解決的問題。有調(diào)查發(fā)現(xiàn),臨床徹底治愈奶牛乳房炎十分困難,總是反復發(fā)作,目前最有說服力的觀點是乳腺組織內(nèi)存在細菌生物被膜(biofilm,BF)結構,且已有報道證明,BF 是奶牛乳房炎重要的致病因素之一［2］。使用抗生素雖然可以減少生物被膜中的細菌數(shù)量,但并不能徹底根除生物被膜,因此,急需一種可有效防控細菌BF 的方法。

噬菌體是一種能感染細菌的病毒,是地球上最豐富的“生物物種”,因其特異性強、毒副作用小、來源廣泛等特點被認為是抗生素的一種替代品［3］,目前已廣泛應用于醫(yī)學、水產(chǎn)、畜禽養(yǎng)殖等鄰域。本文對噬菌體防控奶牛乳房炎的相關應用研究進展作一簡要綜述,并對噬菌體及其裂解酶防控奶牛乳房炎主要致病菌BF 的可行性進行分析,旨在為臨床奶牛乳房炎的防治提供新的思路。

1 細菌BF 的生物學意義

BF 是指細菌黏附于物體表面,分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等將其自身包繞其中而形成的膜樣結構［4］。在自然界、工業(yè)和醫(yī)學環(huán)境中,細菌主要以該種方式生存。有研究顯示,與浮游形式相比,BF 內(nèi)的細菌對抗生素的抵御能力提高了10 ～1 000倍［5］。且當膜內(nèi)細菌達到一定密度時,就會觸發(fā)一種機制來降解細胞外基質(zhì),使膜內(nèi)細菌分散定植到其他位置,重新啟動BF 的發(fā)育,進而增強細菌侵襲力［6］。

自 1987 年 COSTERTON 等［7］首次描述了 BF與疾病的關系后,BF 相關感染備受關注,目前已證實,表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(多種類型的醫(yī)院感染)、大腸埃希菌(細菌性前列腺炎、膽道感染)和鏈球菌(齲齒、牙周炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、肺炎)等形成的BF 均可引起慢性感染［8］。而這其中的多種細菌也是奶牛乳房炎的主要致病菌,因此,奶牛乳房炎反復的問題很可能與病原菌形成BF 有關。

2 乳腺組織內(nèi)形成BF 的危害

奶牛乳房炎是指因微生物感染或理化因素刺激所導致的炎癥反應,是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中危害最大、投入最多、防治最難的一種疾病。臨床上奶牛乳房炎的治療幾乎均是根據(jù)藥物敏感檢測結果作為用藥的參考指標,但治療效果往往不理想,很多時候只是控制了臨床癥狀,而乳房的健康狀況未得到改善,停藥后各種臨床癥狀又紛紛表現(xiàn)出來。有研究發(fā)現(xiàn),如第1次治療不能徹底治愈,乳房炎的復發(fā)風險將會大大提高,這與乳腺組織內(nèi)細菌BF 密切相關［9］。COSTA等［10］發(fā)現(xiàn),臨床常用于治療奶牛乳房炎的沙星類藥物在亞抑菌濃度促進了乳房炎大腸埃希菌分離株BF 的形成。因此,許多研究人員將奶牛乳房炎復發(fā)歸因于這種耐藥機制。此外,標準化藥物敏感性檢測通常是用浮游細菌進行測試,而未考慮BF 對抗菌藥物的耐受性［11］,因此,目前的治療方法往往無法徹底治愈奶牛乳房炎,還會導致奶牛乳房炎反復發(fā)作。GOMES 等［12］對多種細菌BF 與奶牛乳房炎的關系進行了較系統(tǒng)的概述,認為BF 會增強細菌耐藥性和致病性,導致乳房炎反復發(fā)作,難以治愈,因此,有效防治細菌BF 對于治療奶牛乳房炎至關重要。

3 噬菌體及裂解酶防控奶牛乳房炎主要致病菌BF的可行性分析

噬菌體能夠感染并裂解細菌細胞,根據(jù)噬菌體與宿主細胞之間的關系可將噬菌體分為裂解性噬菌體和溶源性噬菌體兩類,目前用于控制BF 的主要是裂解性噬菌體。裂解性噬菌體在感染細菌后會在細胞內(nèi)復制,然后在細胞裂解后釋放子代噬菌體,繼續(xù)感染其他細菌細胞,是一種可自我復制的抗菌生物制劑。噬菌體治療奶牛乳房炎的療效早已被證實,SHUKLA 等［13］應用裂解性噬菌體治療了 12 頭經(jīng)抗菌藥物治療無效的奶牛乳房炎病牛,12 頭奶牛中10 頭痊愈,認為噬菌體療法更加經(jīng)濟高效。在國內(nèi)也有類似的實驗研究,孫利利等［14］從污水中分離出一株噬菌體,該噬菌體在體外可快速降低細菌濃度,為了進一步評價噬菌體對奶牛乳房炎的治療效果,通過乳頭管注入患病乳區(qū),結果顯示,經(jīng)過2 ～5次治療,大部分患牛被治愈。此外還有研究顯示,噬菌體不僅對耐藥細菌保持著高度的裂解活性,對其產(chǎn)生的BF 也有著很好的抑制和清除效果［15］,因此,噬菌體療法極有望成為防治奶牛乳房炎的替代或補充療法。

3.1 噬菌體防控奶牛乳房炎主要致病菌BF 與浮游細菌相比,BF 內(nèi)的細菌更難清除,而噬菌體可通過裂解BF 內(nèi)細菌,破壞BF 的穩(wěn)定性,是一種較為理想的清除方法［16］。KELLY 等［17］發(fā)現(xiàn),噬菌體 K與其產(chǎn)生的酶混合后,可呈時間依賴性的方式去除聚苯乙烯板表面的 BF；之后,ALVES 等［18］用噬菌體K 與噬菌體DRA88 的混合物處理葡萄球菌形成的BF,在37 ℃下處理48 h 可完全除去聚苯乙烯板表面成熟 BF 結構；以類似的方式,GUTIéRREZ 等［19］和KHALIFA 等［15］在實驗中用其他類型的噬菌體也清除了聚苯乙烯板表面成熟的BF。此外,MORRIS等［20］利用患者感染處分離的金黃色葡萄球菌在鈦柱支架表面培養(yǎng)BF,用頭孢唑林和噬菌體雞尾酒分別處理,發(fā)現(xiàn)噬菌體雞尾酒處理48 h 后,BF 厚度及面積明顯減少,而頭孢唑林處理48 h 后的BF 未見改變,表明噬菌體對細菌BF 可能有更好的防治效果。但噬菌體療法的安全性常倍受質(zhì)疑,KOEN 等［21］通過小鼠乳腺炎模型評估噬菌體在體內(nèi)的治療效果,結果表明,噬菌體療法可安全有效地減少乳腺內(nèi)細菌數(shù)量,證明了噬菌體療法在體內(nèi)的安全性,認為噬菌體是一種最具發(fā)展前景的抗生素替代品。GENG等［22］同樣采用小鼠乳腺炎模型評估噬菌體在體內(nèi)的治療效果,結果與KOEN 等［21］的研究相似,認為噬菌體療法是治療奶牛乳腺炎安全有效的替代療法之一。因此,噬菌體療法在防控細菌BF 無論是安全性還是有效性方面均是可行的。

3.2 噬菌體裂解酶防控奶牛乳房炎主要致病菌BF隨著噬菌體研究的不斷深入,部分研究者從對噬菌體的研究逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檠芯渴删w的有效成分,發(fā)現(xiàn)噬菌體產(chǎn)生的裂解酶能有效抑制細菌BF 的形成,并清除已形成的BF,還能穿透BF 裂解成膜細菌［23-25］。SINGH 等［26］通過實驗證明,噬菌體內(nèi)溶素Ply187可有效減少金黃色葡萄球菌BF 含量和浮游細菌的數(shù)量,且不會使細菌出現(xiàn)耐藥性。ZHANG 等［27］應用噬菌體裂解酶LysGH15 清除多種不同葡萄球菌屬BF,還證明了裂解酶LysGH15 對表皮葡萄球菌引起的菌血癥小鼠模型具有很好的治療效果,表明裂解酶LysGH15 具有治療葡萄球菌感染相關感染的應用價值。FENTON 等［28］發(fā)現(xiàn),利用噬菌體衍生肽酶(CHAPK)可中斷金黃色葡萄球菌BF 的形成,并可在4 h 內(nèi)完全消除金黃色葡萄球菌已形成的BF,證實CHAPK 具有預防和治療金黃色葡萄球菌感染的潛力。LU 等［29］設計了一種T7 噬菌體編碼的解聚酶,利用其裂解能力和酶活性顯著提高了噬菌體清除細菌細胞以及BF 的效率。NANNA 等［30］研究發(fā)現(xiàn),多糖解聚酶DA7 和細菌內(nèi)溶素LysK 均是金黃色葡萄球菌的強效生物被膜清除藥物,且兩者聯(lián)合使用時對生物被膜的清除具有協(xié)同作用。因此,噬菌體裂解酶不僅能夠清除BF,還可抑制BF 形成,是防治BF 相關感染的重要工具。

3.3 聯(lián)合其他抗菌藥物防控奶牛乳房炎主要致病菌BF 噬菌體及其裂解酶均有較強的BF 降解能力,能夠清除附著在固體表面、介質(zhì)表面形成的BF,當與抗生素或其他抗菌藥物聯(lián)合應用時,可加強對BF 的清除及抑制作用。CHAUDHRY 等［31］研究發(fā)現(xiàn),噬菌體與多種抗生素,如頭孢他啶、環(huán)丙沙星等具有協(xié)同清除BF 的效果,但與妥布霉素這類抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素之間的協(xié)同效果不明顯。ZHANG等［32］通過激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡觀察顯示,噬菌體聯(lián)合含氯消毒劑清除BF 的能力優(yōu)于單獨應用噬菌體或含氯消毒劑對BF 的清除,可較大程度地降低膜內(nèi)細胞密度和活力。KAUR 等［33］在實驗中發(fā)現(xiàn),二價鈷離子如CoSO4 和噬菌體聯(lián)合使用能阻止細菌BF 的形成。因此,噬菌體制劑不僅可單獨應用于防治細菌BF,還可與其他抗菌成分聯(lián)合應用。

綜上所述,噬菌體不僅對耐藥浮游細菌保持著高度的裂解活性,還對BF 具有良好的抑制和降解作用,且在應用噬菌體制劑時,還能與其他抗菌劑如抗生素、含氯消毒劑、糖醇、鐵拮抗分子等聯(lián)合應用,增強對BF 的清除效果［34］。因此,與常規(guī)治療方法相比,噬菌體在防控BF 方面更具有應用潛力。

4 噬菌體及裂解酶治療的優(yōu)缺點

細菌耐藥性問題日益嚴重,目前已進入后抗生素時代,抗生素的治療效果愈發(fā)不明顯,尋找新的抗菌制劑刻不容緩。近些年,人們逐漸意識到利用噬菌體及裂解酶來治療細菌感染性疾病的重要性。與傳統(tǒng)治療方法相比,應用噬菌體及裂解酶治療細菌感染性疾病具有極大的優(yōu)勢:①在自然環(huán)境中存在大量的噬菌體,易分離,且能治療耐藥細菌引起的疾病；②可與其他抗菌劑如抗生素、中藥成分等聯(lián)合使用抑制細菌,既可治療又可預防細菌引起的疾??；③特異性強,只針對相應的病原菌不會破壞正常菌群；④可抑制BF 形成,并清除已形成的BF；⑤可通過基因工程進行人工改造,可使噬菌體和裂解酶具有更好的穩(wěn)定性和裂解能力。

盡管噬菌體及其裂解酶在治療細菌感染方面具有很多優(yōu)勢,但在應用方面也面臨著諸多局限,如裂解譜范圍窄、裂解活性易受影響和可攜帶細菌毒素基因、耐藥基因等問題。目前,許多科研機構都在探索解決辦法,BYOUNG-JOO 等［35］將 13 株裂解性噬菌體制成雞尾酒制劑,以克服噬菌體裂解譜窄的難題；CHENG 等［36］將裂解酶與中藥成分聯(lián)合使用,以降低細菌毒素對機體產(chǎn)生的損傷；RITA COSTA等［37］利用基因工程手段制備基因工程噬菌體,來增強噬菌體清除細菌BF 的能力。此外,還有一個主要問題是噬菌體抗性突變體的出現(xiàn),但這種抗性的問題已有研究表明可通過制備噬菌體雞尾酒或噬菌體與抗生素聯(lián)合應用來克服［38-41］。由于噬菌體屬于病毒,使得很多人對噬菌體治療的安全性產(chǎn)生懷疑,目前尚未對噬菌體療法建立系統(tǒng)的指導規(guī)范。因此,噬菌體在廣泛應用前尚有許多問題需克服。

5 展 望

目前對于奶牛乳房炎治療最常用的方法仍為抗生素療法,但該治療方法存在治愈率低、易產(chǎn)生耐藥性、抗生素殘留等缺點。應用抗生素治療時往往治療不徹底,導致病原菌在乳腺組織形成BF,引起乳腺組織持續(xù)性感染,造成奶牛乳房炎反復發(fā)作、難以治愈。尋找新的治療手段已迫在眉睫。噬菌體及其裂解酶具有獨特的進化和選擇優(yōu)勢,不僅能高效快速地殺滅耐藥細菌,而且還不易產(chǎn)生耐藥性。此外,在防控細菌BF 方面具有特異性、安全性和高效性等特點,使其無論應用于醫(yī)學領域還是畜牧生產(chǎn)方面均具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

噬菌體作為細菌的克星在相互作用過程中共同進化。通過水平基因傳遞和突變等方式,細菌進化出多種多樣的防御機制,如阻塞受體、分泌競爭性抑制劑和產(chǎn)生細胞外基質(zhì)等［42-43］。為了突破這些防御機制,噬菌體也不斷更新自身的遺傳元件,如一些噬菌體可編碼解聚酶,破壞BF 完整性,削弱BF 的屏障作用［30］。已有研究顯示,噬菌體及其裂解酶可與其他抗菌劑聯(lián)合應用增強抗菌效果,從而協(xié)同清除生物被膜及細菌細胞［39,44-45］。因此,噬菌體及其裂解酶對于防控細菌感染具有先天的優(yōu)勢。采用噬菌體及其裂解酶防治奶牛乳房炎可從以下幾方面入手:①預防奶牛乳房炎的發(fā)生。細菌在環(huán)境中多以BF的形式附著于物體表面,如奶牛乳區(qū)、擠奶設備、工人手套、畜舍墊料等,將噬菌體作為乳區(qū)清洗、畜舍消毒和擠奶設備清洗等日常生產(chǎn)過程中的消毒劑,可從源頭控制乳房炎致病菌的數(shù)量,防止細菌形成BF,降低乳房炎的發(fā)生幾率；②噬菌體及其裂解酶直接用于奶牛乳房炎的治療。噬菌體及其裂解酶對高度耐藥的細菌仍能保持很好的裂解作用,臨床應用時可制成噬菌體雞尾酒制劑或?qū)⒘呀饷概c噬菌體一同應用,進而增強對細菌和BF 的清除作用；③與其他治療方法協(xié)同治療。噬菌體及其裂解酶可與抗生素、中草藥、消毒劑等聯(lián)合使用,治療慢性奶牛乳房炎,提高治療效果。因此,應用噬菌體防控奶牛乳房炎主要致病菌BF 是可行的。

隨著越來越多的研究人員參與到噬菌體的應用研究中,將來噬菌體療法或許可幫助人們解決因BF所導致的細菌持續(xù)性感染問題,為奶牛乳房炎反復發(fā)作、久治不愈提供新的治療方法。