杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的研究進(jìn)展

陶原 田春梅

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，山東 256600

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一種致死性的X染色體隱性遺傳病，由營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因突變導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺乏［1-2］。在兒童早期發(fā)病，其特征是近端肌肉無(wú)力和小腿肥大?；颊咄ǔＴ?2歲喪失下肢行動(dòng)能力，并在十幾歲至二十多歲時(shí)死于心肺并發(fā)癥［3］。目前尚沒(méi)有特效藥物，且發(fā)病機(jī)制研究不明確，本綜述描述了DMD的臨床特征，臨床表現(xiàn)和治療方法，以及一些新型療法的研究。

1 發(fā)病機(jī)制

DMD是由DMD基因突變引起的。DMD基因編碼肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白，位于肌細(xì)胞膜和肌動(dòng)蛋白絲表面之間的肌細(xì)胞內(nèi)，其mRNA主要在骨骼、心臟、平滑肌和大腦中表達(dá)［4］。該基因可發(fā)生各種突變，如缺失（60%～65%）、重復(fù)（5%～10%）和點(diǎn)突變［5］。DMD基因突變的影響主要取決于變異是否破壞了這些突變下游的閱讀框。在框外突變的情況下，DMD基因的開(kāi)放閱讀框被破壞從而導(dǎo)致DMD。同時(shí)，框內(nèi)突變并形成異常但保留部分功能的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白則引起貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良癥［6］。由于突變類型的不同，骨密度表型可能有很大的變化，從無(wú)癥狀到邊緣性DMD［6］。有研究表明，LTBP4和SPP1基因多態(tài)性的表達(dá)對(duì)患兒發(fā)病年齡有影響［7］。肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白是連接肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的一部分，有助于支持肌肉的力量和功能。缺乏肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白會(huì)導(dǎo)致肌肉纖維中肌漿蛋白的丟失和肌肉的廣泛損傷，從而導(dǎo)致肌肉退化。此外，DMD肌纖維逐漸被脂肪和纖維化組織所取代，這進(jìn)一步阻礙了肌肉的機(jī)械和生理活動(dòng)［8］。

肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺乏導(dǎo)致肌肉纖維變性的確切機(jī)制仍不清楚。質(zhì)膜上肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的缺乏會(huì)導(dǎo)致肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白相關(guān)蛋白從膜上脫離，導(dǎo)致細(xì)胞骨架破裂，從而導(dǎo)致膜的不穩(wěn)定性和對(duì)機(jī)械應(yīng)力的敏感性增加。涉及肌肉損傷的各種機(jī)制包括機(jī)械損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣水平增加、信號(hào)分子的損傷和免疫細(xì)胞的增加等［9］。

2 臨床表現(xiàn)

DMD患者通常從近端開(kāi)始出現(xiàn)進(jìn)行性肌無(wú)力。典型表現(xiàn)為肌肉無(wú)力、步態(tài)改變、肌肉假性肥大和行走困難?；加蠨MD的男孩通常在沒(méi)有用糖皮質(zhì)激素治療的前提下在10～12歲之間失去行走能力，隨著病情的發(fā)展，許多患者由于缺乏椎旁肌肉支持而發(fā)展為脊柱側(cè)凸，從而影響呼吸，上肢功能在后一階段下降。其他骨科并發(fā)癥包括長(zhǎng)骨骨折、骨質(zhì)疏松及關(guān)節(jié)攣縮癥（通常首先出現(xiàn)在腳踝，然后出現(xiàn)在臀部、膝蓋、肘部和腕部）。也有認(rèn)知障礙、注意力缺陷多動(dòng)障礙、自閉癥譜系障礙和強(qiáng)迫癥的報(bào)道。擴(kuò)張型心肌病通常在10歲以后出現(xiàn)，隨著年齡的增長(zhǎng)，DMD患者呼吸和心臟問(wèn)題繼續(xù)惡化，最終導(dǎo)致其死亡［10］。

3 治 療

3.1 糖皮質(zhì)激素 迄今為止，皮質(zhì)類固醇（如潑尼松龍、潑尼松）已成為唯一在DMD中有效的藥物。皮質(zhì)類固醇改善DMD強(qiáng)度的具體機(jī)制尚不清楚，但目前包括改變肌肉纖維中基因的調(diào)節(jié)、減慢骨骼肌分解速度、減少細(xì)胞毒性T細(xì)胞、降低胞質(zhì)鈣濃度和增加成肌細(xì)胞修復(fù)。有研究結(jié)果表明，潑尼松龍、潑尼松可以在10 d內(nèi)改善肌肉力量，3個(gè)月藥效達(dá)最大，并可以維持18個(gè)月，且可降低呼吸系統(tǒng)與心臟功能及脊柱側(cè)彎患病率和嚴(yán)重性。但還沒(méi)有長(zhǎng)期的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)表明，皮質(zhì)類固醇會(huì)延長(zhǎng)DMD患者失去活動(dòng)能力的時(shí)間或改善長(zhǎng)期生存率。其不良反應(yīng)包括體質(zhì)量增加、行為改變、免疫抑制和多毛癥，少部分可出現(xiàn)骨折、青春期延遲、高血壓、白內(nèi)障及生長(zhǎng)抑制［11-12］。

3.2 上調(diào)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白相關(guān)蛋白 Utrophin蛋白是6號(hào)染色體編碼的常染色體同源物，與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上高度相似［13］。在mdx小鼠（DMD模型）和金毛獵犬MD（一種DMD的狗模型）中，utrophin蛋白的上調(diào)已顯示出有效的結(jié)果［14］。有研究表明，ezutromid使用utrophin A啟動(dòng)子片段在預(yù)防m(xù)dx小鼠的進(jìn)展過(guò)程中具有積極作用，并減少了再生纖維的數(shù)量［15］，但有一項(xiàng)臨床2期試驗(yàn)表明其缺乏持續(xù)療效［16］。目前正在開(kāi)發(fā)第2代內(nèi)啡肽調(diào)節(jié)劑，特別是SMT022357被發(fā)現(xiàn)在mdx小鼠中表現(xiàn)出體內(nèi)有效性，導(dǎo)致骨骼肌和心肌中肌營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)增加。目前已有研究表明，相對(duì)于ezutromid，SMT022357更能有效改善mdx小鼠的營(yíng)養(yǎng)不良表型［17］。

3.3 核因子抑制劑 核因子κB（NF-κB）的激活可以導(dǎo)致肌肉蛋白降解，從而產(chǎn)生促炎性介質(zhì)，如細(xì)胞因子和趨化因子，導(dǎo)致疾病發(fā)展。DMD患者可見(jiàn)到活化的NF-κB。edasalonexent（CAT-1004）是一種口服小分子，設(shè)計(jì)為抑制NF-κB，目前處于1/2期臨床試驗(yàn)中。該藥物處于臨床試驗(yàn)第一階段，該藥物被證明對(duì)DMD患者安全且耐受良好，但是有報(bào)道稱在治療12周后，未能顯示出明顯獲益［19］。在一項(xiàng)為期1周的針對(duì)男孩的1期試驗(yàn)中的第一階段，也耐受性良好，目前需要下一步試驗(yàn)［18］。

脂聯(lián)素也可以降低NF-κB的活性，對(duì)暴露于急性和慢性炎癥的骨骼肌具有抗炎作用。之前在一項(xiàng)mdx小鼠的實(shí)驗(yàn)中證明了脂聯(lián)素基因的局部給藥降低了骨骼肌中幾種氧化應(yīng)激及炎性標(biāo)志物的表達(dá)，并增加了肌源性標(biāo)志物的表達(dá)，可以延緩疾病進(jìn)展，通過(guò)減少肌肉發(fā)炎、損傷來(lái)改善肌肉及力量［20］。

3.4 肌肉生長(zhǎng)抑制素抑制劑 肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族的成員，是骨骼肌質(zhì)量的負(fù)調(diào)控因子。mdx小鼠模型中肌生成抑制素的丟失或抑制可導(dǎo)致肌肉質(zhì)量增加、力量增強(qiáng)、脂肪替代減少和纖維化。domagzumab與myostatin結(jié)合并抑制其活性，在實(shí)驗(yàn)中顯示安全且耐受性良好，但近期一項(xiàng)2期臨床試驗(yàn)未取得良好結(jié)果［21］。ACE-031是激活蛋白IIB型和IgG1-Fc的融合蛋白，結(jié)合肌生長(zhǎng)抑制素和相關(guān)配體，在一項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)中由于其肌肉相關(guān)的不良事件最終導(dǎo)致終止研究［22］。胰島素生長(zhǎng)因子1有助于肌肉生長(zhǎng)，目前正在臨床試驗(yàn)中研究其在增加肌肉纖維大小方面的用途。

3.5 基因治療

3.5.1 外顯子跳躍 通常是指使用合成反義寡核苷酸抑制剪接增強(qiáng)子位點(diǎn)，以防止特定外顯子參與剪接。從而將DMD轉(zhuǎn)化為貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，其目的是閱讀框的恢復(fù)以及部分功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生，而不是非功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生［23］。13%～14%的DMD患者有可能通過(guò)跳過(guò)第51外顯子糾正閱讀框的缺失。eteplirsen可與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前體mRNA的外顯子51結(jié)合，并在mRNA加工過(guò)程中導(dǎo)致外顯子51被跳躍。它是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的首個(gè)跳過(guò)外顯子的藥物（2016年9月），一項(xiàng)meta分析表明eteplirsen還可以改善患者呼吸功能，但尚無(wú)長(zhǎng)期證據(jù)表明他們的長(zhǎng)期療效［24］。drisapersen和suvodirsen也已在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行過(guò)評(píng)估，但由于的risapersen的不良反應(yīng)（蛋白尿及血小板減少）及suvodirsen（肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白并未增加）效果不佳，其臨床開(kāi)發(fā)已停止。針對(duì)第53外顯子，golodirsen治療的患者的肌肉活檢顯示，外顯子53跳躍增加，有肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生［25］。viltolarsen也顯示安全且有療效，但仍需要進(jìn)一步研究［26］。對(duì)于外顯子45跳躍，casimersen的療效也正有一項(xiàng)臨床試驗(yàn)進(jìn)行研究［27］。

3.5.2 基因替代療法 基因替代療法是指在DMD患者基因組中插入外源DMD基因，從而表達(dá)出有作用的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。由于肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因的分子量大和病毒載體相對(duì)攜帶較少，需要?jiǎng)?chuàng)建微型肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因進(jìn)行傳遞。重組腺相關(guān)病毒載體用于攜帶微量和小型營(yíng)養(yǎng)蛋白。這種療法在mdx小鼠中顯示出成功的結(jié)果，但在一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，患兒出現(xiàn)了嚴(yán)重的免疫反應(yīng)［28］。最近，研究顯示，微肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的交貨使用AAV載體可以減少在DBA/2J-mdx小鼠，對(duì)于DMD嚴(yán)重mdx小鼠的骨骼肌炎癥和纖維化，但該療法尚未經(jīng)過(guò)臨床測(cè)試［29］。

3.5.3 提前終止密碼子通讀 提前終止密碼子通讀是指當(dāng)提前終止密碼子（Ptc）位于DMD基因的編碼區(qū)域時(shí)，就會(huì)發(fā)生無(wú)義突變，翻譯過(guò)程被迫終止，導(dǎo)致功能失調(diào)的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白形式被截?cái)啵?0］。通過(guò)多項(xiàng)體外研究闡明，慶大霉素等氨基糖苷類藥物可成功抑制多種不同MRNA中PTCs的翻譯終止，恢復(fù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中相關(guān)蛋白的生理功能。其不良作用包括如耳毒性、腎毒性［31］。但氨基糖苷類有優(yōu)先與線粒體核糖體結(jié)合的特性，目前研究采用較低毒性雜交脂質(zhì)體包裹的慶大霉素能有效恢復(fù)mdx小鼠骨骼肌中肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)，適合長(zhǎng)期抑制治療［32］。此外，一種非氨基糖苷類抗生素已被證實(shí)能抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的Ptc。negamycin是一種肽類抗生素，修復(fù)mdx小鼠骨骼肌和心肌的肌營(yíng)養(yǎng)不良，比慶大霉素的毒性更?。?3］。另一個(gè)Ptc抑制基因是ataluren，廣泛的臨床前研究表明，ataluren安全可用，比抗生素具有更特定的功能（不影響脫靶部位，如溶酶體膜）。然而對(duì)于其療效現(xiàn)仍有爭(zhēng)議，目前需要進(jìn)一步研究證明［34］。

3.5.4 基因編輯 使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可在mdx小鼠和犬體內(nèi)進(jìn)行基因編輯，可見(jiàn)骨骼肌和心肌中肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白恢復(fù)，并伴有肌膜上DGC成分的重新定位和骨骼肌功能的改善。CRISPR/Cas9技術(shù)基組水平上模擬外顯子跳躍效應(yīng)，恢復(fù)DMD開(kāi)放閱讀框，并生成擁有部分功能的營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)，在去除mdx小鼠中突變的22、23外顯子實(shí)驗(yàn)和在缺失DMD基因44和50外顯子小鼠的實(shí)驗(yàn)中，取得了很好的療效［34］。

3.6 干細(xì)胞治療 干細(xì)胞治療是基于異體或自體的細(xì)胞移植，其目的是再生患者受損的組織或器官，并補(bǔ)充特定的干細(xì)胞群。在DMD的情況下，主要的目標(biāo)是用肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白感受態(tài)細(xì)胞重建衛(wèi)星細(xì)胞池，從而由于表達(dá)肌纖維的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白存在而恢復(fù)肌肉功能。細(xì)胞來(lái)源可以來(lái)自自體或者供體［35］。目前研究的人類細(xì)胞治療方法可根據(jù)技術(shù)和/或使用的細(xì)胞的性質(zhì)分為3類：⑴部分或完全分化的細(xì)胞，⑵胚胎干細(xì)胞，⑶誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。部分或完全分化的細(xì)胞此組包括肌衛(wèi)星細(xì)胞，骨骼肌醛脫氫酶陽(yáng)性細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞和間血管細(xì)胞和CD133+細(xì)胞。將成肌細(xì)胞移植到免疫抑制的mdx小鼠后，看到了可喜的成果。但由于免疫反應(yīng)，在一項(xiàng)男童的試驗(yàn)中并未成功［14］。但在一項(xiàng)mdx小鼠實(shí)驗(yàn)中，源于系統(tǒng)性抗肌萎縮蛋白表達(dá)嵌合細(xì)胞成功移植了成肌細(xì)胞DEC和間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果顯示有心肌功能的改善［36］。

有研究發(fā)現(xiàn)，利用CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統(tǒng)（一種融合到dCas9中的轉(zhuǎn)錄激活因子）可以靶向并精確重塑內(nèi)源性O(shè)ct4或Sox2基因位點(diǎn)，使修飾后的細(xì)胞系有效地向多能細(xì)胞重編程，這表明基因編輯和干細(xì)胞療法相結(jié)合有望成為DMD的新療法［37-38］。

4 總 結(jié)

DMD是一種破壞性疾病，其特征在于進(jìn)行性肌無(wú)力，是由于缺乏肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白引起的，在早期階段，受影響的肌肉會(huì)經(jīng)歷無(wú)數(shù)次損傷和修復(fù)循環(huán)，但在后期階段，會(huì)逐漸被脂肪和纖維化組織所替代。目前尚無(wú)DMD的治愈方法，糖皮質(zhì)激素是唯一已被證明能將運(yùn)動(dòng)障礙延遲1～2年的藥物。目前許多藥物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示有效，但在人類中成果不明顯，還需進(jìn)一步研究，但是在干細(xì)胞治療及基因治療中顯示出巨大研究、治療前景?，F(xiàn)階段對(duì)DMD進(jìn)行的研究，對(duì)未來(lái)其治療提供了前進(jìn)的方向。