血清游離膽紅素測(cè)定的研究進(jìn)展

譚煒富（綜述）李薇（審校）

暨南大學(xué)附屬東莞醫(yī)院新生兒科，廣東 523900

隨著我國(guó)全面二胎政策穩(wěn)固推進(jìn)，我國(guó)早產(chǎn)兒發(fā)生率及發(fā)生數(shù)明顯升高［1-2］。新生兒高膽紅素血癥發(fā)生率為60%～80%［3］，尤其以早產(chǎn)兒更為多見(jiàn)。作為臨床上不可忽視的問(wèn)題，高水平游離膽紅素（unbound bilirubin，UB）對(duì)新生兒神經(jīng)系統(tǒng)具有明顯的毒性作用，若不及時(shí)診治將發(fā)展為膽紅素腦病，可導(dǎo)致一系列神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥甚至死亡［4-6］。

1 膽紅素生理及神經(jīng)毒性機(jī)制

膽紅素是人體血紅蛋白代謝后形成的四吡咯微黃色化合物，其中在人體血液中有4種不同的存在方式：未結(jié)合膽紅素（unconjugated bilirubin，UCB）、UB、結(jié)合膽紅素（conjugated bilirubin，CB）、delta膽紅素（δbilirubin，Bd）。膽紅素作為人體正常存在的物質(zhì)，在一定濃度下，具有很強(qiáng)的抗氧化作用［7］。

然而，UB作為一種脂溶性物質(zhì)，在其高水平時(shí)可穿透血腦屏障并沉積在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特定區(qū)域，導(dǎo)致該區(qū)域神經(jīng)元壞死及黃染［8-9］。迄今為止，膽紅素神經(jīng)毒性機(jī)制尚不清楚，尚有多項(xiàng)研究認(rèn)為與多種細(xì)胞及分子通路參與有關(guān)，以上機(jī)制破壞細(xì)胞膜完整性及其功能、誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、誘發(fā)線粒體及DNA損傷、影響神經(jīng)突觸興奮性，最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、壞死［6，10-14］。

2 早產(chǎn)兒膽紅素腦損傷的表現(xiàn)

反復(fù)的氧飽和度降低以及呼吸暫?？赡苁羌毙阅懠t素腦?。╝cute bilirubin encephalopathy，ABE）的唯一表現(xiàn)［6］，而早產(chǎn)兒具診斷意義的呼吸暫停有時(shí)可表現(xiàn)為皮膚黏膜“發(fā)紺”，無(wú)序的呼吸控制則是ABE患兒一個(gè)顯著特征。核黃疸時(shí)，膽紅素的神經(jīng)毒性作用而可致早產(chǎn)兒罹患永久性的神經(jīng)后遺癥，除了經(jīng)典的核黃疸，即包括肌張力障礙及手足徐動(dòng)型腦癱、聽(tīng)力損害、眼球上轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)障礙和牙釉質(zhì)發(fā)育不良以外，還可因蝸后聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)損害而表現(xiàn)為聽(tīng)覺(jué)型核黃疸［15-16］。當(dāng)膽紅素神經(jīng)毒性表現(xiàn)為相對(duì)輕微的神經(jīng)發(fā)育障礙，則多無(wú)典型核黃疸的表現(xiàn)，可有輕至中度的運(yùn)動(dòng)異常、肌張力障礙、感覺(jué)運(yùn)動(dòng)整合不協(xié)調(diào)等，稱(chēng)為膽紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)功能障礙（bilirubin-induced neurological dysfunction，BIND）［17-18］。

除以上所述各類(lèi)膽紅素腦損傷外，尚有一臨床棘手且不可預(yù)料的類(lèi)型，即是較低膽紅素水平所致的核黃疸。此類(lèi)患兒的血清膽紅素水平低于產(chǎn)生神經(jīng)毒性所需的膽紅素水平，雖罕見(jiàn)但不容忽視［19］。

3 血清UB檢測(cè)方法

3.1 酶法 酶法檢測(cè)UB的研究眾多，其基本原理是膽紅素過(guò)氧化酶可催化膽紅素氧化以對(duì)其定量檢測(cè)。釩酸鹽氧化酶法通過(guò)釩酸將膽紅素氧化為膽綠素，對(duì)比傳統(tǒng)重氮法檢測(cè)膽紅素更簡(jiǎn)單快速，且可用于含有干擾物質(zhì)的樣品檢測(cè)［20］。而Andreu等［21］設(shè)計(jì)了一種使用膽紅素氧化酶/熒光素結(jié)合物的新技術(shù)同時(shí)對(duì)血清中的UB、白蛋白結(jié)合膽紅素和CB 3種類(lèi)型膽紅素進(jìn)行檢測(cè)分析。此種方法的酶經(jīng)過(guò)修飾可在波長(zhǎng)為487 nm和520 nm處有激發(fā)和發(fā)射熒光。然而，這種新方法的準(zhǔn)確性及敏感性不足以用于臨床樣本的UB檢測(cè)。

Ahlfors等［22］運(yùn)用區(qū)域流體系統(tǒng)通過(guò)過(guò)氧化物酶法測(cè)量血液中游離UCB，該方法通過(guò)使用小口徑管道構(gòu)建一種由計(jì)算機(jī)控制的區(qū)域流體系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了膽紅素檢測(cè)的自動(dòng)化，避免了商業(yè)上獲得的過(guò)氧化物酶法的諸多限制。該方法精確度高，但受到酶穩(wěn)定性的制約。

3.2 色譜法 精確檢測(cè)膽紅素量的色譜法眾多，而高效液相色譜法（HPLC）是目前可分離并直接測(cè)定4種不同膽紅素成分的最精確方法之一。Zelenka等［23］開(kāi)發(fā)了基于高靈敏度HPLC的方法測(cè)定膽紅素，該方法僅通過(guò)簡(jiǎn)單快速的樣品制備步驟即可檢測(cè)組織和體液中的膽紅素。新近的Martelanc研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地將高效液相色譜儀與熱透鏡光譜檢測(cè)（TLS）聯(lián)合對(duì)人類(lèi)血清UB進(jìn)行精確檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)證明HPLC-TLS檢測(cè)法擁有超高的靈敏度，檢測(cè)精度達(dá)到了pM水平，進(jìn)行血清樣本檢測(cè)時(shí)無(wú)需進(jìn)行處理即可加樣檢測(cè)［24-25］。然而，以上研究?jī)H針對(duì)成人血清樣本進(jìn)行探索，并沒(méi)有針對(duì)非成人樣本的研究數(shù)據(jù)。李建瑜與李薇［26］則在改進(jìn)HPLC法的同時(shí)，開(kāi)創(chuàng)性地測(cè)定了13例高膽紅素血癥新生兒，并測(cè)得此組患兒血清UB水平為（548.20±107.19）nmol/L，填補(bǔ)了此類(lèi)研究在新生兒方面的數(shù)據(jù)空白。

3.3 電化學(xué)法 電化學(xué)法按有無(wú)酶促過(guò)程可分為兩類(lèi)不同的檢測(cè)UB的方式，其一是非酶促方法，其二是運(yùn)用膽紅素氧化酶（bilirubin oxidase，Box）的酶促生物傳感方法。

Box作為生物信號(hào)分子廣泛用于膽紅素的電化學(xué)測(cè)定中，其可催化膽紅素產(chǎn)生氧化還原指示劑過(guò)氧化氫，或可通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）間接反應(yīng)而產(chǎn)生電位信號(hào)。有報(bào)道將Box與HRP同時(shí)固定在石墨-環(huán)氧基質(zhì)上形成一種雙酶?jìng)鞲衅?，可提供測(cè)定膽紅素的低電勢(shì)，運(yùn)用該方法其膽紅素的檢測(cè)極限為4μM，線性范圍可達(dá)到10 mM［27］。有研究還通過(guò)運(yùn)用電子傳遞介體（electron transfer mediators，ETM）以增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度［28］。Chauhan等［29］通過(guò)將Box共價(jià)固定于有氧化鋯涂層的二氧化硅納米粒子上，組成一種復(fù)合電極，通過(guò)這種電極可得到膽紅素檢測(cè)的極限值是0.1 nM。另外還有報(bào)道顯示，抗壞血酸氧化酶可代替Box作為生物信號(hào)分子用于電化學(xué)法測(cè)定膽紅素［30］。

關(guān)于非酶電化學(xué)方法測(cè)定膽紅素的報(bào)道很多。Yang等［31］運(yùn)用分子印跡和表面溶膠-凝膠技術(shù)開(kāi)發(fā)了新型高靈敏度石英晶體微天平傳感器，該傳感器對(duì)膽紅素具高度選擇性，其線性范圍為0.1～50.0μM，檢測(cè)限為0.05μM。

3.4 電泳法 毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）是一種高效的分離技術(shù)，僅需少量血清樣品即可進(jìn)行快速檢測(cè)，可用于測(cè)定新生兒血清膽紅素［32-33］。有研究報(bào)道將CE與前沿分析（frontal analysis，F(xiàn)A）結(jié)合以確定混合溶液中UB及其與白蛋白結(jié)合的能力［34］。該研究還發(fā)現(xiàn)向膽紅素-白蛋白混合物添加阿司匹林可將膽紅素分離。此項(xiàng)成果可用于評(píng)價(jià)高膽紅素血癥患兒的殘余白蛋白結(jié)合能力，為新生兒膽紅素神經(jīng)毒性風(fēng)險(xiǎn)管理提供新的思路。Nie與Fung［33］運(yùn)用上述CE結(jié)合FA，開(kāi)發(fā)了通過(guò)聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）多通道微流控芯片測(cè)定膽紅素及其白蛋白結(jié)合能力的床旁檢測(cè)儀器。這種儀器可在發(fā)生黃疸之前檢測(cè)UB的早期升高水平，而且成本低、檢測(cè)快速，可作于新生兒膽紅素床旁監(jiān)測(cè)。

3.5 熒光法 熒光測(cè)定法在其發(fā)展階段，曾使用熒光標(biāo)記的脂肪酸結(jié)合蛋白突變體作為探針，對(duì)UB具有高度的特異性和敏感性。Huber等［35］使用一種被標(biāo)記了熒光分子丙烯酰胺的突變脂肪酸結(jié)合蛋白（BL22P1B11）并使其與膽紅素結(jié)合，而后其熒光被淬滅，可通過(guò)BL22P1B11-Rh裝置探測(cè)熒光的改變而做出響應(yīng)。通過(guò)手持式游離膽紅素儀或?qū)嶒?yàn)室熒光計(jì)，BL22P1B11-Rh探頭可進(jìn)行1 min/次的測(cè)量，并提供精確的血清UB濃度值。Santhosh等［36］使用金納米簇作為熒光探針以檢測(cè)血清中UB。金納米簇對(duì)人血清白蛋白穩(wěn)定，由于膽紅素與血清白蛋白的相互作用，將導(dǎo)致金納米簇的熒光猝滅。此項(xiàng)技術(shù)可用于無(wú)干擾膽紅素檢測(cè)，檢測(cè)限為（248±12）nM。該技術(shù)亦可用于比色檢測(cè)，加入過(guò)氧化氫后金納米簇將具過(guò)氧化物酶活性，可催化檢測(cè)樣品中UB成無(wú)色物質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)樣品的UB比色。

3.6 分光光度法 膽紅素可通過(guò)各種分光光度法進(jìn)行測(cè)量。直接分光光度法是新生兒最常用的血清膽紅素的檢測(cè)方法，該方法在波長(zhǎng)為454 nm和528 nm處進(jìn)行測(cè)量［37］。因膽紅素在波長(zhǎng)454 nm處被吸收，而血紅蛋白在454 nm及528 nm處均等吸收，故波長(zhǎng)528 nm處的吸光度與454 nm處的吸光度的差值即是膽紅素的吸光度。然而，因其檢測(cè)的不精確性，限制了該方法在出生3周以內(nèi)新生兒的運(yùn)用。有課題組針對(duì)自動(dòng)進(jìn)樣進(jìn)行了新的探索。Vichapong研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了同時(shí)進(jìn)樣有效混合流系統(tǒng)（simultaneous injection effective mixing flow analysis，SIEMA）用以測(cè)定尿液中的尿膽素原和膽紅素，此系統(tǒng)由進(jìn)樣泵、連接器、固定線圈、混合線圈和光譜儀組成，通過(guò)此系統(tǒng)的4個(gè)通道可分別檢測(cè)膽紅素及尿膽素原（尿膽素原和膽紅素的檢測(cè)限分別為1.0 mg/L和0.003 mg/L）［38］。

3.7 壓電技術(shù) 石英晶體微量天平（quartz crystal microbalance，QCM）作為壓電原理的應(yīng)用之一，可用于檢測(cè)物質(zhì)細(xì)微的質(zhì)量變化。因其具有高靈敏度、靈活便攜、價(jià)格實(shí)惠的優(yōu)點(diǎn)，也可用于進(jìn)行UB的檢測(cè)。聯(lián)合運(yùn)用分子印跡技術(shù)與QCM技術(shù)可以開(kāi)發(fā)具有高度選擇性和更為靈敏的膽紅素檢測(cè)系統(tǒng)［39］。Yang等［31］基于分子印跡和表面溶膠-凝膠技術(shù)，通過(guò)壓電方法對(duì)將膽紅素印跡的二氧化鈦膜修飾到石英晶體上，開(kāi)發(fā)出了用于測(cè)定膽紅素的新型QCM傳感器。此種方法具有高選擇性、高靈敏度、高可重復(fù)性，其響應(yīng)時(shí)間僅30 min，檢測(cè)膽紅素線性范圍在0.1～50.0μM，檢測(cè)限為0.05μM。有研究則通過(guò)分子印跡技術(shù)，在QCM芯片表面上合成膽紅素印跡聚合物納米膜，所制得的QCM傳感器可用于檢測(cè)人血漿膽紅素時(shí)，其檢測(cè)限和定量限分別為0.45μg/ml和0.9μg/ml［40］。

4 結(jié) 語(yǔ)

高水平的UB對(duì)新生兒尤其是早產(chǎn)兒具有顯著的神經(jīng)毒性，可造成嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)損傷，導(dǎo)致殘疾甚至死亡。血清UB因可通過(guò)血腦屏障并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡、壞死，故及時(shí)檢測(cè)新生兒血清UB至關(guān)重要。目前針對(duì)新生兒血清UB的檢測(cè)方法眾多，可分為酶法、色譜法、電泳法、熒光法、分光光度法和壓電技術(shù)等，每種方法都有其特點(diǎn)及適用條件。臨床兒科醫(yī)生或檢驗(yàn)人員在進(jìn)行對(duì)新生兒血清UB進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，應(yīng)根據(jù)具體實(shí)際對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行選擇，以期獲得更好的檢測(cè)結(jié)果，優(yōu)化新生兒高膽紅素血癥及早產(chǎn)兒膽紅素腦損傷的防治方案。