弓形蟲(chóng)毒力因子ROP18研究進(jìn)展

劉俊 孫濤

1邵陽(yáng)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 422000；2湖南省邵陽(yáng)市中心醫(yī)院血液腫瘤實(shí)驗(yàn)室 422000

弓形蟲(chóng)有性生殖只存在于貓科動(dòng)物的宿主體內(nèi)，但由于家鼠在世界范圍內(nèi)分布廣泛，并與家貓共生，它們也可能是弓形蟲(chóng)的重要中間宿主［1］，一些弓形蟲(chóng)菌株對(duì)實(shí)驗(yàn)室小鼠表現(xiàn)出高致病性。為了保護(hù)納蟲(chóng)空泡膜（parasitophorous vacuole membrane，PVM）的完整性，弓形蟲(chóng)進(jìn)化出了幾種多態(tài)效應(yīng)蛋白，不同的多態(tài)性蛋白質(zhì)對(duì)免疫耐受系統(tǒng)的抑制起重要作用［2］。弓形蟲(chóng)Ⅰ型強(qiáng)毒株的棒狀體蛋白18（ROP18）核苷酸結(jié)合位點(diǎn)高度保守區(qū)域具有蘇氨酸激酶催化活性。某些弓形蟲(chóng)Ⅱ型無(wú)毒株也表達(dá)了ROP18的毒性等位基因型［3］，但其PVM的免疫相關(guān)GTP酶（IRG）未能積累到感染小鼠細(xì)胞的程度。宿主和病原體之間相互施加選擇壓力，導(dǎo)致種群遺傳結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化和共同進(jìn)化的變化，這些變化有助于增強(qiáng)病原體的毒力和宿主抗性，有研究預(yù)測(cè)，許多蛋白質(zhì)序列的多態(tài)性變化將支持產(chǎn)生這種相互作用。對(duì)涉及宿主抗性和病原體毒力的這些多態(tài)性分子進(jìn)行了解并對(duì)其功能機(jī)制進(jìn)行分析，對(duì)疾病控制具有潛在的重要意義。本文綜述分析了弓形蟲(chóng)分泌的重要的毒力因子ROP18的相關(guān)特性。

1 ROP18與ROP5的相互作用

雖然沒(méi)有發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)ROP5的特異性功能，但有研究報(bào)道了ROP5與ROP18的相互作用可以提高ROP18的活性來(lái)增強(qiáng)弓形蟲(chóng)的毒力［4-5］。ROP5基因座由一群密集重復(fù)的基因組成，編碼3種不同的ROP5亞型，ROP5a、ROP5b和ROP5c，每一種弓形蟲(chóng)病原體株中都包含多種亞型［6］。這些ROP5基因的單個(gè)序列幾乎是相同的，但在弓形蟲(chóng)Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型株間表達(dá)差異很大。ROP5和ROP18通過(guò)磷酸化核苷酸結(jié)合位點(diǎn)——高度保守的蘇氨酸殘基來(lái)抑制IRG抗性系統(tǒng)。在這些文獻(xiàn)研究中，發(fā)現(xiàn)致密顆粒蛋白7（GRA7）與ROP5直接相關(guān)，并且對(duì)于干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的GTP酶（IFN-γ-inducible GTPase6，IRGa6）的有效磷酸化必不可少［7-9］。因此，GRA7的丟失與否可能與體內(nèi)寄生蟲(chóng)的毒力直接相關(guān)。有研究表明GRA7是一種非免疫特異性弓形蟲(chóng)效應(yīng)物，并提出了一種通過(guò)調(diào)節(jié)ROP18激酶活性來(lái)解釋GRA7分子功能的模型，此模型還發(fā)現(xiàn)IRGa6也是IRG蛋白中ROP18唯一的特異性靶標(biāo)［10］。ROP18對(duì)體內(nèi)IRGa6特異性功能表明，可能還存在某些其他未知的弓形蟲(chóng)毒力效應(yīng)物可能對(duì)其他IRG蛋白具有嚴(yán)格的特異性。

2 ROP18通過(guò)磷酸化GTPases蛋白作用免疫逃逸

在寄生蟲(chóng)入侵的過(guò)程中，弓形蟲(chóng)通過(guò)分泌一些特殊的物質(zhì)將毒力決定因子傳遞到宿主細(xì)胞中。ROP18的決定簇是一種多態(tài)性絲氨酸/蘇氨酸激酶，它能磷酸化宿主目標(biāo)細(xì)胞，調(diào)節(jié)蟲(chóng)體毒性［11］。隨著分泌物進(jìn)入宿主細(xì)胞，ROP18轉(zhuǎn)運(yùn)到PVM上，并與宿主-病原體界面的細(xì)胞膜相連。但是，ROP18-PVM關(guān)聯(lián)的功能機(jī)制尚不清楚。在某些研究文獻(xiàn)中，發(fā)現(xiàn)ROP18突變體在激酶結(jié)構(gòu)域上游富含精氨酸的結(jié)構(gòu)域改變后，不再與PVM結(jié)合［12］。在感染期間，宿主細(xì)胞上調(diào)免疫相關(guān)的GTP酶蛋白，定位并破壞寄生蟲(chóng)周圍的PVM。ROP18通過(guò)磷酸化關(guān)鍵的GTP酶蛋白結(jié)構(gòu)域的免疫反應(yīng)基因來(lái)逃逸宿主的先天免疫通路［13-14］。ROP18的靶向突變體不能磷酸化IRGa6并且無(wú)法將IRGs從PVM轉(zhuǎn)移，盡管保留了內(nèi)在的激酶活性，但這些突變體在小鼠急性弓形蟲(chóng)病模型中是無(wú)毒的。因此，ROP18與PVM的關(guān)聯(lián)可能是由其富含精氨酸的N端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的，且對(duì)其作為毒力決定因子的功能至關(guān)重要。

3 ROP18對(duì)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄影響

為了進(jìn)一步加深對(duì)ROP18分子功能的理解，有學(xué)者研究了人胚腎細(xì)胞（HEK-293T）中弓形蟲(chóng)RH株ROP18的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。通過(guò)RNA測(cè)序，研究比較了HEK-293T細(xì)胞的ROP18轉(zhuǎn)錄組對(duì)HEK-293T細(xì)胞的作用［15］。分析發(fā)現(xiàn)，ROP18改變了HEK-293T細(xì)胞中750個(gè)基因（467個(gè)上調(diào)基因和283個(gè)下調(diào)基因）的表達(dá)。基因本體論和病理富集分析表明，差異表達(dá)基因在細(xì)胞外間質(zhì)和免疫相關(guān)通路中顯著富集［16］。富集分析顯示DEGs參與多種疾病相關(guān)的通路，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病和眼病［17］。ROP18顯著增加了“保留內(nèi)含子”的選擇性剪接模式，改變了144轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)為研究ROP18如何通過(guò)改變基因、TFs和通路來(lái)影響宿主細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程提供了新的視角。ROP18在基因轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)細(xì)胞周期過(guò)程沒(méi)有明顯的影響［18］。然而，另一個(gè)效應(yīng)蛋白R(shí)OP16在宿主細(xì)胞周期中發(fā)揮了重要作用［19-20］。這2種毒力相關(guān)蛋白（ROP16和ROP18）對(duì)宿主細(xì)胞周期影響的差異可能是由于其宿主靶基因的差異。在之前的研究中，發(fā)現(xiàn)Rh菌株的ROP18與492個(gè)宿主蛋白相互作用［21］。在研究中，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)幾個(gè)相互作用的蛋白表達(dá)水平顯著改變。這種差異可能歸因于轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞行為的變化。ROP17和ROP18都是ROP2家族的分泌蛋白，在宿主細(xì)胞中有相似的位置。通過(guò)比較宿主中ROP17和ROP18的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)與ROP17和ROP18相關(guān)分別有110個(gè)和276個(gè)表達(dá)降低或增加的基因［22］。這種在宿主細(xì)胞內(nèi)的位置以及對(duì)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響上的相似性與ROP17和ROP18共享一些宿主細(xì)胞靶點(diǎn)的事實(shí)相一致。ROP5與ROP18和ROP17形成復(fù)合物，介導(dǎo)弓形蟲(chóng)在小鼠體內(nèi)的存活。鑒于ROP18的功能相互作用和重疊，研究ROP5、ROP16、ROP17、ROP18同時(shí)表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄重編程的影響，可以提高對(duì)剛地弓形蟲(chóng)毒力機(jī)制的認(rèn)識(shí)。有研究分析了HEK-239T細(xì)胞對(duì)ROP18表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)，ROP18對(duì)宿主基因的表達(dá)有顯著影響，其中有750個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，467個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，283個(gè)基因表達(dá)下調(diào)［23］。主要涉及顯著改變的基因的功能在細(xì)胞外基質(zhì)組織、免疫反應(yīng)和疾病過(guò)程中。進(jìn)一步研究ROP18的催化活性突變體對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的影響，并使用不同的細(xì)胞系，可進(jìn)一步了解和明確弓形蟲(chóng)與宿主細(xì)胞過(guò)程相互作用的機(jī)制。

4 結(jié) 論

弓形蟲(chóng)可以說(shuō)是最成功的專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)之一。一旦受污染的食物或水中含有感染性卵囊或速殖子，就會(huì)感染各種溫血脊椎動(dòng)物。據(jù)報(bào)道，全世界大約有1/3的人口感染這種寄生蟲(chóng)，不同國(guó)家的感染率不同。在被感染的人中，大多數(shù)人由于強(qiáng)大的免疫功能控制，表現(xiàn)出輕微或無(wú)明顯癥狀。然而，對(duì)于孕婦和免疫系統(tǒng)受損的個(gè)體，如艾滋病、癌癥化療和移植，弓形蟲(chóng)感染可能導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問(wèn)題。在寄生蟲(chóng)感染的疾病中，先天性弓形蟲(chóng)病被報(bào)道為最嚴(yán)重的疾病之一，每10 000個(gè)活產(chǎn)兒中有1～15個(gè)發(fā)病。通常，先天性弓形蟲(chóng)病有不同的癥狀，包括腦積水或小頭畸形，腦內(nèi)鈣化和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎等。

已知分泌的ROP18在寄生蟲(chóng)蟲(chóng)體主動(dòng)進(jìn)入宿主細(xì)胞并最終操縱宿主細(xì)胞以滿足其需要方面發(fā)揮重要作用。在這些分泌的蛋白中，ROP18被認(rèn)為是能夠影響宿主細(xì)胞功能的關(guān)鍵毒力因子。它在弓形蟲(chóng)Ⅰ型和Ⅱ型菌株中高度表達(dá)，作用于PVM。據(jù)報(bào)道ROP18能磷酸化其他ROP蛋白（即ROP2、ROP4和ROP8），并與其他宿主細(xì)胞蛋白相互作用。例如，它通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子6和p65來(lái)抑制宿主的天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而達(dá)到免疫逃逸的目的。盡管人們對(duì)ROP18介導(dǎo)的通過(guò)免疫逃逸而產(chǎn)生毒力的機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，但這種激酶在宿主細(xì)胞中發(fā)揮致病作用的確切分子機(jī)制仍不清楚，我們下一步工作可針對(duì)ROP18對(duì)宿主細(xì)胞凋亡的影響繼續(xù)展開(kāi)更加深入的研究。