外泌體：肝纖維化中藥調(diào)控新靶標(biāo)*

楊悅，唐露露，魏濤華，，郝文杰，錢南南，楊文明，3

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 安徽合肥 230038

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

3 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 安徽合肥 230038

肝纖維化是在各種致病因素作用下導(dǎo)致的以細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）過度沉積為病理特征的一種慢性肝病，其發(fā)病機(jī)制與多種細(xì)胞因子以及多種信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)，早期若不能得到很好的控制，病情遷延不愈日久可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。流行病學(xué)顯示，肝纖維化的發(fā)病率逐年增加，已經(jīng)成為全球重要的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。迄今為止，尚無特效療法可用于肝纖維化的治療。因此，深入肝纖維化機(jī)制研究和加速抗肝纖維化藥物研發(fā)顯得尤為重要。外泌體作為近年來的研究熱點(diǎn)，越來越多研究證實(shí)外泌體參與肝纖維化形成的病理生理過程，可能是調(diào)控肝纖維化進(jìn)程的重要靶標(biāo)。

外泌體（Exosome）是一類特殊的細(xì)胞外囊泡，直徑在 30～100nm，可攜帶核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞因子和其他生物活性物質(zhì)，是細(xì)胞間傳遞的重要物質(zhì)。大部分哺乳動物細(xì)胞都會產(chǎn)生外泌體，并且不同細(xì)胞分泌的外泌體的組成或數(shù)量會有所不同，具有高度特異性。在人體內(nèi)，外泌體可廣泛存在于唾液、血清、血漿和尿液等體液中。1983 年，Johnstone 等人首先在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)外泌體[1]。起初，外泌體具有脫落膜蛋白作用，用于處理廢棄蛋白質(zhì)和其他分子[2]。直到1996 年，Raposo 等人報(bào)告外泌體參與抗原呈遞和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[3]，促使外泌體重新受到研究者們的關(guān)注和重視。

研究發(fā)現(xiàn)，外泌體的發(fā)生與多囊泡內(nèi)體途徑密不可分，外泌體的發(fā)生包括早期內(nèi)體形成、晚期內(nèi)體形成和多囊泡形成。多囊泡可轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中進(jìn)行溶酶體胞吐作用，或與內(nèi)體膜融合，然后將脂質(zhì)體釋放到細(xì)胞外空間，蛻變成外泌體[4]。報(bào)道顯示，外泌體可調(diào)節(jié)多種病理生理反應(yīng)，例如炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、免疫逃逸等。外泌體可以包含有價(jià)值的生物標(biāo)志物，對疾病臨床的治療具有強(qiáng)大的潛力。隨著對外泌體的研究不斷深入，現(xiàn)在已經(jīng)有大量文獻(xiàn)研究證實(shí)外泌體與肝纖維化的關(guān)系密切。本文以肝纖維化為研究目標(biāo)，以外泌體為導(dǎo)向，對外泌體調(diào)控肝纖維化相關(guān)進(jìn)展作一綜述，為中藥靶向調(diào)控外泌體治療肝纖維化提供理論基礎(chǔ)。

外泌體對肝纖維化發(fā)生的調(diào)控作用

肝纖維化形成是肝臟對反復(fù)損傷后傷口愈合反應(yīng)的過程，該過程與炎癥反應(yīng)后ECM 的沉積有關(guān)。ECM 形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及包括免疫細(xì)胞在內(nèi)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，它們起著雙刃劍的作用，不僅可以促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展，也能有助于肝纖維化的消退。肝纖維化即是機(jī)體對肝損傷后的修復(fù)反應(yīng)，是多種細(xì)胞因子參與、多種信號介導(dǎo)的動態(tài)過程，是各種慢性肝病的共有病理改變。

慢性損傷后，肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cells，HSCs）激活，轉(zhuǎn)化為成肌纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，活化的HSCs 在組織修復(fù)部位遷移并積聚，產(chǎn)生大量ECM 并調(diào)節(jié)ECM 降解。簡而言之，HSCs 的活化是肝纖維化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，增殖的HSCs 通過分泌膠原蛋白而促進(jìn)ECM 的積累，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。而外泌體可以通過靶向傳遞活性物質(zhì)到HSCs，并參與HSCs 的活化、增殖、遷移及凋亡過程，進(jìn)而調(diào)控肝纖維化的進(jìn)程。

1 肝實(shí)質(zhì)來源外泌體

實(shí)質(zhì)細(xì)胞，也稱為肝細(xì)胞，約占肝臟總體積的80%，具有排泄膽汁、合成糖原、解毒等作用。肝細(xì)胞可以釋放外泌體，并且釋放的外泌體在肝細(xì)胞與肝細(xì)胞的通訊以及肝細(xì)胞與HSC 的通訊中均具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體通過整聯(lián)蛋白配體纖連蛋白整合素粘附和觸發(fā)鞘氨醇激酶1（Sphingosine kinase1，SK1）反應(yīng)，調(diào)節(jié)HSCs 信號傳導(dǎo)和遷移[5]。肝細(xì)胞分泌的外泌體直接與靶細(xì)胞融合，并轉(zhuǎn)移中性神經(jīng)酰胺酶和鞘氨醇激酶2（Sphingosine kinase2，SK2），導(dǎo)致靶細(xì)胞內(nèi)鞘氨醇-1-磷酸酯（Sphingosine-1-phosphate，S1P）的合成增加，促進(jìn)肝臟修復(fù)和再生[6]。

Devhave[7]等人研究發(fā)現(xiàn)與健康志愿者和非丙型病毒性肝炎（Hepatitis C virus，HCV）相關(guān)肝纖維化患者相比，在HCV 感染的肝細(xì)胞和慢性肝炎纖維化患者血清中外泌體中miRNA-19a 均呈高表達(dá)。進(jìn)一步結(jié)果表明，來自HCV 感染的肝細(xì)胞的攜帶外泌體miRNA-19a，并通過調(diào)節(jié)SOCS-STAT3 軸來激活HSCs，阻止肝纖維化。在砷誘導(dǎo)的肝纖維化模型中發(fā)現(xiàn)肝臟中存在MALAT1 的過度表達(dá)，肝細(xì)胞的外泌體MALAT1 通過miRNA-26b 調(diào)節(jié)COL1A2 誘導(dǎo)HSCs活化，參與纖維化產(chǎn)生[8]。Lee[9]等人發(fā)現(xiàn)棕櫚酸處理過的肝細(xì)胞衍生的外泌體可誘導(dǎo)HSCs 活化，提示外泌體可能在通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞與HSCs 之間的通訊影響肝纖維化進(jìn)程。Zhang[10]等人研究發(fā)現(xiàn)與非纖維化組織相比，人肝纖維化組織表達(dá)的TRIB3 和選擇性自噬受體SQSTM1/p62（螯合體1）水平更高，并且在纖維化組織中TRIB3 和SQSTM1 的表達(dá)升高呈正相關(guān)。TRIB3 介導(dǎo)的自噬損傷不僅抑制晚期內(nèi)體的自噬降解，而且促進(jìn)肝細(xì)胞分泌富含INHBA/Activin A 的外泌體，從而引起肝纖維化的效應(yīng)細(xì)胞（即HSCs）的遷移，增殖和活化。

2 肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體

非實(shí)質(zhì)細(xì)胞包括HSCs，肝竇形內(nèi)皮細(xì)胞，肝巨噬細(xì)胞以及膽管細(xì)胞，雖然非實(shí)質(zhì)細(xì)胞總數(shù)只占肝臟細(xì)胞總數(shù)一小部分，但是它們在肝臟生理病理過程中發(fā)揮著不容忽視的作用。這些非實(shí)質(zhì)細(xì)胞釋放各種物質(zhì)來通過分泌外泌體調(diào)節(jié)或輔助肝細(xì)胞或鄰近的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能，促進(jìn)肝損傷后的肝臟重塑。

在肝纖維化過程中存在結(jié)締組織生長因子2（Connective tissue growth factor，CCN2）過表達(dá)，CCN2 促進(jìn)HSCs 的許多分化功能，包括有絲分裂、趨化性、粘附、活化和成熟。HSCs 衍生的外泌體CCN2通過Twist1/miRNA-214/CCN2 纖維化信號軸間穿梭于細(xì)胞間，向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)和遞送至靶細(xì)胞。HSC 負(fù)責(zé)miRNA-214 的細(xì)胞間穿梭，而miRNA-214 是HSCs中CCN2 依賴性纖維發(fā)生的調(diào)節(jié)劑。miRNA-214 通過外泌體從HSCs 供體細(xì)胞向相鄰的受體HSCs 或肝細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)，隨后對CCN2 3’-UTR 進(jìn)行調(diào)節(jié)。外泌體miRNA-214 通過靶向遞送至活化的HSCs，降低內(nèi)源性CCN2 表達(dá)，抑制α-SMA 的表達(dá)，改善肝纖維化程度[11-12]。

HSCs 中外泌體可以通過介導(dǎo)的TLR3 激活I(lǐng)L-17A，IL-1β 和IL-23 的產(chǎn)生，觸發(fā)γδT 細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的IL-17A。此外，外泌體介導(dǎo)的TLR3 激活增加HSC 中CCL20 的表達(dá)，從而導(dǎo)致CCR6 +γδT 細(xì)胞的募集，加劇肝纖維化進(jìn)程[13]。研究表明，HSCs 中的miRNA-199a-5p 可以通過靶向抑制CCN2 3'-UTR 活性，降低纖維生成基因表達(dá)[14]。另有研究表明，在肝纖維化小鼠中以及體外TGF-β1 誘導(dǎo)的活化的HSCs外泌體中miRNA-30a 存在顯著下調(diào)，miRNA-30a 通過直接靶向其3'-UTR 區(qū)，抑制Beclin1 介導(dǎo)的自噬，阻止細(xì)胞外基質(zhì)過度積累，減輕了纖維化程度[15]。

HSC 是肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，已發(fā)現(xiàn)多種lncRNA 在HSC 的激活中起重要的調(diào)控作用。原發(fā)性膽汁性肝硬化（Primary biliary cirrhosis，PBC）屬于自身免疫性肝病中的一種，研究發(fā)現(xiàn)，來自PBC 的異常外泌體在抗原呈遞細(xì)胞的不同亞群中選擇性誘導(dǎo)共刺激分子的表達(dá)[16]。lncRNA-H19 是父系印跡的母體表達(dá)的lncRNA，在胚胎發(fā)育過程中高度表達(dá)，但出生后迅速下調(diào)。最近，越來越多的研究表明，H19 廣泛參與了各種器官纖維化的病理機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在PBC 患者及小鼠模型中，H19 水平與肝纖維化的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[17]。H19 由膽管細(xì)胞衍生，可通過促進(jìn)HSC 分化和激活在膽汁淤積性肝纖維化的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，可通過抑制肝細(xì)胞中小的異二聚體伴侶表達(dá)來破壞膽汁酸穩(wěn)態(tài)，從而促進(jìn)Mdr2-/-小鼠膽汁淤積性肝損傷[18]。進(jìn)一步研究結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)膽汁淤積性肝病患者肝臟中S1PR2 和SphK2 的表達(dá)上調(diào)，且熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)H19 充當(dāng)miRNA let-7 的分子海綿，而HMGA2 是let-7 的靶標(biāo)。簡而言之，H19 通過調(diào)節(jié)S1PR2/SphK2 和let-7/HMGA2 信號軸在膽汁淤積性肝纖維化起關(guān)鍵作用[19]。

另外，有研究表明源自脂多糖處理的THP-1 巨噬細(xì)胞的外泌體miRNA-103-3p 可以通過靶向Krüppel 樣因子4 促進(jìn)HSC 增殖并誘導(dǎo)纖維化基因表達(dá)增加，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程[20]。

3 其他細(xì)胞來源外泌體

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一種多能干細(xì)胞，具備強(qiáng)大的增殖、免疫調(diào)節(jié)和自我復(fù)制能力，并認(rèn)為有歸巢特質(zhì)，是一種理想的細(xì)胞療法。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hucMSC）可以顯著恢復(fù)AST活性，降低I 型和III 型膠原產(chǎn)生以及TGF-β1 和磷酸化Smad2 表達(dá)，通過抑制細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，保護(hù)肝細(xì)胞，改善肝纖維化[21]。研究發(fā)現(xiàn)，MFGE8 是MSCs 分泌的一種抗纖維化蛋白，可強(qiáng)烈抑制TGFβ信號傳導(dǎo)并減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積和肝纖維化[22]。源自絨毛膜源性間充質(zhì)干細(xì)胞（Chorionic mesenchymal stem cells，CP-MSCs）的miRNA-125b 抑制Hedgehog信號通路的激活，從而抑制肝纖維化的發(fā)生。另外，有研究表明來源于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells，hbmMSCs）的外泌體可以下調(diào)Wnt 信號通路中PPARγ、Wnt3a、Wnt10b、β-catenin 的表達(dá)，從而有助于抑制下游基因WISP1、Cyclin D1 的表達(dá)，抑制HSCs 活化，從而降低肝纖維化水平[23]。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源（Source of Adipose Mesenchymal Stem Cells，AMSC）的外泌體經(jīng)miRNA-122 的修飾后介導(dǎo)AMSC 與HSCs 之間的通訊，進(jìn)一步影響miRNA-122 靶基因的表達(dá)水平，例如胰島素樣生長因子受體1，細(xì)胞周期蛋白G 和脯氨酰4-羥化酶a1，參與HSCs 的增殖和膠原蛋白的成熟[24]。

內(nèi)皮細(xì)胞衍生來源的外泌體富含SK1，SK1 通過與纖連蛋白及整合素結(jié)合粘附在HSCs 膜上，并依賴于dynamin-2 途徑介導(dǎo)外泌體進(jìn)入HSCs 內(nèi)，調(diào)節(jié)病理性HSC 遷移[25]。而源自自然殺傷細(xì)胞的外泌體可顯著抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的HSCs 增殖和活化，減輕經(jīng)CCl4誘導(dǎo)后小鼠的肝纖維化程度[26]。

外泌體在肝纖維化治療中的作用

目前肝纖維化缺乏特異性治療，新型抗肝纖維化策略的研發(fā)成為臨床研究的熱點(diǎn)。外泌體作為細(xì)胞通訊間的重要物質(zhì)，不僅可以作為潛在生物標(biāo)志物用于診斷和預(yù)后，也可以作為各種疾病的治療靶標(biāo)。越來越多的研究揭示了外泌體在肝臟疾病中的作用，在肝纖維化過程中，外泌體可以通過介導(dǎo)細(xì)胞之間的通訊發(fā)揮作用，提示外泌體可能是臨床潛在的治療靶標(biāo)。

MSCs 分泌的外泌體是一種新型的無細(xì)胞療法，已經(jīng)在多種肝病動物模型中報(bào)道了MSCs 衍生的外來體的治療功效，說明可能是治療肝纖維化的一種新策略[27]。hucMSC 來源的外泌體具有抗氧化和抗凋亡的能力，可以抑制CCl4 誘導(dǎo)的肝纖維化模型小鼠肝組織中8-OhdG、MDA 以及caspase 3 蛋白以及TGF-β 表達(dá)[28]。脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可以將miR-181-5p 直接靶向Bcl-2 和STAT3 的30-UTR上的潛在結(jié)合位點(diǎn)防止結(jié)合，選擇性轉(zhuǎn)移至受損的肝細(xì)胞，激活Beclin-1 啟動自噬反應(yīng)，從而減輕肝臟損傷[29]。miRNA-122 是肝臟中最豐富的miRNA，可調(diào)節(jié)飲食誘導(dǎo)的肝細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1 和波形蛋白的表達(dá)，可能在脂肪性肝纖維化中發(fā)揮作用[30]。通過慢病毒介導(dǎo)的pre-miRNA-122 轉(zhuǎn)移構(gòu)建miRNA -122修飾的AMSC-122，AMSC-122 表達(dá)高水平的miRNA-122，并且可仍保留其表型和分化潛能，可以更有效地抑制HSCs 的增殖和膠原蛋白的成熟。結(jié)果表明，采用miRNA-122 修飾是治療肝纖維化的新潛在策略[24]。采用TNF-a 預(yù)處理急性肝衰竭中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體可通過上調(diào)miRNA-299-3p，抑制NLRP3 途徑的激活來減輕急性肝衰竭引起的炎癥損傷并促進(jìn)肝組織修復(fù)[31]。另外有研究表明，正常健康個(gè)體的外泌體miRNA-34c、miRNA-151-3p，miRNA-483-5p、miRNA-532-5p 和miRNA-687 具有抗纖維化作用[32]。

根據(jù)肝纖維化病理特征和臨床表現(xiàn)，中醫(yī)將其歸集在“積聚”“黃疸”“脅痛”“腹痛”等病證范疇。其基本病機(jī)為“虛損生積”，其中“積”指的是血瘀，其主要表現(xiàn)為纖維結(jié)締組織的過度沉積，并認(rèn)為“血瘀為肝硬化之體”，活血化瘀是治療肝纖維化的基本原則[33]。大量的研究表明，中醫(yī)藥在防治肝纖維化上具有獨(dú)特優(yōu)勢。研究顯示姜黃具有良好的行氣活血功效，臨證使用廣泛。姜黃素是姜黃的的主要活性成分，具有抗炎、抗癌以及免疫調(diào)節(jié)等作用，大量研究證實(shí)姜黃素可通過調(diào)節(jié)肝組織中多種通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)肝臟修復(fù)、緩解肝臟損傷[34，35]。在體內(nèi)膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的纖維化模型大鼠中，姜黃素可通過下調(diào)miRNA-21，上調(diào)miRNA-122，從而抑制TGFβ1表達(dá)，阻止肝纖維化進(jìn)程[36]。在體外HepG2 和HCCLM3 細(xì)胞模型中，也證實(shí)姜黃素治療可下調(diào)miRNA-21 表達(dá)，上調(diào)TIMP3表達(dá)并抑制TGF-β1/smad3 信號通路，發(fā)揮保護(hù)肝臟作用[37]。血瘀既是肝纖維化的病理產(chǎn)物，也是導(dǎo)致肝纖維化的致病因素。因此，活血化瘀法應(yīng)貫穿本病治療的始末。《婦人明理論》云：“一味丹參散，功同四物湯”。丹參味苦性微寒，功善活血祛瘀，破癥除瘕。而“虛”主要表現(xiàn)在氣血、陰精等方面，反映了人體臟腑功能的損傷與降低。黃芪作為補(bǔ)氣藥物之首，其性微溫味甘，功善益氣健脾。黃芪聯(lián)用丹參是臨床治療肝纖維化的主要藥對之一，現(xiàn)代研究顯示，黃芪、丹參以及其有效成分具有良好的抗肝纖維化作用。在體內(nèi)二乙基亞硝胺大鼠中誘導(dǎo)的肝癌（Hepatic carcinoma，HCC）動物模型和體外TGF-β1刺激的HepG2 細(xì)胞模型，復(fù)方黃芪和丹參提取物通過介導(dǎo)miRNA-145/miRNA-21 和Smad3 磷酸化的相互作用，抑制HCC進(jìn)程[38]。青蒿素是從中藥青蒿中提取的一種化合物，其具有良好的抗瘧性。近年來，青蒿素類衍生物對免疫性肝損傷的保護(hù)作用逐漸成為關(guān)注的熱點(diǎn)，雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）可以減少小鼠肝組織中的TGF-β1和TNF-α 的含量來發(fā)揮抗肝纖維化作用[39]。DHA 可以通過抑制了 lncRNA-H19 的表達(dá)水平，調(diào)控HSCs 脂滴代謝發(fā)揮抗肝纖維化作用[40]。最新研究表明，lncRNA-H19、Meg3、以及Snhg18 也是肝豆?fàn)詈俗冃杂置鸚ilson ?。╓ilson’s disease，WD）的TX 小鼠肝臟組織中差異表達(dá)的關(guān)鍵lncRNA[41]。而肝纖維化幾乎是每一個(gè)WD 患者主要肝臟病理改變，是進(jìn)展至肝硬化的必經(jīng)階段。早期干預(yù)肝纖維化的進(jìn)展變得尤為重要，阻斷和延緩肝纖維化的發(fā)展是治療WD 的重要策略。楊文明總結(jié)得出WD肝纖維化“肝腎虧虛、痰瘀互結(jié)”的病機(jī)理論，并針對這一病機(jī)創(chuàng)制了中藥復(fù)方肝豆扶木湯。肝豆扶木湯作為WD 肝纖維化的臨床效方[42]，前期結(jié)果表明，其對TX 小鼠肝纖維化具有逆轉(zhuǎn)作用[43]。因此，我們推測上述基因可能是肝豆扶木湯作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

結(jié) 語

目前肝纖維化治療的基本策略主要是采用去除病因聯(lián)合抗肝纖維化治療，由于肝纖維化病理機(jī)制復(fù)雜，西藥靶點(diǎn)作用單一，臨床療效有限，新型抗肝纖維化藥物的研發(fā)成為我們亟待解決的問題。外泌體由雙層脂質(zhì)囊泡構(gòu)成，可由多種細(xì)胞釋放，并且可以攜帶多種物質(zhì)，具有良好的靶向性和穩(wěn)定性，能夠通過特定的信號通路介導(dǎo)與靶細(xì)胞結(jié)合。因此，采用外泌體進(jìn)行治療是一種有前景的調(diào)節(jié)肝纖維化相關(guān)途徑的手段。外泌體作為細(xì)胞通訊間的重要物質(zhì)，是近年來醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。越來越多研究證明，外泌體在慢性肝病生理病理過程中發(fā)揮重要作用，可能是中藥調(diào)控肝纖維化的重要靶標(biāo)。