柿葉化學(xué)成分研究（Ⅱ）

喬金為，張 偉 ，黃順旺，宋少江，許鳳清 ，黃肖霄，吳德玲 *

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥230061；2.安徽省現(xiàn)代中藥重點實驗室，安徽 合肥230012；3.中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點實驗室，安徽 合肥230012；4.沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽110016）

柿葉為柿樹科植物柿Diospyros kaki Thunb. 的新鮮或干燥樹葉[1]，始載于《滇南本草》。柿葉在全國均有分布，資源豐富。沈華等[2]以黃酮類化合物蘆丁在柿葉中不同季節(jié)含量在8 月最高，推斷為柿葉最佳采收時間。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)柿葉中主要含有黃酮、萜類、醌類、香豆素等多種化學(xué)成分，具有鎮(zhèn)咳、止血、抗菌消炎、抗癌防癌等生理活性[3-4]。此外，柿葉含有較為豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，目前市場上已有利用柿葉加工制成的柿葉保健茶、柿葉奶茶、柿葉飲料、柿葉晶等一系列功能性保健食品[5-6]。現(xiàn)在臨床主要用于降壓、治療冠心病、心絞痛及胃潰瘍出血、肺結(jié)核出血、功能性子宮出血等病癥[6]。本課題組前期對柿葉化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)了柿葉中含有新型環(huán)烯醚萜化合物以及多種酚酸類化合物[7-8]，為了進一步闡明柿葉的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究對柿葉乙酸乙酯部位繼續(xù)進行了分離鑒定，得到8 個同類型倍半萜類化合物，其中化合物（6R,9R）-3-oxo-αionol β-D-glucopyranoside （1）; corchoionoside C（2）;（E）-4-[3'-（β-D-glucopyranosyloxy）butylidene]-3, 5, 5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one（3）; （Z）-4-[3'-（β-D-glucopyranosyloxy）butylidene]-3, 5, 5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one（4）； leeaoside （8）為首次從柿葉中分離得到。

1 材料

Bruker AV-400 型 和 Bruker AV-600 型 核 磁 共振波譜儀（ 瑞士 Bruker 公司）；質(zhì)譜用Q-Tof mass spectrometer 型 質(zhì) 譜 儀（Bruker Daltonics, CA）；LC-20AD 型高效液相色譜儀（日本島津），YMC 型色譜柱（S-5μm 12 nm；250 mm × 20.0 mm 和250 mm×10.0 mm）；Dr Flash-II 型中壓制備液相（上海利穗化工科技有限公司），色譜柱為RP-18 gel（Merck, Darmstadt, Germany） 預(yù)裝柱；EYELA SB-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社）；柱色譜硅膠（200 ～ 300 目）和薄層色譜用硅膠G、GF254（青島海洋化工廠）；凝膠Sephadex LH-20（25 ～ 100 μm，GE 公司）；試劑均為分析純或化學(xué)純；顯色劑為香草醛-硫酸-乙醇溶液（噴后105 ℃加熱顯色）或碘蒸氣顯色。

柿葉藥材購自亳州藥材大市場，產(chǎn)地為安徽省蚌埠市。經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)方成武教授鑒定為柿樹科植物柿Diospyros kaki Thunb.的干燥葉。標(biāo)本（SY-20140510001）存放于安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥物化學(xué)教研室。

2 提取分離

取柿葉50 kg，參照“流浸膏與浸膏劑”項下的滲漉法（《中國藥典》2020 年版一部附錄I O）及文獻調(diào)研的基礎(chǔ)上進行滲漉提取，減壓濃縮，得到稠浸膏［密度為1.10 ～ 1.05（80℃熱測）］。浸膏水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，減壓回收溶劑，分別得到石油醚部位和乙酸乙酯部位。取乙酸乙酯部位（950 g）經(jīng)硅膠柱色譜以二氯甲烷-甲醇（100 ∶0、20 ∶1、10 ∶1、5 ∶1、3 ∶1、1 ∶1、 0 ∶100）梯度洗脫得五個流份Fr.1 ～ Fr.5，取Fr.2 （285 g） 經(jīng)聚酰胺柱以甲醇-水（0 ∶100、30 ∶70、60 ∶40、100 ∶0）洗脫得Fr.2-1 ～ Fr.2-4，對Fr.2-1（85 g）部 分 以 甲 醇- 水（10 ∶90、20 ∶80、40 ∶60、60 ∶40、80 ∶20、100 ∶0）為洗脫劑，反相硅膠（ODS）中低壓色譜柱分離得6 個子流份Fr.2-1-1 ～ Fr.2-1-6，取Fr.2-1-4 （500 mg）分別經(jīng)制備HPLC（40%甲醇-水，流速：8 mL/min）制備得化合物1 （13 mg），6 （11 mg）。取Fr.3 （392 g） 經(jīng)聚酰胺柱以甲醇-水（0 ∶100、30 ∶70、60 ∶40、100 ∶0）洗脫得Fr.3-1 ～ Fr.3-4，取Fr.3-1 （100 g）部分以水為洗脫劑經(jīng)凝膠柱色譜分離得到A、B 兩部分，取Fr.A（65 g）經(jīng)ODS 柱以甲醇（20 ∶80、40 ∶60、60 ∶40、100 ∶0）為洗脫劑得4 個流份Fr.A-1 ～ Fr.A-4，F(xiàn)r.A-2（12 g）經(jīng)硅膠柱色譜以二氯甲烷∶甲醇梯度洗脫得6 個流份Fr.A-2-1 ～ Fr.A-2-6，取Fr.A-2-1（1.3 g）經(jīng)制備HPLC（20%乙腈-水，流速：8 mL/min）制備得化合物2（6.9 mg），F(xiàn)r.A-2-3（1.2 g）分別經(jīng)制備HPLC（40%甲醇-水，流速：8 mL/min）制備得化合物5（8 mg）、3（8 mg），F(xiàn)r.A-2-5（900 mg）分別經(jīng)制備HPLC（38%甲醇-水，流速8 mL/min）制備得化合物7 （15 mg）、4（21 mg）。取Fr.B（35 g）經(jīng)MCI 柱 以 甲 醇∶水（20 ∶80、40 ∶60、50 ∶50、60 ∶40、100 ∶0）為洗脫劑得5 個流份Fr.B-1 ～ Fr.B-5，F(xiàn)r.B-4（6.3 g）經(jīng)硅膠柱色譜以二氯甲烷∶甲醇梯度洗脫再經(jīng)薄層檢識共得5 個流份Fr.B-4-1 ～ Fr.B-4-5，取Fr.B-4-4（1.1 g）經(jīng) 制 備HPLC（60%甲醇-水，流速：8 mL/min）制備得化合物8（16 mg）。

3 化合物鑒定

化合物1 白色無定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 393.21 [M + Na]+（計 算 值393.19）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：5.81 （1H, s, H-4），5.74 （1H, dd, J = 15.3, 6.7 Hz, H-8），5.51 （1H, dd, J = 15.3, 6.7 Hz, H-7），4.37 （1H, p, J = 6.4 Hz, H-9），4.11 （1H, d, J = 7.7 Hz, H-1′），3.64 （1H, dt, J = 18.5, 9.3 Hz, H-5’），3.42 （1H, dd, J = 11.7, 5.9 Hz, H-4′），3.07 （1H, t, J = 7.0 Hz, H-3′），3.02 （1H, d, J = 8.4 Hz, H-2′），2.98 （1H, d, J = 5.0 Hz, H-6a′），2.94 （1H, d, J = 3.5 Hz, H-6b′），2.62 （1H, d, J = 9.5 Hz, H-6），2.39 （1H, d, J = 16.5 Hz, H-2a），1.95 （1H, d, J = 16.5 Hz, H-2b），1.89 （3H, d, J = 0.8 Hz, H-13），1.20 （3H, d, J = 6.5 Hz, H-10），0.96 （3H, s, H-11），0.91 （3H, s, H-12）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ：197.9 （C-3），161.9 （C-5），135.2 （C-8），129.0 （C-7），124.9 （C-4），100.0 （C-1′），77.1 （C-5′），77.0 （C-3′），73.3 （C-2′），72.2 （C-9），70.1 （C-4′）， 61.1 （C-6′），54.7 （C-6），47.2 （C-2），35.7 （C-1），27.4 （C-12）, 26.7 （C-11），22.9 （C-13），22.0 （C-10）?；衔?的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[9-10]中報道的（6R, 9R）-3-oxo-α-ionol β-D-glucopyranoside 的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為（6R, 9R）-3-oxo-α-ionol β-D-glucopyranoside。

化合物2 白色無定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 409.19 [M + Na]+（計 算 值409.18）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：5.95 （1H, d, J = 15.5 Hz, H-7），5.77 （1H, s, H-4），5.65 （1H, dd, J = 15.5, 6.4 Hz, H-8），4.46 （1H, m, H-9），4.10 （1H, d, J = 7.7 Hz, H-1′），3.65 （1H, dd, J = 10.9, 5.4 Hz, H-5′），3.42 （1H, m, H-4′），3.04 （1H, d, J = 9.5 Hz, H-3′），3.03 （1H, d, J = 9.5 Hz, H-2′），2.96 （2H, m, H-6′），2.55 （1H, d, J = 16.7 Hz, H-2a），2.06 （1H, d, J = 16.7 Hz, H-2b），1.83 （3H, s, H-13），1.19 （3H, d, J = 6.4 Hz, H-10），0.94 （3H, d, J = 3.7 Hz, H-11），0.92 （3H, s, H-12）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ: 197.4 （C-3），163.8 （C-5），131.7 （C-8），131.5 （C-7），125. 6 （C-4），100.0 （C-1′），77.9 （C-6），77.1 （C-5′），77.0 （C-3′），73.3 （C-2′），72.0 （C-9），70.1 （C-4′），61.1 （C-6′），49.4 （C-2），41.0 （C-1），24.1 （C-12），23.1 （C-11），22.1 （C-10），18.7 （C-13）。經(jīng)文獻檢索對比化合物2 的氫譜和碳譜與文獻[11]中報道的corchoionoside C 的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為corchoionoside C。

化合物3 白色無定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 393.19[M + Na]+（ 計 算 值393.19）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：6.21 （1H, t, J = 6.7 Hz, H-7），5.83 （1H, s, H-4），4.25 （1H, d, J = 7.8 Hz, H-1′），3.86 （1H, dt, J = 11.5, 5.8 Hz, H-9），3.67 （1H, d, J = 11.6 Hz, H-5′），3.44 （2H, m, H-4′），3.14 （1H, m, H-3′），3.04 （1H, dt, J = 15.8, 8.1 Hz, H-2′），3.03 （2H, m, H-6′），2.60 （2H, dd, J = 9.3, 6.4 Hz, H-8），2.26 （2H, d, J = 5.0 Hz, H-2），2.06 （3H, s, H-13），1.24 （3H, s, H-11），1.23 （3H, d, J = 6.5Hz, H-10），1.22 （3H, s, H-12）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ：197.8 （C-3），155.3 （C-5），141.6 （C-6），132.4 （C-7），124.5 （C-4），102.6 （C-1′），76.8 （C-5′），76.8 （C-3′），74.8 （C-9），73.6 （C-2′），70.1 （C-4′），61.1 （C-6′），53.4 （C-2），37.7 （C-8），36.2 （C-1），28.6 （C-11），28.5 （C-12），21.9 （C-10），21.8 （C-13）?；衔? 的氫譜和碳譜與文獻[12]中報道的（E）-4-[3'-（β-D-glucopyranosyloxy）butylidene]-3, 5, 5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one 的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為（E）-4-[3'-（β-Dglucopyranosyloxy）butylidene]-3, 5, 5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one。

化合物4 白色無定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 393.20 [M + Na]+（計 算 值393.19）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：5.88 （1H, t, J = 7.1 Hz, H-7），5.85 （1H, s, H-4），4.24 （1H, d, J = 7.8 Hz, H-1′），3.85 （1H, m, H-9），3.67 （1H, d, J = 10.5 Hz, H-5′），3.44 （1H, dd, J = 11.6, 5.6 Hz, H-4′），3.12 （1H, m, H-3′），3.08 （1H, dd, J = 5.6, 1.7 Hz, H-2′），3.04（1H, m, H-6′a），2.94 （1H, m, H-6′b），2.49 （2H, m, H-8），2.21 （2H, d, J = 2.6 Hz, H-2），2.20 （3H, d, J = 1.0 Hz, H-13），1.20 （1H, d, J = 6.2 Hz, H-10），1.12 （3H, s, H-11, 12）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ：197.7 （C-3），155.7 （C-5），142.7 （C-6），127.9 （C-7），127.9 （C-4），102.6 （C-1′），76.8 （C-5′），74.9 （C-9），73.6 （C-2′），70.1 （C-4′），61.1 （C-6′），52.3 （C-2），40.4 （C-8′），36.4 （C-1），27.8 （C-11），27.6 （C-12），24.2 （C-10），21.7 （C-13）。經(jīng)文獻檢索對比化合物4 的氫譜和碳譜與文獻[12]中報道的（Z）-4-[3'-（β-D-Glucopyranosyloxy）butylidene]-3, 5, 5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one 的波譜數(shù)據(jù)基本一致故鑒定該化合物為（Z）-4-[3'-（β-DGlucopyranosyloxy）butylidene]-3, 5, 5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one。

化合物5 白色無定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 231.14 [M + Na]+（計 算 值231.14）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：6.10 （1H, t, J = 6.8 Hz, H-7），5.84 （1H, s, H-4），3.75 （1H, m, H-9），2.48 （2H, t, J = 6.5 Hz, H-8），2.25 （2H, d, J = 6.8 Hz, H-2），2.04 （3H, d, J = 0.7 Hz, H-13），1.23 （3H, s, H-11），1.22 （3H, s, H-12），1.12 （3H, d, J = 6.1 Hz, H-10）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ：197.9 （C-3），154.9 （C-5），141.6 （C-6），133.2 （C-7），124. 6 （C-4），66.1 （C-9），53.4 （C-2），39.2 （C-8），37. 7 （C-1），8.6 （C-11），28.5 （C-12），23.4 （C-10），21.8 （C-13）。化合物5 的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[13]中報道的（6E,9S）-9-Hydroxy-4,6-megastigmadien-3-one的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為（6E,9S）-9-Hydroxy-4,6-megastigmadien-3-one。

化合物6 白色無定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 231.14[M + Na]+（ 計 算 值231,14）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：5.81 （1H, s, H-4），5.61 （1H, dd, J = 15.3, 5.7 Hz, H-8），5.48 （1H, ddd, J = 15.3, 9.2, 1.0 Hz, H-7），4.71 （1H, s, 9-OH），4.14 （1H, dd, J = 12.1, 6.1 Hz, H-9），2.58 （1H, d, J = 9.2 Hz, H-6），2.32 （1H, d, J = 16.5 Hz, H-2a），1.95 （1H, d, J = 16.5 Hz, H-2b），1.87 （3H, d, J = 1.1 Hz, H-13），1.13 （3H, d, J = 6.4 Hz, H-10），0.95 （3H, s, H-11 ），0.89 （3H, s, H-12）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ： 197.9 （C-3），162.4 （C-5），139.5 （C-8），124.9 （C-7），124.7 （C-4），66.3 （C-9），54.5 （C-6），47.1 （C-2），35.7 （C-1），27.4 （C-12），26.7 （C-11），24.0 （C-13），23.0 （C-10）?；衔?9 的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與文獻[14]中報道（6Z,9S）-9-hydroxy-4,6-megastigmadien-3-one 的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合 （6Z,9S）-9-Hydroxy-4,6-megastigmadien-3- one。

化合物7 白色無定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 393.21[M + Na]+（ 計 算 值395.21）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：5.72 （1H, s, H-4），4.41 （1H, t, J = 5.5 Hz, H-9），4.16 （1H, d, J = 7.8 Hz, H-1′），3.66 （1H, dd, J = 11.6, 3.8 Hz, H-5′），3.42 （1H, dt, J = 16.8, 5.4 Hz, H-4′），3.11 （1H, dd, J = 16.8, 6.5 Hz, H-3′），3.05 （1H, m, H-2′），3.05 （1H, td, J = 8.4, 4.8 Hz, H-6′a），2.91 （1H, td, J = 8.4, 4.8 Hz, H-6′b），2.38 （1H, d, J = 11.0, 5.8 Hz, H-2a），1.97 （3H, d, J = 1.0 Hz, H-13），1.87 （1H, dd, J = 11.0, 5.8 Hz, H-2b），1.87 （1H, t, J = 5.3 Hz, H-6），1.77-1.65 （2H, m, H-8），1.54 （2H, m, H-7），1.16 （3H, d, J = 6.3 Hz, H-10），1.01 （3H, s, H-11），0.94 （3H, s, H-12）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ：198.1 （C-3），165.9 （C-5），124.2 （C-4），102.5 （C-2′），76.8 （C-5′），76.7 （C-3′），74.9 （C-9），73.7 （C-2′），70.2 （C-4′），61.2 （C-6′），50.4 （C-6），47.0 （C-2′），36.0 （C-8′），35.7 （C-1），28.5 （C-12），26.8 （C-11），24.7 （C-7），24.2 （C-13），21.6 （C-10）。經(jīng)文獻檢索對比化合物7 的氫譜和碳譜與文獻[15]中報道的 pipelol A 的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為pipelol A。

化合物8 白色無定型粉末（甲醇）；HRESI-MS m/z: 527.25 [M + Na]+（計 算 值527.25）；1H NMR （DMSO-d6, 400 MHz） δ：5.72 （1H, s, H-4 ），4.86 （1H, d, J = 2.8 Hz, H-1′′），4.16 （1H, d, J = 7.8 Hz, H-1′），3.83 （1H, t, J = 9.2 Hz, H-3′′），3.81 （1H, m, H-6′b），3.74 （1H, d, J = 2.6 Hz, H-4′′），3.68 （1H, td, J = 12.3, 6.4 Hz, H-9），3.58 （1H, d, J = 9.3 Hz, H-5′），3.41 （1H, m, H-6′a），3.33 （2H, m, H-6′′），3.13 （1H, t, J = 8.8 Hz, H-3′），2.96 （1H, m, H-4′），2.91 （1H, m, H-2′），2.38 （1H, d, J = 17.2 Hz, H-2a），1.97 （3H, d, J = 0.9 Hz, H-13）， 1.87 （1H, t, J = 5.3 Hz, H-6），1.87 （1H, dd, J = 17.2 Hz, H-2b ），1.70 （2H, m, H-8），1.54 （3H, m, H-7 ），1.15 （3H, d, J = 6.2 Hz, H-10），1.01 （3H, s, H-11），0.94 （3H, s, H-12）。13C NMR （DMSO-d6, 100 MHz） δ：198.1 （C-3），165.9 （C-5），124.2 （C-4），109.3 （C-1′′），102.6 （C-1′），78.8 （C-2′′），76.7 （C-3′），75.9 （C-4′′），75.4 （C-5′），75.3 （C-9），73.6 （C-2′），73.3 （C-3′′），70.3 （C-4′），67.7 （C-6′），63.3 （C-5′′），50.4 （C-6），47.0 （C-2），36.0 （C-8），35.9 （C-1），28.5 （C-12），26.7 （C-11），24.8 （C-7），24.1 （C-13），21.6 （C-10）。經(jīng)文獻檢索對比化合物8 的氫譜和碳譜與文獻[16]中報道的leeaoside 的波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為leeaoside。

4 討論

本研究共分離鑒定8 個化合物，從解析的化合物結(jié)構(gòu)上看其母核都是13 個碳的降碳類倍半萜。其中化合物5 和化合物6 為苷元且互為同分異構(gòu)體，化合物8 為雙糖苷，其余化合物都為單糖苷?；衔?、3、4 互為同分異構(gòu)體，其中化合物3 和化合物4 僅存在雙鍵構(gòu)型的差異；化合物2 與化合物1 的區(qū)別在于6位碳多了一個羥基；化合物8 與化合物7 比較多了一個阿拉伯呋喃糖。反觀化合物的分離流程，化合物均來自聚酰胺柱色譜水洗脫部位，在凝膠柱色譜上多集中在前半部分流份中。各種柱色譜技術(shù)有序結(jié)合可以分離出目標(biāo)富集萜類成分，為柿葉進一步研究開發(fā)提供依據(jù)，同時也為富含萜類和黃酮類成分的中藥化學(xué)成分研究提供參考。

5 結(jié)論

對柿葉提取物的乙酸乙酯溶劑萃取部位運用硅膠、凝膠、聚酰胺以及制備高效液相色譜等手段進行化合物的分離和純化，對得到的單體化合物通過核磁共振譜（1H,13C-NMR）和質(zhì)譜分析并與參考文獻中的數(shù)據(jù)進行比對鑒定化合物結(jié)構(gòu)。共分離鑒定了8 個倍半萜類化合物，其母核都是13 個碳原子的降碳類倍半萜，其中，有2 個苷元類化合物，5 個單糖苷和1 個雙糖苷。本研究從柿葉的乙酸乙酯部位分離得到的化學(xué)成分多為單糖苷及其苷元，后期將對柿葉的正丁醇部位進行進一步研究，期望從中分離得到更多的降碳倍半萜糖苷類化合物。化合物1 ～ 4 以及化合物8 為首次在柿葉中分離得到，更進一步豐富了柿葉的化合物種類，為柿葉的進一步研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)研究的理論依據(jù)。