腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞對喉鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后評估作用的研究進(jìn)展

郝曉龍，王斌全

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，山西 太原 030001)

喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤之一,占全身惡性腫瘤的1%～5%、96%～98%為喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)[1]。2018年全球新發(fā)喉癌177 422例(1.0%),死亡94 771例(1.0%)[2]。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)最早由Klein于1976年報(bào)道，主要成分為腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞，隨后的研究顯示TILs與多種實(shí)體腫瘤(包括LSCC)的進(jìn)展相關(guān)，其浸潤程度與患者預(yù)后相關(guān)[3]。本文就TILs一般特征、TILs評估方法及腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞對LSCC的預(yù)后評估價(jià)值進(jìn)行綜述。

1 TILs一般特征

TILs是指浸潤在腫瘤組織中的淋巴細(xì)胞群，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，由幾種不同的淋巴細(xì)胞亞群組成，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞等。TILs在腫瘤的清除、平衡和逃逸3個(gè)階段中有至關(guān)重要的作用。LSCC中的TILs能產(chǎn)生包括細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子等小分子，這些因子可以促進(jìn)抗原提呈，殺傷腫瘤細(xì)胞，從而參與腫瘤細(xì)胞識別與清除，也可以促進(jìn)癌變，并協(xié)助腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。此外，鱗狀細(xì)胞癌本身也可以過表達(dá)，具有促炎、促血管生成和免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞因子，介導(dǎo)免疫耐受，造成免疫逃逸。腫瘤細(xì)胞和TILs之間的相互作用不僅影響疾病的發(fā)生和發(fā)展，而且與患者預(yù)后密切相關(guān)[5]。

2 TILs評估方法

TILs的評估最早在19世紀(jì)80年代被開發(fā)出來，Wolf等[6]使用特定T細(xì)胞的單克隆抗體對頭頸鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell cancer,HNSCC)特定淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行了研究。組織切片由丙酮固定，對腫瘤基質(zhì)和腫瘤實(shí)質(zhì)均進(jìn)行了浸潤評估。對于每個(gè)淋巴細(xì)胞亞群，將基質(zhì)或?qū)嵸|(zhì)的浸潤程度記錄為每個(gè)高倍視野的平均細(xì)胞數(shù)。由于該項(xiàng)研究隨訪時(shí)間較短(平均9.5個(gè)月)，病例數(shù)較少(40例)且腫瘤部位異質(zhì)性等原因，其結(jié)論與現(xiàn)今主流認(rèn)識有所不同。Snyderman等[7]使用了基于流式細(xì)胞學(xué)的熒光激活細(xì)胞計(jì)數(shù)對26例HNSCC進(jìn)行了分析，得出的結(jié)果與使用免疫組織學(xué)技術(shù)獲得的結(jié)果吻合，表明使用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)同樣可以對TILs進(jìn)行有效的分離與分析。

國際腫瘤免疫學(xué)生物預(yù)測標(biāo)記物工作組于2017年引入的最新指南已成為評估不同癌癥中TILs的一種簡單且經(jīng)濟(jì)高效的方法[8]。由于它在觀察者之間的高度共識，因此可以作為評估TILs的標(biāo)準(zhǔn)方法。它已被證明是具有良好重現(xiàn)性的不同HNSCC部位研究的有前景的預(yù)后工具[9-10]。提議的方法將診斷性HE染色的癌切片用于以百分比(5%、10%、20%、30%等)作為連續(xù)參數(shù)評估TILs。對TILs的評估在間質(zhì)TILs和瘤內(nèi)TILs中進(jìn)行。 間質(zhì)TILs是指淋巴細(xì)胞占據(jù)的間質(zhì)區(qū)域的百分比；瘤內(nèi)TILs是指浸潤的淋巴細(xì)胞占據(jù)的腫瘤部分的百分比。該指南未確定將腫瘤分層為低TILs或高TILs的臨界點(diǎn)。

最近的研究已廣泛使用人工智能和圖像分析技術(shù)來評估生存預(yù)測的預(yù)后標(biāo)志物，Shaban等[11]一項(xiàng)關(guān)于口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究描述了一種新穎的數(shù)字評分TILs abundance(TILAb)，用于評估HE染色玻片上的TILs。TILAb首先使用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(convolutional neural network,CNN)將整個(gè)玻片圖像分割為不同組織類型(腫瘤、淋巴細(xì)胞等)，然后通過淋巴細(xì)胞與腫瘤的比率及其共定位的組合來量化TILs。這樣的數(shù)字方法可以幫助快速、準(zhǔn)確和標(biāo)準(zhǔn)化的TILs評估，但是其圖像分割性能及圖像處理速度仍有待提高[12]。

通過基于組織的方法對TILs進(jìn)行表征受到一些因素的限制，如可以同時(shí)測定的細(xì)胞類型數(shù)量和所需的組織數(shù)量。應(yīng)用于實(shí)體腫瘤的基因表達(dá)譜技術(shù)可以迅速地為TILs提供廣闊的視野。其中最著名的方法是基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)，分析了多種癌癥類型的總體免疫及基質(zhì)浸潤水平[13]。不同于 GSEA只能計(jì)算描述樣品中細(xì)胞類型富集的半定量得分，反卷積方法如CIBERSORT和DeconRNA-Seq等，可以定量估計(jì)特定細(xì)胞類型的相對分?jǐn)?shù)[14-15]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析只需要少量的RNA，可以進(jìn)行順序分析以及研究腫瘤中的惡性細(xì)胞和TILs特性[16]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析可以同時(shí)分析大量標(biāo)記，并且通過測量趨化因子、細(xì)胞因子和炎性分子的基因表達(dá)，可以告知腫瘤與宿主相互作用的功能方向。此外，他們也能夠與其他分子分析結(jié)合，例如調(diào)用蛋白質(zhì)組學(xué)與外顯子測序等分子亞組。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析能夠大大縮短測序的時(shí)間和費(fèi)用，其主要缺點(diǎn)是通過基因特征表達(dá)對細(xì)胞群體進(jìn)行定量分析而無法提供在腫瘤中相應(yīng)細(xì)胞類型的分布信息。

高通量測序技術(shù)使得業(yè)界更加清晰地認(rèn)識到腫瘤微環(huán)境中基因水平的差異。Galon等[17]通過高通量結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，Th1獲得性免疫相關(guān)的基因與患者的術(shù)后復(fù)發(fā)存在明顯正相關(guān)。Galon等[18]隨后通過免疫組化技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織內(nèi)TILs的數(shù)量、種類和區(qū)域?qū)τ陬A(yù)測臨床預(yù)后具有決定意義?；谶@些研究，Galon等[19]提出采用免疫評分來對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行打分，從而預(yù)測患者預(yù)后，并建立了一套標(biāo)準(zhǔn)的檢測流程和試劑要求。該方法根據(jù)腫瘤中心區(qū)域和腫瘤浸潤交界區(qū)域中CD3+和CD8+細(xì)胞的密度高低，得出免疫評分(0～4分)。免疫評分與傳統(tǒng)TILs評估方法相比，有成本低、周期短、自動(dòng)化程度高、穩(wěn)定性和可重復(fù)性高以及生存周期預(yù)測性高等優(yōu)點(diǎn)。盡管免疫評分的預(yù)后預(yù)測價(jià)值已在結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中得到了驗(yàn)證，其在其他惡性腫瘤中的預(yù)后預(yù)測仍有待驗(yàn)證[20-24]。

3 腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞對LSCC的預(yù)后評估價(jià)值

3.1 TILs的總體評估

Alessandrini等[25]使用了基于2014年國際TILs工作組乳腺癌TILs評估指南的方法，對70例接受初級手術(shù)的早期和局部晚期LSCC患者進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)TILs計(jì)數(shù)較高的患者比TILs計(jì)數(shù)較低的患者具有明顯更低的復(fù)發(fā)率(recurrence rate，RR)和更長的無病生存期(disease free survival，DFS)。與此類似，Vassilakopoulou等[26]和Wang等[27]也應(yīng)用了國際TILs工作組乳腺癌TILs評估指南基于H&E的半定量TILs評估，兩項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)基質(zhì)TILs是LSCC患者總生存期(overall survival，OS)和DFS的獨(dú)立預(yù)后因素。

3.2 CD3+T細(xì)胞

CD3+是腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的一個(gè)高度特異性標(biāo)記物。在一個(gè)主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)分子的作用下，T細(xì)胞受體CD3+復(fù)合物通過其抗原結(jié)合，將激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到T細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。Nguyen等[28]發(fā)現(xiàn)LSCC患者TILs中CD3+的高表達(dá)有利于OS、局部無進(jìn)展生存期(local progression free survival，LPFS)和遠(yuǎn)處無轉(zhuǎn)移生存率(distant metastasis free survival，DMFS)。Le等[29]發(fā)現(xiàn)HNSCC患者CD3+T細(xì)胞高度浸潤的患者表現(xiàn)出更好的臨床結(jié)局，且缺氧相關(guān)標(biāo)志物galectin-1和CD3+染色之間存在很強(qiáng)的逆相關(guān)性，提示低氧可以幫助腫瘤逃避免疫監(jiān)視從而影響患者預(yù)后。研究表明CD3+T細(xì)胞的預(yù)后價(jià)值取決于浸潤方式，Balermpas等[30]認(rèn)為腫瘤內(nèi)CD3+T細(xì)胞的高表達(dá)與較好的預(yù)后相關(guān)，而腫瘤基質(zhì)或腫瘤周圍的CD3+高表達(dá)并不影響預(yù)后，而Zhou等[31]發(fā)現(xiàn)腫瘤周圍高CD3+表達(dá)均與OS和DFS顯著相關(guān)，而瘤內(nèi)區(qū)域CD3+T細(xì)胞浸潤的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這樣的差異可能是由于這兩項(xiàng)研究瘤內(nèi)區(qū)域定義不同導(dǎo)致的。與結(jié)直腸癌等腺癌不同，Zhang等[32]研究了包含55例LSCC在內(nèi)的HNSCC發(fā)現(xiàn)浸潤邊緣中CD3+T細(xì)胞的密度與預(yù)后無關(guān)，并因此認(rèn)為LSCC的TILs評估應(yīng)與腺癌不同。

3.3 CD8+T細(xì)胞

CD8+T淋巴細(xì)胞也稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，由于其具有通過與人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)I類分子結(jié)合而直接靶向和破壞腫瘤細(xì)胞的能力，因此它是比CD3+更強(qiáng)健的生物標(biāo)志物。高水平的腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞可能與宿主對已通過環(huán)境致癌物作用轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞的反應(yīng)有關(guān)[33]。Keck等[34]對一組包含29例喉癌的局部區(qū)域晚期HNSCC進(jìn)行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)CD8+TIL水平較高的患者可提高生存率并具有特定的基因特征稱作炎癥/間質(zhì)亞型。Ogino等[35]對63例喉癌患者進(jìn)行了CD8+T細(xì)胞浸潤的定量發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞浸潤的癌癥特異生存期(cancer-specific survival，CSS)明顯更長，但CD8+T細(xì)胞的浸潤程度與DFS之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)。Hoesli等[36]研究顯示了CD8+T細(xì)胞在復(fù)發(fā)/持續(xù)喉癌患者中的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值。Zhou等[31]發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞浸潤的密度與腫瘤分期、淋巴結(jié)分期和復(fù)發(fā)之間呈負(fù)相關(guān)。與此相反，Badoual等[37]在包含19例喉癌在內(nèi)的84例HNSCC患者組織中沒有發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞浸潤與OS或無復(fù)發(fā)生存期(relapse-free survival，RFS)之間有關(guān)聯(lián)，并認(rèn)為這一結(jié)果可能與CD8+T細(xì)胞對HNSCC細(xì)胞凋亡特別敏感有關(guān)。Zhang等[32]發(fā)現(xiàn)，和CD3+T細(xì)胞一樣，CD8+T細(xì)胞在腫瘤中心的浸潤與患者良好預(yù)后相關(guān)，而浸潤邊緣的CD8+T細(xì)胞浸潤與預(yù)后無關(guān)。Spector等[38]發(fā)現(xiàn)在控制已知預(yù)后因素的多變量分析中，較高水平的CD8+與OS改善相關(guān)。Chatzopoulos等[39]發(fā)現(xiàn)在單變量分析中更高的CD8+T細(xì)胞浸潤水平與LSCC患者良好的OS相關(guān)而與DFS無關(guān)，無法在多變量分析中證明CD8+TILs的預(yù)后作用，因而不支持將CD8+T細(xì)胞作為患者評估的優(yōu)質(zhì)工具。但是由于不同研究的多變量模型設(shè)置了不同的變量及分組，且一些研究的隊(duì)列包含了不同臨床病理特征的患者，這使得結(jié)果難以比較。

3.4 CD4+T細(xì)胞

CD4+T細(xì)胞是一系列具有不同功能的細(xì)胞群，T輔助細(xì)胞(T helper cell,Th)包括Th1、Th2、Th9、Th17、濾泡輔助T細(xì)胞和CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等。CD4+T細(xì)胞通過促進(jìn)CD8+T細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的增殖來響應(yīng)HLA II類蛋白質(zhì)呈遞的抗原，從而產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，在不存在CD8+T細(xì)胞的情況下，CD4+T細(xì)胞可以通過直接裂解II類MHC陽性腫瘤細(xì)胞或促進(jìn)其他效應(yīng)細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞)的募集來抑制腫瘤的生長[40-42]。Th1分泌I型細(xì)胞因子，例如γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)，它們通過激活抗原呈遞細(xì)胞來刺激CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。 T輔助2型淋巴細(xì)胞(Th2)分泌II型細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素(interleukin,IL) - 4，IL-5和IL-13，它們限制了抗原呈遞細(xì)胞的激活并增強(qiáng)了體液免疫。Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，能夠參與誘導(dǎo)和介導(dǎo)促炎癥反應(yīng)，并對HNSCC的致癌作用及其轉(zhuǎn)移形成有實(shí)質(zhì)性影響[43-44]。Curiel等[45]發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen- 4, CTLA- 4)，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(glucocorticoid-induced tumor necrosis factorreceptor，GITR)和叉頭框轉(zhuǎn)錄因子P3 (forkhead box P3,FoxP3)，抑制腫瘤相關(guān)抗原特異性免疫，有助于腫瘤生長。目前FoxP3是可用于鑒定Treg細(xì)胞的最佳標(biāo)記，但使用此標(biāo)記可能會(huì)高估腫瘤內(nèi)Treg細(xì)胞的頻率或密度，因?yàn)橐阎狥oxP3還可以在其他類型的細(xì)胞中表達(dá)。Tanaka 等[46]認(rèn)為Treg主要介導(dǎo)外周耐受，并有助于維持免疫穩(wěn)態(tài)，其產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子如IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和IL-35，抑制效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)。 在最早的研究中，Wolf等[6]認(rèn)為，腫瘤實(shí)質(zhì)中CD4+T細(xì)胞浸潤水平升高與更長的無病間隔(disease-free interval,DFI)和OS相關(guān)，而與實(shí)質(zhì)浸潤相反，基質(zhì)中低水平的CD4+T細(xì)胞與DFS有關(guān)。Badoual等[37]對含19例LSCC在內(nèi)的84例HNSCC研究發(fā)現(xiàn)，高水平的腫瘤浸潤C(jī)D4+、CD69+T細(xì)胞與OS和RFS呈正相關(guān)，在單變量和多變量分析中，腫瘤浸潤性CD4+FoxP3+T細(xì)胞的水平與較好的RFS呈正相關(guān)。Nguyen等[28]研究了含48例LSCC在內(nèi)的513例HNSCC，發(fā)現(xiàn)較高的CD4+TILs水平與OS和RFS的改善有關(guān)。在控制了預(yù)后因素后，較高的CD4+TILs水平可預(yù)測OS和疾病特異性生存期(disease-specific survival，DSS)的改善。Hoesli等[36]發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)/持續(xù)喉癌患者中CD4+TILs水平升高與DFS和DSS改善有關(guān)，Mann等[47]也得出了類似的結(jié)論。與這些研究不同，Sun等[48]在含23例喉癌在內(nèi)的手術(shù)后復(fù)發(fā)頭頸惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)CD4+FoxP3+T細(xì)胞與不良的RFS相關(guān)。Balermpas等[30]在含4例喉癌在內(nèi)的60例頭頸惡性腫瘤中沒有觀察到CD4+或FoxP3與其系列中的臨床結(jié)果有任何相關(guān)性。Zhang等[49]對60例LSCC患者進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)人乳頭狀瘤病毒陽性患者預(yù)后的改善與更少的CD4+TILs相關(guān)。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞可以作為LSCC預(yù)后評估指標(biāo)，不同類別的腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞在LSCC中具有不同的預(yù)后價(jià)值。但是仍存在諸多問題使得腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞未能應(yīng)用于臨床。現(xiàn)有研究多為回顧性研究且病例數(shù)量有限，其結(jié)果受排除病例(如失訪、病理資料不足)影響較大，且只能從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度來評估腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞與LSCC預(yù)后的相關(guān)性，并沒有研究各腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞亞群的功能測定，未來需要更多的前瞻性研究來進(jìn)一步證實(shí)各腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞亞群功能及腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的療效預(yù)測作用。此外，腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能本質(zhì)上是動(dòng)態(tài)的，最初在活檢標(biāo)本中評估腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞后，后續(xù)治療(如放化療、免疫治療)可能會(huì)顯著改變浸潤狀態(tài)，標(biāo)本原始的預(yù)后價(jià)值可能因此而被干擾。因此需要開發(fā)包括癌細(xì)胞和腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞免疫原性基礎(chǔ)的免疫指標(biāo)，也可以通過多次活檢動(dòng)態(tài)評估腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞。相信隨著研究的深入，腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞終將應(yīng)用于臨床工作，成為更好的預(yù)后評估工具。