Claudin‐18對早產兒支氣管肺發(fā)育不良作用的研究進展

左敬葉 佟雅潔 綜述 岳冬梅 審校

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院新生兒科，遼寧沈陽 110004）

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia,BPD）是早產兒最常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。炎癥反應導致的肺損傷是關鍵環(huán)節(jié)[1‐2]，典型病理特征是肺泡和微血管發(fā)育中斷，早期以肺水腫為主要表現[3]。肺泡上皮屏障是由蛋白質復合物形成的相鄰上皮細胞之間的密封界面，它的功能依賴緊密連接。緊密連接是一種跨膜蛋白復合體，對構建上皮屏障和上皮極性至關重要。密封蛋白（Claudin）家族在緊密連接的結構和功能上發(fā)揮著核心作用。本文主要對Claudin‐18在BPD中的作用進行綜述。

1 肺的屏障功能

肺泡上皮主要功能是提供屏障，其選擇通透性的實現主要依靠兩個轉運途徑：跨細胞轉運和細胞旁轉運。肺部細胞間連接主要包括緊密連接、黏附連接、間隙連接和橋粒。緊密連接是影響上皮屏障功能的最關鍵因素，它主要由閉合蛋白、Claudin、緊密連接相關蛋白（zonula occluden,ZO）構成，其中Claudin蛋白對緊密連接細胞旁通透性發(fā)揮決定性作用[4]。緊密連接的功能包括調節(jié)離子、小分子和水的細胞旁運輸，除了選擇性屏障的常見功能，有證據表明緊密連接可以影響細胞增殖、分化和基因表達的細胞內信號傳導途徑[5]，它們支持緊密連接作為細胞功能的動態(tài)調節(jié)器而發(fā)揮作用，而不僅僅是充當靜態(tài)通道或者屏障。

Claudin屬于四跨膜蛋白家族，是緊密連接通透性的結構和功能基礎[6‐7]，可以形成具有不同特異性和通透性的細胞旁離子通道。Claudin的胞外結構域與相鄰的胞外結構域相互作用形成屏障[8]，C末端結構域與支架蛋白相互作用，可以直接連接到肌動蛋白細胞骨架，ZO‐1和ZO‐2是最具特征的支架蛋白，能促進和調節(jié)緊密連接中Claudin的結合[9]。緊密連接也受其他跨膜蛋白的控制，例如四跨膜蛋白Occludin與Claudin相互作用可以調節(jié)緊密連接裝配和屏障功能[10]。雖然Claudin蛋白家族只是緊密連接蛋白復合物的一部分，但它們作為控制細胞旁通透性和緊密連接屏障的主要結構成分發(fā)揮重要作用。

2 肺中Claudin蛋白的表達

2.1 Claudin結構

目前已經發(fā)現27種人類Claudin蛋白，大小為207~305個氨基酸。基于序列同源性，所有Claudin蛋白具有相同的二級結構—— 4個跨膜域：4個緊密的螺旋束和細胞外片段（extracellular segment, ECS）1和2，靠近膜表面的含有5條β鏈（β1~β5）的β折疊，被比作具有5個手指的人類左手[11]。結晶學研究表明，鄰近細胞之間的Claudin相互作用可能是基于ECS1和ECS2中暴露最多的可變區(qū)1和可變區(qū)2的細胞間相互作用[12]，其中ECS1和ECS2的特異性取決于氨基酸序列的差異。有研究證實，細菌產氣莢膜梭菌腸毒素的C末端片段通過ECS1和ECS2區(qū)域僅結合特定的 Claudin，并且對 Claudin‐3、4、6~9、14和 19具有不同的親和力[13]。然而，可變區(qū)的獨特的基本框架和附著在膜上的細胞外β折疊可能是所有Claudin蛋白種類的共同特征[14]。

基于Claudin分子結構的最新突破，有學者提出了假設的“反平行雙列模型”，該模型闡明Claudin如何以線性方式聚合并形成具有細胞旁屏障和通道功能的緊密連接鏈[15]。在分類上，哺乳動物的Claudin被細分為經典Claudin和非經典 Claudin[16]， 經 典 Claudin 包 括 Claudin‐1~10、14、15、17和19，它們顯示出高度的結構相似性，通常具有短的胞質C末端結構域，這種相似性在第二胞外域尤為明顯；非經典Claudin包括Claudin‐11~13、16、18和 20~24，第二胞外域具有更高的異質性[17]，有更長的C末端結構域，因此細胞質支架蛋白相互作用的機會更大。

Claudin還根據它們的功能分為成孔蛋白和封閉蛋白[18]，Claudin‐2、7、10、15和 16在緊密連接上形成更多的空隙，使細胞旁陽離子的滲透性增加，而肺上皮細胞傾向于表達封閉蛋白，如Claudin‐1、3、4、5、7 和 18[19]。Claudin 蛋 白 不會孤立地起作用，它們會與其他跨膜蛋白，包括Claudin蛋白家族、MARVELD蛋白、免疫蛋白超家族和支架蛋白等形成復合物，除了作為細胞旁通道外，還可通過與不同類別的支架蛋白相互作用作為信號樞紐的一部分[20]。

2.2 Claudin在肺中表達

在整個人類肺組織中，最豐富的Claudin轉錄物是 Claudin‐1、3~5、7、8、10、12、18 和 23[21]。使用細胞類型特異性標記物和熒光激活細胞分選術從大鼠肺中純化肺泡上皮細胞（alveolar epithelial cell, AEC）Ⅰ和AECⅡ，結果發(fā)現兩種細胞類型主要表達Claudin‐3、4和18[22]，但兩種細胞類型表達Claudin蛋白的比例不同：Claudin‐18在AECⅠ表達最豐富，Claudin‐3在AECⅡ表達最豐富，兩種細胞都表達相對高水平的Claudin‐4。其中，只有Claudin‐18.1是肺獨有的[23]，表明其具有肺特異性。Claudin‐1、5、7、12、15和23在肺泡上皮細胞中呈低水平表達[22]，可能對肺泡上皮屏障有所貢獻。

3 Claudin‐18與BPD的關系

3.1 Claudin‐18 的分子結構

人類Claudin‐18基因全長35 kb，位于22號染色體長臂q3上，并由6個外顯子和5個內含子組成[23]。它有兩種剪接變體，一種主要在肺中表達（Claudin‐18.1），另一種主要在胃中表達（Claudin‐18.2），就基因結構和核苷酸序列而言，Claudin‐18同工型在系統(tǒng)發(fā)育上高度保守[23]。

3.2 Claudin‐18在BPD肺損傷中的角色

Claudin‐18是唯一已知的肺特異性緊密連接蛋白，是AECⅡ細胞中最豐富的Claudin蛋白，提示其在調節(jié)肺屏障功能和肺泡發(fā)育中起關鍵作用[24]。Claudin18在肺發(fā)育過程中的時空表達模式是精確的，從小鼠胚胎期16.5 d到生后15 d，其表達呈上升趨勢，且在生后15 d達峰[25]。早產胎肺（n=6，胎齡23~24周）和足月兒正常肺（n=7，0~3月齡）相對于出生后的時期，胎肺中的Claudin‐18表達水平顯著降低。因此我們可以推斷：在BPD危險期內出生的極早產兒可能存在Claudin‐18缺乏癥[24]。各種誘導肺損傷模型中，Claudin‐18表達降低已經被認為肺屏障損傷的標志[26‐28]。卵清蛋白誘導哮喘小鼠模型中的Claudin‐18水平顯著升高，可以激活磷酸化蛋白激酶B和磷酸化磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（phosphoinositide‐dependent protein kinase 1, PDK1）信號通路并影響氣道高反應性和炎癥[29]。缺血性急性腎損傷后4 h和24 h，肺泡灌洗液中蛋白含量增多，增加的浸潤和凋亡可能由Claudin‐4、Claudin‐18和連接黏附分子‐A（junctional adhesion molecule‐A, JAM‐A）表達減少引起，同時上皮屏障滲漏增加，肺泡液清除功能減弱，這也可以解釋急性腎損傷和肺炎患者中菌血癥的高發(fā)生率[30]。在銅綠假單胞菌誘導急性肺損傷模型中，Claudin‐3、4和18在24 h后RNA表達增加，肺泡灌洗液中相關蛋白增加，并且與肺泡上皮破壞和肺損傷的嚴重程度平行[31]。在高氧誘導BPD模型中，Claudin‐18可能參與早期肺水腫的形成和晚期肺泡發(fā)育障礙過程[32]，我們將從肺泡上皮通透性、肺泡發(fā)育和祖細胞穩(wěn)態(tài)3個方面來闡釋Claudin‐18在BPD發(fā)病機制中的作用。

3.2.1 Claudin‐18影響肺泡上皮通透性為了研究Claudin‐18在肺發(fā)育及屏障功能中的作用，LaFemina等[24]制作了Claudin‐18（第2外顯子和第3外顯子）敲除（knockout, KO）小鼠，結果發(fā)現與野生型小鼠相比，Claudin‐18 KO小鼠在高氧所致BPD模型中，肺損傷和肺水腫程度呈時間依賴性，肺泡上皮屏障通透性增加。在緊密連接形態(tài)方面，空氣組緊密連接超微結構正常，高氧暴露7 d，肺泡上皮細胞回縮，可見明顯的細胞旁間隙，緊密連接不規(guī)則增寬，呈開放狀態(tài)[24]。這種緊密連接形態(tài)學和功能上的改變與高氧所致BPD大鼠模型變化十分相似——肺泡數目更少，體積更大，肺泡間隔增寬，肺泡形成受損。此外，對人類樣本的分析表明，相對于足月新生兒和嬰兒，極早產兒肺Claudin‐18表達降低[24]。

Claudin‐18 KO小鼠雖然沒有明顯的呼吸功能障礙，但是缺乏Claudin‐18的小鼠離子滲透性（K+、Na+和Cl-）更高，對小溶質（5‐羧基熒光素）和大溶質（三羧基葡聚糖）也有更高的滲透性，可能與肺泡上皮鈉通道和Na+/K+ATP酶活性增加及囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)因子氯通道的激活有關[33]。BPD早期以肺水腫為主要表現，肺泡通透性增加，清除率降低，炎性物質滲出增加。但是，Claudin‐18調控離子通道具體機制尚不明確。

Claudin蛋白之間的相互作用可以改變Claudin與支架蛋白的相互作用，直接影響屏障的滲透功能。酒精暴露會引起Claudin‐5表達增加，使含有Claudin‐18的緊密連接尖峰增加，Claudin‐5與Claudin‐18 結合增強抑制了 Claudin‐18 與 ZO‐1 的相互作用，降低ZO‐1和Claudin‐18的共定位，弱化緊密連接的相關結構，導致細胞旁滲漏增加[34]，這可能由于Claudin‐18構象改變，使其他因素取代ZO‐1 與 Claudin‐18 作用[20]。Claudin‐18 的調控可能嵌入在JAM‐A軸中。JAM‐A是糖原合成激酶‐3β（glycogen synthase kinase‐3β, GSK‐3β）的 假 定 抑制劑[35]，JAM‐A低表達小鼠對肺損傷的敏感性增加[36]。這些結果假定JAM‐A在急性肺損傷期間刺激肺泡上皮緊密連接，因而具有保護功能。嘌呤能受體P2X7代表ATP門控離子型受體，在損傷條件下，P2X7受體影響肺泡上皮細胞中的Wnt/β‐catenin信號通路。P2X7-/-小鼠肺中 Claudin‐18表達顯著增加，肺泡上皮細胞GSK‐3β蛋白水平及其非活性形式表達增加，提示Claudin‐18與P2X7受體表達呈負相關，與GSK‐3β表達呈正相關[37]。Wnt/β‐catenin信號通路的精確協(xié)調激活對于正常的肺發(fā)育至關重要，有證據證明人BPD組織和BPD高氧模型中存在異常激活的β‐catenin模式，肺部高氧損傷囊狀期間充質Wnt5a的增加會促進BPD患者的肺泡化和間隔增厚[38]。但是，對于Wnt通路如何具體調控Claudin‐18表達尚不清楚。

3.2.2 Claudin‐18影響肺泡發(fā)育肺發(fā)育過程中，小鼠胚胎肺組織的Claudin‐18從胚胎期14.5 d至18.5 d表達不斷增加。經過皮質類固醇類似物處理后，小鼠肺上皮細胞表達Claudin‐18和表面活性物質A、B、C明顯增多，沉默Claudin‐18會有效抑制皮質類固醇類似物誘導表面活性物質B和C的表達[39]。因此，Claudin‐18與周圍肺上皮細胞的成熟有關，炎癥介質會特異性地使Claudin‐18表達下降，促進肺成熟的藥物會在人胎肺泡上皮細胞中特異性誘導Claudin‐18并促進肺泡發(fā)育[39]。同時有研究表明Claudin‐18的表達受甲狀腺轉錄因子2.1的調控，甲狀腺轉錄因子2.1是肺發(fā)育的重要轉錄因子，提示Claudin‐18可能是肺成熟的潛在重要調節(jié)因子[40]。

Claudin‐18 KO小鼠是肺泡上皮屏障功能障礙和肺泡化受損的新型模型：出生后第3天和第4周的組織學和基因表達分析發(fā)現小鼠肺泡化障礙，其他證據包括獲得性AECⅠ損傷，細胞旁通透性增加[24,41]。Claudin‐18 KO小鼠會特異性出現肺泡上皮結構異常，電子顯微鏡顯示緊密連接的ZO‐1區(qū)域表現出更大的間隙，正常緊密連接形態(tài)減少[41]。緊密連接形態(tài)的變化與肌動蛋白細胞骨架的變化有關，Claudin‐18 KO小鼠AEC形成時，核細胞質膜相連的放射狀纖維的核周聚集物形成增加[31]。急性肺損傷時，高氧誘導新生大鼠出現明顯的肺泡化障礙[24,31]。胎齡為23~24周的人胎肺發(fā)育處于小囊泡期，肺泡尚未發(fā)育成熟，呈現肺不張狀態(tài)，肺泡間隔增寬，肺泡液滲出增多，是發(fā)生支氣管肺不典型增生的危險期[42]，這可能與Claudin蛋白的異常表達有關，進而出現肺的異常發(fā)育及水、離子和代謝物在頂室和底室之間的泄漏。

3.2.3 Claudin‐18影響肺部祖細胞穩(wěn)態(tài)AECⅡ被認為是肺部祖細胞，它既可以形成肺表面活性物質，使肺泡保持一定張力，又可以增殖分化為AECⅠ，在肺損傷時發(fā)揮重要修復作用。Claudin‐18可以抑制PDK1的磷酸化和核定位，從而能抑制A549細胞增殖。Claudin‐18缺失會顯著降低S期細胞百分比，增加G1期細胞，G2/M期不變，基質金屬蛋白酶2和9上調，癌細胞侵襲增加[33]。Claudin‐18是肺部祖細胞增殖和分化的重要影響因素，它會抑制肺上皮細胞異常遷移，低水平的Claudin‐18可能是高轉移潛能的新型標志物[43]。

Claudin‐18 KO小鼠肺部體積增加是AECⅡ增殖活動加強的結果，且被證明這是由轉錄調節(jié)因子YES相關蛋白（yes‐associated protein, YAP）易位至細胞核并誘導增殖途徑所驅動[44]。當Claudin‐18 KO后，細胞以自治的方式加強AECⅡ的增殖活動，分化能力不變，且具有肺上皮細胞特異性。Claudin‐18 KO導致肺體積增大，實質擴張，同時會增加遠端肺部祖細胞的增殖和豐度。Claudin‐18可能是膜上信號分子樞紐，錨定在YAP/TAZ膜上，通過Hippo激酶來調節(jié)YAP的磷酸化和激活，促進磷酸化大腫瘤抑制因子與磷酸化YAP的相互作用[45]。YAP活化在調控遠端肺上皮祖細胞中作用明顯，可以抑制肺上皮細胞的存活與成熟，使俱樂部細胞增生，暗示YAP信號通路在肺損傷后支氣管上皮的修復中發(fā)揮作用[46]。因此緊密連接蛋白Claudin‐18在調節(jié)器官大小和限制遠端肺上皮祖細胞能力及增殖中具有潛在新作用[47]，這種作用是通過限制YAP活性使AECⅡ靜止來調節(jié)遠端肺上皮祖細胞功能的[46]。但是Claudin‐18缺失而導致的YAP激活并不會顯著影響遠端肺上皮細胞的命運[48]。

4 展望

Claudin蛋白家族的表達變化對BPD具有重要研究意義。一方面，作為緊密連接的重要調節(jié)蛋白，它們表達的降低或者上調將直接影響肺上皮細胞屏障的通透性，胎肺處于小管期的早產兒，更容易發(fā)生肺水腫。另一方面，新的研究顯示Claudin‐18具有促進肺泡發(fā)育的潛在可能性，這將給我們提供新的研究思路。目前關于Claudin對肺泡發(fā)育的調控機制有待于研究，還需要更多的基礎和動物實驗進行探索和驗證。