轉(zhuǎn)化生長因子超家族在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞退變中的作用△

劉 帥，白倫浩

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨科，遼寧 沈陽 110004）

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）是一種退行性關(guān)節(jié)疾病，以進行性軟骨退變?yōu)橹鳎殡S滑膜炎癥、骨贅形成和軟骨下骨硬化為特征。影響著全球超過2.5億的人口，除了緩解疼痛外，目前還沒有有效的藥物可以阻止疾病的進展［1，2-4］。軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細胞類型，是關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)合成的唯一來源。隨著OA的發(fā)生，軟骨細胞在增殖、分化和代謝方面發(fā)生了重大變化。軟骨細胞的肥大、凋亡進而軟骨內(nèi)骨化最終導(dǎo)致OA［2，3］。雖然OA病理改變過程中的分子機制尚未完全明確，但通過大量實驗表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor β,TGF-β）超家族在其中扮演著極其重要的角色［4］。

TGF-β超家族是一類細胞因子，進化過程中高度保守，在所有多細胞生物體中都有發(fā)現(xiàn)，在許多組織和器官中都有所表達。生理條件下，動態(tài)調(diào)節(jié)著細胞生長、遷移、細胞外基質(zhì)重塑及免疫功能等［5］。但在病理條件下，過度表達的轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員通過促進細胞的異常增殖、分化及炎癥反應(yīng)，推動疾病的進展［6］。其在OA發(fā)生過程中所扮演的角色，亦是如此［4］。

分泌磷蛋白24（secreted phosphoprotein 24kD,Spp24）是最早在骨基質(zhì)中分離的一種蛋白質(zhì)，主要產(chǎn)生于肝臟，在骨細胞及軟骨細胞中亦有所表達。主要在骨生長和骨轉(zhuǎn)換中起著重要作用，但其全部功能尚未明確。由于其與TGF-β超家族成員的高親和性，使得Spp24可以參與到眾多組織及器官的生理病理活動［7］。本文就TGF-β超家族在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞退變中的角色及Spp24的潛在作用做一綜述。

1 TGF-β超家族配體

在分泌的生長因子和細胞因子中，TGF-β超家族因其在細胞水平和發(fā)育過程中的多種功能以及在包括癌癥在內(nèi)的多種疾病中的作用而備受關(guān)注。人類基因組中有33個編碼TGF-β超家族多肽的功能基因。大致可分為TGF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）、activin and inhibin、nodal、生長分化因子（growth and differentiation factor,GDF）、抗苗勒管激素（anti-Mullerian hormone,AMH）等亞家族［8］。通常以同源或者異源二聚體的結(jié)構(gòu)存在，二硫鍵為其主要連接形式。與其他生長因子相比，TGF-β超家族蛋白刺激細胞增殖的方式比較溫和，并且取決于細胞類型和環(huán)境。但不同的是，TGF-βs強烈抑制多種細胞類型的增殖，包括上皮細胞、內(nèi)皮細胞、造血細胞和免疫細胞［9］。TGF-β超家族蛋白最突出的功能是對細胞分化的影響，因為它們在發(fā)育的各個階段控制所有細胞系的分化。除了細胞增殖和分化，它們還發(fā)揮許多額外的細胞功能，包括促進或保護細胞死亡，促進細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）蛋白的表達，促進細胞的運動和侵襲，并控制細胞的新陳代謝。然而，盡管有豐富的信息，但大多數(shù)TGF-β超家族成員的表達和生理功能仍然不清楚，主要注意力都集中在少數(shù)TGF-β超家族蛋白上。最受關(guān)注的是TGF-βs和BMPs，其失調(diào)節(jié)或基因突變與多種人類疾病有因果關(guān)系，包括癌癥、骨骼、肌肉、心血管和自身免疫性疾病［6，10］。

2 TGF-β超家族受體

TGF-β超家族成員通過與靶細胞表面的雙特異性激酶受體結(jié)合來傳遞信號。雖然該受體家族通常被稱為絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，但卻具有絲氨酸/蘇氨酸激酶和酪氨酸激酶相似的結(jié)構(gòu)特征；實際上是雙特異性激酶［11］。這個家族成員在哺乳動物中非常少，只有12個成員，其中Ⅰ型受體有7個，分別為活化素受體樣激酶（activin receptor-like kinase,ALK）1-7；Ⅱ型受體有5個，分別為TβRⅡ、ActRⅡ、ActRⅡB、BMPⅡ和AMHRⅡ。2個相同類型的Ⅰ型受體與2個相同類型的Ⅱ型受體組成四聚體跨膜蛋白復(fù)合物，每個二聚體TGF-β超家族配體選擇性結(jié)合各自的Ⅱ型受體，相互作用后進而磷酸化Ⅰ型受體。后者隨后磷酸化細胞質(zhì)效應(yīng)器來啟動細胞內(nèi)的信號級聯(lián)反應(yīng)，如R-Smad依賴性信號通路和非R-smad依賴性信號通路。導(dǎo)致細胞外信號穿過質(zhì)膜進入胞漿，最終到達細胞核，調(diào)節(jié)TGF-β超家族蛋白介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄［12］。

3 TGF-β超家族受體的效應(yīng)因子

Ⅰ型受體的激活導(dǎo)致信號通過至少兩條看似獨立的途徑傳播：R-Smad依賴性途徑和非R-Smad依賴性途徑。R-Smad依賴性信號通路被認為是TGF-β超家族成員特有的、規(guī)范的信號通路。Smad蛋白根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能，可分為3種類型，受體調(diào)節(jié)型Smad （R-Smads） ： Smad1、 Smad2、 Smad3、Smad5、Smad8；通用型 Smad（Co-Smad）：Smad4；抑制型 Smad （I-Smads）：Smad6、Smad7［13］。RSmads根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能同源性可以分為兩組：一組由Smad1、Smad5和 Smad8組成，受 ALK1、ALK2、ALK3、ALK6磷酸化；另一組包含Smad2和Smad3，受ALK4、ALK5、ALK7磷酸化。這種磷酸化促進了2個R-Smads與1個Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)運到細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子和輔助調(diào)節(jié)因子協(xié)同激活或抑制靶基因。而I-Smad分別通過阻止R-Smads的磷酸化、抑制R-Smads和Smad4復(fù)合物的形成及R-Smads與DNA的親和發(fā)揮作用。特定地，Smad6主要抑制Smad1、5、8信號傳導(dǎo)，Smad7主要抑制Smad2、3信號傳導(dǎo)，這兩個I-Smad都為細胞提供了一個重要的負反饋機制來滅活R-Smad信號通路［14］。

TGF-β超家族成員也可激活非R-Smad依賴性信號通路，以加強、減弱或以其他方式調(diào)節(jié)下游細胞反應(yīng)。例如通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）途徑傳遞信號，激活轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1（transforming growth factorβ activated kinase-1,TAK1）或細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2（ERK1、2）［15］。值得注意的是，這些信號通路并不是TGF-β超家族所特有的，它們也是許多其他生長因子和細胞因子的重要信號介質(zhì)。

4 TGF-β超家族與OA

OA是一種以軟骨退變?yōu)橹鞯倪M行性疾病，而軟骨細胞作為關(guān)節(jié)軟骨中的唯一常駐細胞類型，其穩(wěn)態(tài)的維持與否，直接影響到OA的進展。TGF-β超家族在關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育、生長、維持和修復(fù)過程中都扮演著重要的角色。但由于各亞家族磷酸化不同的RSmads蛋白，使得身處兩大陣營的TGF-β、Activin、Nodal和BMP、GDF、AMH亞家族誘導(dǎo)軟骨細胞做出方向不同的細胞反應(yīng)［16］?，F(xiàn)如今研究最深入也是最具代表性的為TGF-βs和BMPs兩大亞家族。

4.1 TGF-βs與 OA

TGF-βs是以非活性前體蛋白的形式被軟骨細胞合成并分泌，在細胞外與轉(zhuǎn)化生長因子β結(jié)合蛋白非共價結(jié)合并潛伏于細胞外基質(zhì)，因此活化是TGF-βs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵步驟。壓縮負荷產(chǎn)生的機械力是活化軟骨細胞外基質(zhì)TGF-βs前體蛋白的重要生理激活劑。而活化后的TGF-βs既可以通過磷酸化ALK5受體激活R-Smad2、3信號通路，也可以通過磷酸化ALK1受體，激活R-Smad1、5、8信號通路，來調(diào)節(jié)不同的靶基因，而二者的結(jié)局在軟骨細胞中往往是相互對抗的［17］。優(yōu)勢通路的選擇，主要取決于配體的活化程度和不同受體間的表達水平。

在健康的滑膜關(guān)節(jié)或者是OA前期，機械力和因創(chuàng)傷而導(dǎo)致的軟骨組織輕微損傷，激活了部分TGF-βs，而低濃度的TGF-βs主要以激活A(yù)LK5受體為主［18］，進而導(dǎo)致 R-Smad2、3蛋白的匯聚及磷酸化，通過調(diào)控靶基因，增加Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9的表達，抵消細胞外基質(zhì)的分解代謝，維持軟骨細胞表型；降低RUX2介導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13,MMP-13）、解聚蛋白樣金屬蛋白酶5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5,ADAMTS5）的表達及Ⅹ型膠原的合成，抑制軟骨細胞肥大，阻止其終末分化，降低對細胞外基質(zhì)的降解，另外還可以引導(dǎo)間充質(zhì)干細胞聚集，誘導(dǎo)其向軟骨細胞增殖、分化。通過修復(fù)軟骨組織，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，負反饋阻止OA的進程。Smad3、ALK5或TβRⅡ型受體在小鼠中的軟骨細胞特異性丟失都會導(dǎo)致早期OA的發(fā)生［19］。不反復(fù)加載負荷的截癱患者比OA患者喪失軟骨的速度更快［20］。為了保持軟骨健康，活化TGF-βs和維持有規(guī)律的負荷是保持關(guān)節(jié)軟骨活力所必需的。

隨著OA的進展，細胞外基質(zhì)進一步降解及TGF-βs表達增加，軟骨細胞暴露在過度活化的TGF-βs中，又隨著年齡的增長，ALK1、ALK5的相對含量有所改變，ALK1/ALK5的比值上升［21］，Smad1、5、8通路將優(yōu)先被激活［22］，使得結(jié)局朝向了相反的方向發(fā)展，軟骨細胞肥大、終末分化、凋亡、軟骨內(nèi)骨化、周圍骨贅形成，MMP-13加速著細胞外基質(zhì)的降解，Ⅹ型膠原取代了Ⅱ型膠原，合成代謝的速度落后于分解代謝，TGF-βs在OA軟骨細胞中的作用發(fā)生變化，由抑制疾病向促進疾病發(fā)展，負反饋調(diào)節(jié)向正反饋調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)變，OA的發(fā)展進入不可逆期，且逐漸走向終末期。

4.2BMPs與OA

除了TGF-β亞家族外，BMP亞家族在成骨和軟骨形成中表現(xiàn)出強有力的作用。多種BMP信號通路中的關(guān)鍵因子，包括BMP-2、4，R-Smad1、5、8，以及兩種BMP拮抗劑Noggin和Gremlin1，在關(guān)節(jié)軟骨中都有明顯的表達［23］，軟骨細胞同樣表達BMPⅠ型受體ALK1、2、3、6以及Ⅱ型受體BMPRⅡ、ActRⅡ和ActRⅡB［24］。因此，BMPs也是OA發(fā)病機制中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，但BMPs不以前體的形式潛伏于細胞外基質(zhì)中。與TGF-βs相似，BMP-2也促進蛋白多糖的合成，這對維持軟骨的完整性是積極的。此外，BMP-2和TGF-β1在缺氧條件下聯(lián)合使用在誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨方面有很強的協(xié)同作用［25］。然而，BMP-2在嚴重損傷的軟骨中表達增加，加劇了骨贅的形成，盡管骨贅生長的部位大多靠近生長板。盡管與TGF-βs不同的是，BMP-2可以通過R-Smad1、5誘導(dǎo)生長板軟骨細胞向終末分化，進而軟骨內(nèi)骨化，但BMP-2過表達不會導(dǎo)致健康或骨關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)改變，而在實驗性O(shè)A模型中它會導(dǎo)致嚴重的骨贅形成［26］。這表明在出生后階段BMP-2的高表達可能對關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨細胞沒有明顯的有害影響，關(guān)節(jié)軟骨與骨膜等骨贅形成組織相比，對BMP2信號不是很敏感。實驗證明［27］，BMPs被認為對包括關(guān)節(jié)軟骨和半月板在內(nèi)的關(guān)節(jié)組織的正常發(fā)育和維持至關(guān)重要，而關(guān)節(jié)軟骨和半月板是預(yù)防OA發(fā)病的關(guān)鍵?？傊瑢GF-β超家族，特別是TGF-β或BMP亞家族有更深入的了解將有助于更好地了解OA的發(fā)生和發(fā)展，并將為如何區(qū)分TGF-β家族成員的有利和有害影響提供線索。

5 Spp24在OA中的潛在作用

Spp24是一種骨基質(zhì)蛋白，它似乎主要來源于肝臟，并以保護性復(fù)合體的形式輸送到其他組織，但在骨細胞、軟骨細胞中亦可少量表達［28］。該基因位點（Spp2）與骨密度和骨質(zhì)量相關(guān)的遺傳學(xué)研究表明，Spp2基因在骨生長和骨轉(zhuǎn)換中起著重要作用。因其具有一個與TGF-βⅡ型受體序列相似的亞結(jié)構(gòu)域TRH-1（TGF-β receptor II Homology-1 domain），使得其可以與TGF-β超家族配體結(jié)合，并影響RSmad 依賴性信號通路傳導(dǎo)［7］。Brochmann 等［29］通過實驗證明，通過與BMP-2結(jié)合，可以抑制其在異位成骨中的作用；Sintuu等［30］在重組BMP-2誘導(dǎo)大鼠脊柱融合的實驗中，Spp24表現(xiàn)出完全的骨生長抑制；Tian等［31］證實了Spp24同樣可以與TGF-βs結(jié)合，下調(diào)其活性。另一方面，除了對成骨的影響，還可以抑制炎癥反應(yīng)和依賴于BMP自分泌系統(tǒng)的腫瘤［32］。Tian 等［33］在 BMP 促進兔脊柱融合的實驗中，Spp24降低了神經(jīng)根炎性因子的表達；Lee［34］、Li［35］、Lao［36］等分別通過不同的動物模型，證實了Spp24分別在肺癌、胰腺癌、肝癌中的抑制作用。

2005年，Meng等［37］使用微陣列研究檢測大鼠顳下頜關(guān)節(jié)實驗性骨關(guān)節(jié)炎模型的基因表達中發(fā)現(xiàn)，Spp24的表達增加最多，與正常相比，早期OA增加了19倍，晚期OA增加了32倍。2014年，Balakrishnan等［38］人使用色譜分離和高分辨率質(zhì)譜檢測OA患者的關(guān)節(jié)液，鑒定出677種蛋白質(zhì)，其中一種是Spp24?？梢灶A(yù)見的是，Spp24的表達水平升高與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)。結(jié)合TGF-β超家族成員在生理和病理狀態(tài)下，對軟骨細胞發(fā)揮著不同的作用，Spp24是否作為一種負反饋機制，阻止疾病的進展，尚未有文獻報道。另有文獻報道，Spp24似乎同時具有生長因子結(jié)合特性和細胞因子受體激活特性［39］。目前對于Spp24蛋白作用的研究，仍需不斷深入。

6 小結(jié)和展望

TGF-β超家族對軟骨細胞的穩(wěn)態(tài)或退變中都起著關(guān)鍵作用。TGF-β信號通路的激活對OA有很好的治療前景。但是，TGF-β信號的過度激活可能參與了OA退變的進展。因此，迫切需要闡明TGF-β信號在OA不同病理生理階段中的作用變化、具體的分子機制及Spp24在其中起到的作用原理。只有全面、清晰的解決了這一關(guān)鍵問題，TGF-β超家族和Spp24才能安全、有效的作為OA的治療靶點。