內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌的外泌體在顱腦損傷中作用的研究進(jìn)展

馬小鵬 綜述 張華楸 審校

顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）具有較高的發(fā)病率和病死率，是青壯年最常見的死亡和殘疾原因。全球每年約有5 000 萬(wàn)例TBI，年經(jīng)濟(jì)損失約4 000 億美元，占世界生產(chǎn)總值的0.5%[1]。TBI 后神經(jīng)組織的損傷和修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，多種細(xì)胞參與其中，其中外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和相互調(diào)控具有重要意義。

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）來源于骨髓和外周血管壁，是血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）的前體細(xì)胞[2]。當(dāng)組織缺血或血管內(nèi)皮損傷時(shí)，EPCs被組織釋放的損傷信號(hào)動(dòng)員后進(jìn)行遷移，前往內(nèi)皮損傷部位參與修復(fù)[3]。EPCs分為早期和晚期EPCs，活化的早期EPCs 表達(dá)豐富的炎性細(xì)胞因子和旁分泌血管生成因子，以旁分泌外泌體的方式招募更多的EPCs 和ECs 形成微血管[4]，是損傷后的快速反應(yīng)結(jié)果。早期EPCs 的來源是外周血管壁，外周血EPCs 含量極少，只占外周細(xì)胞的0.01%。晚期EPCs通過增殖、遷移、定位到受損內(nèi)皮處，分化成血管ECs 并整合到血管網(wǎng)絡(luò)中[5，6]。晚期EPCs的來源是骨髓中的EPCs。早期EPCs和晚期EPCs 的作用方式具有差異，提示EPCs 可能具有不同的治療作用。已有研究發(fā)現(xiàn)TBI 后EPCs 分泌的外泌體對(duì)腦微血管修復(fù)和改善預(yù)后具有有益影響[7]。

外泌體是介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的小囊泡，有類似細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，為內(nèi)部的小分子物質(zhì)提供了較穩(wěn)定的環(huán)境。外泌體是一種理想的載體，可將mRNA、miRNA或蛋白質(zhì)運(yùn)送到受體細(xì)胞中，而不會(huì)在循環(huán)中被酶消化。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，EPCs外泌體的外觀結(jié)構(gòu)呈橢圓形膜性囊泡，較多的EPCs外泌體聚集在一起呈葡萄狀排列，大小不等，納米顆粒跟蹤分析顯示平均直徑為120 nm。近期的研究發(fā)現(xiàn)囊泡因內(nèi)容物不同呈現(xiàn)出不同透亮度，其主要成分為mRNA 和蛋白分子[6]。對(duì)早期EPCs外泌體進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)其能高強(qiáng)度表達(dá)CD9、CD63 和熱休克蛋白70[7]。

EPCs 作為TBI 后外泌體來源的主要途徑之一，其作用和意義逐步為人們所認(rèn)識(shí)。本文就EPCs 外泌體在TBI中的作用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 EPCs分泌的外泌體在TBI中的作用

1.1 修復(fù)損傷的血腦屏障TBI常伴隨血腦屏障的破壞。血腦屏障由多種細(xì)胞和神經(jīng)元構(gòu)成，其中毛細(xì)血管壁的ECs 具有細(xì)胞間緊密連接蛋白，構(gòu)成血腦屏障的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在生理?xiàng)l件下，血腦屏障為腦組織選擇性通透營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)保護(hù)腦組織不受有毒物質(zhì)侵害，確保中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能正常執(zhí)行。

內(nèi)皮集落形成細(xì)胞（endothelial colony forming cell，ECFC）是從人臍帶靜脈血中分離得到的早期特異性EPCs。Gao 等[7]從ECFC 條件培養(yǎng)基中分離出ECFC 外泌體并用細(xì)胞膜染劑PKH67 標(biāo)記后，靜脈輸入TBI小鼠體內(nèi)，12 h后觀察到ECFC外泌體被大鼠微血管ECs 高效攝??；傷后24 h，ECs 向創(chuàng)面的遷移量顯著升高；不同含量ECFC 外泌體預(yù)處理ECs后，顯著增加緊密連接蛋白的表達(dá)。這說明ECFC可能通過旁分泌的方式刺激ECs的增殖和遷移。有研究報(bào)道等[8，9]從人臍血中分離單核細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增為ECFC，靜脈注射到TBI 小鼠體內(nèi)24 h 后，熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)在受傷的大腦中檢測(cè)到標(biāo)記的ECFC，明顯減輕腦水腫程度，增加緊密連接蛋白的表達(dá)；小鼠運(yùn)動(dòng)能力、空間獲取和參考記憶能力顯著改善。這表明ECFC在TBI后可以直接定位到損傷部位，參與新血管形成并改善神經(jīng)功能。因此，TBI后ECFC兼有早期EPCs 和晚期EPCs 的特征。ECFC 既通過外泌體的方式促進(jìn)受損血管內(nèi)皮的修復(fù)，其本身又可定位至受損部位，分化成ECs整合到血管網(wǎng)絡(luò)中。

1.2 促進(jìn)血管內(nèi)皮的修復(fù)TBI 導(dǎo)致ECs 損傷，使血管平滑肌細(xì)胞增殖，常會(huì)導(dǎo)致微血管狹窄。Kong 等[10]發(fā)現(xiàn)在大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型中，EPCs 外泌體能抑制新生內(nèi)膜的過度增生，對(duì)ECs 修復(fù)起到保護(hù)作用。Li等[11]在大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷模型中用熒光染料標(biāo)記EPCs并收獲其釋放的外泌體，標(biāo)記的外泌體與ECs 共培養(yǎng)后，外泌體被捕獲并轉(zhuǎn)移到ECs 的核周區(qū)域，顯著增強(qiáng)ECs 的增殖。Hu 等[12]進(jìn)行RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)miR-21-5p在EPCs外泌體中高度富集，并特異性抑制受體ECs中血管生成抑制因子血栓反應(yīng)蛋白-1的表達(dá)。

1.3 抵抗缺氧 李羅成等[6]發(fā)現(xiàn)低氧可引起ECs損傷，體外缺氧環(huán)境處理的人臍靜脈ECs 增殖、遷移能力下降，凋亡細(xì)胞比例上升；EPCs 外泌體顯著改善缺氧條件下ECs 增殖、遷移能力。Wang 等[13]用小鼠骨髓中分離的單核細(xì)胞，在體外饑餓應(yīng)激培養(yǎng)基中培養(yǎng)EPCs并提取饑餓應(yīng)激EPCs外泌體明顯提高血管ECs 一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和NO 水平，保護(hù)血管ECs 免受缺氧誘導(dǎo)的活性氧族的影響；同時(shí)，PI3K 抑制劑可以消除饑餓應(yīng)激EPCs 外泌體的這些保護(hù)作用。這提示饑餓應(yīng)激EPCs外泌體通過PI3K/eNOS/NO通路發(fā)揮作用。

2 調(diào)控EPCs外泌體分泌的因素

2.1 血糖水平 研究發(fā)現(xiàn)高血糖抑制EPCs 外泌體的釋放和相關(guān)基因的表達(dá)[14，15]，使TBI病人血液中EPCs數(shù)量減少。當(dāng)暴露于高葡萄糖時(shí)，人臍帶ECs 的活力和成管能力顯著降低，而衰老細(xì)胞的比例則明顯增高。Hassanpour等[14]將人骨髓來源的EPCs分別與糖尿病和健康人的血清共培養(yǎng)后，糖尿病組EPCs外泌體數(shù)量較對(duì)照組顯著減少，與外泌體分泌和運(yùn)輸?shù)南嚓P(guān)基因表達(dá)下調(diào)。這提示糖尿病對(duì)EPCs 分泌外泌體的效率產(chǎn)生不利影響。

2.2 孕激素Li等[16]制備小鼠TBI模型后腹膜內(nèi)給予孕激素，發(fā)現(xiàn)循環(huán)EPCs水平增加，受傷腦組織CD34和CD31 陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和血管密度增加。這表明TBI后孕激素可顯著改善神經(jīng)功能并促進(jìn)血管重塑。

2.3 運(yùn)動(dòng)鍛煉Ma等[17]分別從久坐和低、中度運(yùn)動(dòng)組小鼠中分離血漿EPCs外泌體，用高糖和缺氧誘導(dǎo)的ECs損傷模型與三組EPCs外泌體共培養(yǎng)研究ECs的保護(hù)因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EPCs 水平和EPCs 外泌體在中度運(yùn)動(dòng)小鼠體內(nèi)的釋放率明顯增高；運(yùn)動(dòng)組EPCs含量及其釋放的外泌體miR-126的表達(dá)明顯增高。這提示運(yùn)動(dòng)可能通過增加EPCs 外泌體的釋放和外泌體中miR-126的含量增強(qiáng)對(duì)ECs的保護(hù)作用。

綜上所述，TBI 后腦血管內(nèi)皮組織損傷、缺血釋放多種細(xì)胞因子，活化的早期EPCs通過旁分泌外泌體作用于ECs，并招募更多的EPCs 促進(jìn)組織修復(fù)。當(dāng)骨髓中的EPCs 受各種因素的刺激后開始動(dòng)員向外周血遷移形成晚期EPCs，增加外周血中EPCs 的數(shù)量并分化成血管ECs 修復(fù)損傷。EPCs 外泌體的保護(hù)作用表現(xiàn)為修復(fù)損傷的血腦屏障、促進(jìn)血管內(nèi)皮的修復(fù)和幫助ECs 抵抗缺氧損傷。EPCs 作為干細(xì)胞移植的替代治療方案，具有促進(jìn)血管再生作用[18]。由于免疫排異等問題，EPCs 的臨床應(yīng)用十分有限[19]。EPCs外泌體具有與EPCs相似的作用，但其主要成分是不具有免疫原性的小分子核酸，因此，EPCs 外泌體有望成為改善TBI 預(yù)后的治療手段[20]。近年來，EPCs被發(fā)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)修復(fù)和腦血管再生具有重要意義[21～23]，但EPCs 外泌體是否具有其父本EPCs的這一重要作用尚待更多研究證實(shí)。