人工智能快速全基因組自動(dòng)分析系統(tǒng)在新生兒/兒童重癥監(jiān)護(hù)室的應(yīng)用

羅芳 李昊旻

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院兒科，浙江杭州 310003；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，浙江杭州 310052）

隨著新生兒或兒童重癥監(jiān)護(hù)相關(guān)醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，感染、營養(yǎng)、早產(chǎn)等疾病的診治已有了長足的進(jìn)步，新生兒或小嬰兒遺傳性疾病所致死亡或預(yù)后不良的發(fā)生比例凸顯。遺傳性疾病中的單基因疾病目前估計(jì)6 500余種，且每年以200種的速度增加[1‐2]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道北美新生兒/兒童重癥監(jiān)護(hù)室（NICU/PICU）和兒童心胸外科重癥監(jiān)護(hù)室中因遺傳性疾病導(dǎo)致的死亡高達(dá)15%[3‐4]。一方面由于此類疾病病情惡化迅速，未及時(shí)診治常致預(yù)后不良，快速進(jìn)行病因診斷并針對性給予干預(yù)措施，可為患兒提供最佳的臨床管理決策，促進(jìn)經(jīng)驗(yàn)治療向精準(zhǔn)治療的轉(zhuǎn)型，實(shí)現(xiàn)診斷率的提升和病死率的下降；另一方面對于預(yù)后差的一些遺傳疾病，快速診斷也有助于做出臨終照顧的決定，從而減輕痛苦并減少醫(yī)療資源的浪費(fèi)?？梢娀蛟\斷在NICU/PICU的開展具有迫切性、高需求性和適合性。

目前臨床上常用的基因檢測主要有基因芯片、panel篩查、全外顯子測序（whole exome sequencing, WES）等，但各自提供的信息不夠全面，在診斷時(shí)長、診斷率方面也存在不足。全基因組測序（whole genome sequencing, WGS）則涵蓋包括點(diǎn)突變、拷貝數(shù)、內(nèi)含子區(qū)域的結(jié)構(gòu)及重組變異等更為全面的信息[5‐6]。隨著測序成本的不斷降低，其臨床接受度不斷提高。但測序數(shù)據(jù)獲取后需要極高專業(yè)的判讀和解釋，常規(guī)的基因組測序、數(shù)據(jù)分析和遺傳診斷報(bào)告需要數(shù)周才能返回臨床，無法滿足臨床診治病情快速發(fā)展的遺傳性疾病的需求。針對WGS現(xiàn)有的局限性，科研工作者從2012年起在測序及診斷時(shí)長上不懈努力：2012年5月Saunders等[7]采用快速全基因組測序（rapid whole genome sequencing, rWGS）技術(shù)在50 h內(nèi)診斷新生兒遺傳疾??；2015年10月該團(tuán)隊(duì)將此技術(shù)的診斷時(shí)長縮短至26 h[8]；2019年4月該團(tuán)隊(duì)的進(jìn)一步研究成果發(fā)表[9]：建立了人工智能快速全基因組自動(dòng)分析診斷系統(tǒng)，并完成其回顧性驗(yàn)證和前瞻性研究。該系統(tǒng)中全基因組測序時(shí)長為15.5 h，系統(tǒng)的另一關(guān)鍵組件提供自動(dòng)分析數(shù)據(jù)功能解決數(shù)據(jù)獲取后的解讀，使得整個(gè)診斷流程可在24 h之內(nèi)完成，也被稱為超快速全基因組學(xué)測序（ultra‐rapid whole‐genome sequencing, urWGS），從時(shí)間上和功能上解決了常規(guī)基因組測序解讀周期長及解讀專業(yè)依賴的現(xiàn)狀。本文介紹rWGS在NICU/PICU的臨床應(yīng)用并簡述人工智能快速全基因組自動(dòng)分析診斷系統(tǒng)的相關(guān)技術(shù)。

1 rWGS技術(shù)在NICU/PICU中的臨床應(yīng)用

2012年Saunders等[7]采用rWGS在50 h內(nèi)對NICU中疑似遺傳性疾病患兒做出了基因診斷，其中回顧性明確了兩名已知病因患兒的基因診斷（1例Tay Sachs病，1例Menkes?。?；并前瞻性對5例未確診新生兒中的4例做出了診斷：1例GJB2基因相關(guān)重癥皮損，1例BRAT1基因相關(guān)的致死性新生兒強(qiáng)直和多灶性癲癇綜合征，在1個(gè)家系中鑒定了BCL9L為一新的隱性內(nèi)臟異位基因，排除了1例患兒已知的候選基因。所采用的軟件是癥狀和體征輔助的基因組分析（symptom‐and sign‐assisted genome analysis, SSAGA）軟件，該軟件為遺傳性疾病的診斷提供了1個(gè)診療框架：即由醫(yī)生輸入患兒的臨床表型，根據(jù)表型軟件列出與之相關(guān)的候選致病基因列表，從而加快基因分析進(jìn)程，在后續(xù)的一些文獻(xiàn)中被稱為表型驅(qū)動(dòng)的WGS。在2012年該軟件已經(jīng)囊括了當(dāng)時(shí)591種遺傳病相關(guān)的227個(gè)臨床術(shù)語，診斷的敏感性達(dá)到了77%~96%，特異性高達(dá)99.5%。

2015年該團(tuán)隊(duì)采用升級后的rWGS技術(shù)，包括Illumina HiSeq 2500快速運(yùn)行模式下18 h的全基因組測序，Edico DRAGEN序列比對和變異檢出，以及三款軟件（VIKING、RUNES和SSAGA）聯(lián)合對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，該技術(shù)將診斷的敏感性和特異性提高到99.5%以上[8]。同年一項(xiàng)回顧性研究[10]比較了在NICU、PICU內(nèi)重癥患兒常規(guī)基因檢測和rWGS在診斷率、診斷時(shí)間、臨床管理兩者之間的差異。結(jié)果顯示35例患兒中20例（57%）通過rWGS明確了基因診斷，32例患兒中3例（9%）通過常規(guī)基因檢測方法明確診斷，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在接受rWGS診斷的20例患兒中，13例（65%）被認(rèn)為具有及時(shí)的臨床指導(dǎo)價(jià)值，4例（20%）被認(rèn)為對臨床治療管理具有非常有利的指導(dǎo)意義，6例（30%）確診后開始接受姑息治療。根據(jù)研究對象的隨訪結(jié)果，120 d病死率達(dá)到57%（12/21），揭示了在NICU和PICU中采用rWGS的方法診斷遺傳疾病的高需求性和迫切性。

2018年一項(xiàng)部分雙盲隨機(jī)對照試驗(yàn)的研究[11]結(jié)果發(fā)表，納入對象是NICU和PICU中4月齡以下的患兒，試驗(yàn)組采用rWGS +常規(guī)基因檢測，對照組僅采用常規(guī)基因檢測。由于兩組之間診斷率的嚴(yán)重失衡，研究提早結(jié)束。在這項(xiàng)納入了65例嬰兒的隨機(jī)對照試驗(yàn)中，28 d內(nèi)rWGS的診斷敏感性為31%，而常規(guī)基因測序?yàn)?%，認(rèn)為對于病因不明的危重癥嬰兒，rWGS可作為首選的一線診斷檢測方法。

之后這一技術(shù)也被推廣應(yīng)用于較大年齡PICU中的危重癥患兒，在一項(xiàng)由38例4月齡至17歲的接受了rWGS檢測的PICU患兒組成的回顧性隊(duì)列研究中，17例（45%）患兒經(jīng)rWGS明確了基因診斷，其中4例（24%）因基因診斷直接導(dǎo)致管理策略改變，9例（53%）臨床上并無畸形特征或發(fā)育遲緩[12]。結(jié)果提示早期的基因診斷影響到患兒和/或其家庭在住院期間或出院后的臨床管理，部分患兒避免活檢，部分患兒采取了替代治療，部分患兒進(jìn)行了疾病相關(guān)后遺癥的監(jiān)測。另一項(xiàng)回顧性研究也證實(shí)了24例平均年齡為16月齡的危重癥患兒中有42%的兒童明確了基因診斷[13]?？梢妼τ赑ICU中潛在的病因不明確的患兒也同樣受益于入院早期的rWGS診斷。需要提及的是超過70%的病例是由重癥監(jiān)護(hù)室醫(yī)生提出并進(jìn)行測序的，這表明臨床醫(yī)生有能力識(shí)別出具有高度疑似攜帶疾病相關(guān)突變基因的兒童，已確定的變異涉及廣泛的疾病范圍，包括癲癇、腦病、心肌病、室性心律失常、自身免疫、免疫和炎癥性疾病[14]。

2 rWGS技術(shù)在NICU/PICU中應(yīng)用的成本效益

自2012年起，將全基因組學(xué)用于臨床的系列研究，顯示W(wǎng)GS在重癥患兒中遺傳性疾病的診斷率從42%上升到57%，改變了30%~72%的醫(yī)療管理及 24%~34% 病例的預(yù)后[7‐8,10,15‐16]。2018 年一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究[15]利用專家咨詢法（Delphi法）進(jìn)行成本分析，并采用平行比較的方法進(jìn)行評估（之前曾有類似的病例在該醫(yī)學(xué)中心診斷過，或者有醫(yī)療成本和治療費(fèi)用價(jià)目呈現(xiàn)的既往病例）。該研究發(fā)現(xiàn)基于rWGS的診斷讓醫(yī)療成本降低了80萬美元，并將住院時(shí)間縮短了124 d；認(rèn)為對重癥監(jiān)護(hù)室中疑似患有遺傳病的患兒進(jìn)行rWGS診斷，不但能夠挽救患兒的生命，而且具有良好的成本效益。經(jīng)過rWGS診斷后43%的患兒獲得了診斷，節(jié)省醫(yī)療保健費(fèi)用近13萬美元；其中11例患兒避免了并發(fā)癥，4例患兒避免了嚴(yán)重并發(fā)癥。

3 人工智能快速全基因組自動(dòng)分析診斷系統(tǒng)的建立及關(guān)鍵技術(shù)簡介和臨床驗(yàn)證

2019年rWGS進(jìn)一步發(fā)展，與人工智能有機(jī)結(jié)合，組成了人工智能快速全基因組自動(dòng)分析診斷系統(tǒng)[9]，也被稱為urWGS。該系統(tǒng)所采納的數(shù)據(jù)一是來源于血標(biāo)本的rWGS產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)，二是來源于患兒臨床資料的電子病歷（electronic health record, EHR）。在自動(dòng)分析的過程中集成了目前在基因組測序、人工智能領(lǐng)域的多種新興技術(shù)[17‐19]：美國Illumina公司的Nextera DNA Flex Library Prep Kit直接從血樣或干血斑（常規(guī)應(yīng)用于新生兒疾病篩查）中快速制備基因組文庫，之后采用NovaSeq 6000測序儀搭配S1型流動(dòng)槽，在平均15.5 h內(nèi)完成基因組測序；DRAGEN Bio‐IT生物信息分析平臺(tái)可在20 min內(nèi)完成1個(gè)人類基因組的30X測序數(shù)據(jù)的分析，并自動(dòng)將所讀序列與參考基因組對齊，識(shí)別和分析核苷酸變異。英國Clinithink公司的臨床自然語言處理平臺(tái)CliX ENRICH可在20 s內(nèi)梳理患者的EHR并自動(dòng)提取關(guān)鍵表型信息，并將EHR中提取的表型特征從臨床術(shù)語概念自動(dòng)轉(zhuǎn)換為可直接服務(wù)于遺傳報(bào)告分析的標(biāo)準(zhǔn)人類表型術(shù)語；Diploid開發(fā)的MOON系統(tǒng)自動(dòng)解析基因組，并對疑似致病變異進(jìn)行自動(dòng)過濾和篩查；深度集成現(xiàn)有遺傳性疾病知識(shí)庫和自然語言處理醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)驅(qū)動(dòng)基因變異的自動(dòng)解讀，可在5 min內(nèi)在全基因組450萬個(gè)基因變異中篩選致病變異。上述技術(shù)流程有機(jī)結(jié)合可最終在24 h內(nèi)為疑似遺傳病重癥兒童提供快速診斷。

利用該系統(tǒng)，研究人員針對圣地亞哥兒童醫(yī)院的101例患有105種遺傳病的患兒開展回顧性分析，在表型提取階段，臨床自然語言處理技術(shù)提取的患者表型數(shù)據(jù)比專家提取的表型數(shù)據(jù)多27倍，同時(shí)比在線人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM）數(shù)據(jù)庫中匹配遺傳疾病的預(yù)期表型特征高出4倍，顯示臨床自然語言處理技術(shù)提取表型的高效率和高的覆蓋率。以專家診斷結(jié)果作為參照，該自動(dòng)化診斷系統(tǒng)的精確度為99%（93/94），查全率為97%（94/97）[9]。為進(jìn)一步驗(yàn)證診斷系統(tǒng)的有效性，研究人員利用該系統(tǒng)在7例重癥嬰兒中開展了前瞻性研究，其中3例患兒診斷為遺傳性疾病，均通過人工分析方法和Sanger測序證實(shí)。第1例女，7周齡，因酮癥酸中毒入住PICU，在血標(biāo)本送檢及EHR建檔后19.2 h，自動(dòng)診斷系統(tǒng)識(shí)別出了胰島素基因中先前未報(bào)道的雜合錯(cuò)義變異（c.26C＞G，pPro9Arg）與常染色體顯性永久性新生兒糖尿?。∣MIM疾病記錄606176）相關(guān)。第2例是1個(gè)既往健康的17月齡男孩，因敗血癥性休克、代謝性酸中毒、壞疽性膿腫和低丙種球蛋白血癥住院。單例、先證者、快速測序和自動(dòng)解釋鑒定出存在布魯頓酪氨酸激酶基因中的致病性雜合突變（c.974+2T＞C）與X‐連鎖的無丙種球蛋白血癥（OMIM #300755）相關(guān)。為大劑量靜脈注射免疫球蛋白和6周抗生素治療提供了治療指導(dǎo)和治療信心。第3例為3日齡男孩因反復(fù)驚厥并家族史收住NICU。自動(dòng)診斷系統(tǒng)鑒定為鉀離子電壓門控通道kqt樣亞家族成員2基因中可能致病的雜合變異（c.1051C＞G），該基因與常染色體顯性良性家族性新生兒癲癇（OMIM 121200）發(fā)作相關(guān)，診斷時(shí)長為20.9 h。

人工智能rWGS的診斷效率在后續(xù)開展的第二項(xiàng)隨機(jī)對照試驗(yàn)中[20]也得以體現(xiàn)。該試驗(yàn)的研究結(jié)果在2019年10月發(fā)表：213例嬰兒中24例（11%）因病情嚴(yán)重直接給予urWGS檢測，其余隨機(jī)分為rWES組95例，rWGS組94例。后兩者的診斷率分別為19%和20%，診斷時(shí)長的中位數(shù)分別是11.0 d和11.2 d，無明顯差異。但在分析可能影響蛋白功能的變異和ClinVar數(shù)據(jù)庫收錄的致病性/可能致病性的變異上，rWGS的分析性能明顯優(yōu)于rWES。而在這一組病例中urWGS診斷的比例（11/24，46%）高于rWES及rWGS，且診斷結(jié)果時(shí)間更短（平均4.6 d），提示urWGS在臨床應(yīng)用上的良好前景。

綜上，人工智能快速全基因組自動(dòng)分析診斷系統(tǒng)的開發(fā)為促進(jìn)基因測序技術(shù)成為兒童尤其是NICU/PICU重癥患兒的一線診斷檢測手段提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。診斷流程的自動(dòng)化有助于減少經(jīng)驗(yàn)稀缺的臨床醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)家的人工分析和數(shù)據(jù)解釋的需求，減少臨床診斷中數(shù)據(jù)分析和解讀的耗時(shí)，消除WGS臨床應(yīng)用的障礙。但該系統(tǒng)向臨床的推廣仍會(huì)面臨一些障礙，自動(dòng)化的平臺(tái)需要進(jìn)行一定程度的改裝才能在不同的醫(yī)院體系中實(shí)施，特別是針對不同文化和環(huán)境，其中部分技術(shù)還不完善，中文環(huán)境下的患者表型自動(dòng)采集將是首先面臨的困難。其次，進(jìn)行rWGS檢測的最佳時(shí)機(jī)也有待進(jìn)一步探索，開展rWGS所需的費(fèi)用昂貴也將是推廣應(yīng)用的一個(gè)障礙。再就是該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于臨床所面臨的倫理問題[21‐22]：從樣本的選擇性送檢、家長的知情同意到以rWGS診斷為基礎(chǔ)決定是否姑息治療或是積極救治的疾病管理過程均涉及到倫理問題，是該項(xiàng)技術(shù)發(fā)展必須面臨且需要不斷討論的問題；而且關(guān)于在NICU/PICU環(huán)境下對嬰兒進(jìn)行rWGS的潛在風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)據(jù)尚收集或預(yù)估不足等[23]。但毫無疑問早期快速的基因診斷對危重癥患兒臨床管理決策、家庭治療選擇、遠(yuǎn)期預(yù)后評估及醫(yī)療系統(tǒng)的資源調(diào)配具有重大或決定性意義，相信危重癥患兒早期快速精準(zhǔn)診療的時(shí)代即將到來。