蛋白質組學分析在年齡相關性黃斑變性研究中的應用

楊帆 綜述 孫曉東 審校

上海市第一人民醫(yī)院眼科 國家眼部疾病臨床醫(yī)學研究中心 上海市眼底病重點實驗室 上海眼視覺與光醫(yī)學工程技術研究中心 上海市眼科疾病精準診療工程技術研究中心 200080

1 概述

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是造成全世界老年人群發(fā)生不可逆性盲的主要原因[1-2]。美國疾病控制和預防中心調查顯示，目前有超過175萬40歲及以上的美國人受到AMD的影響，預計這一數字到2020年將升至295萬[3]。在亞洲，由于人口老齡化的影響，AMD的患病率將會在接下來的幾十年中急劇增加[3]。早期AMD通常不伴隨明顯的臨床表現，但眼底檢查可以發(fā)現玻璃膜疣(drusen)的沉積和色素的改變，終末期表現為地圖樣萎縮和/或脈絡膜新生血管的生成。新生血管性AMD(neovascular AMD，nAMD)，僅占AMD總數的10%，但其致盲患者數占AMD致盲總人數的90%[1]。AMD最大的風險因素是年齡的增長，除此之外，遺傳變異和環(huán)境因素(特別是吸煙)也被證明為AMD的重要致病因素[4-9]，同時血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的病理性表達已經被證實為nAMD的重要致病機制之一[10]?？筕EGF治療是nAMD的一線治療方案，能夠有效改善視網膜水腫并提高患者的視力；但隨著治療的延長，越來越多的患者表現出對藥物的不敏感，甚至出現了病情的反復或加重[11-12]。因此，尋找到全新的治療靶點顯得更加必要和緊迫。

“蛋白質組學”一詞是1995年從基因組學和蛋白質學的結合中創(chuàng)造出來的[13]。蛋白質組學包括對所有蛋白質的鑒定及其功能和結構的研究。蛋白質組學研究的一般工作流程包括樣品選擇、蛋白質提取、蛋白質或肽段的制備、蛋白質/肽段的分離、蛋白質/肽段的鑒定和定量，以及對所獲得的定量數據的統(tǒng)計處理和使用生物信息學對結果的解釋[14-15]。為了降低蛋白質組學研究的復雜性，一些細胞分區(qū)如“分泌組”(研究體液或細胞培養(yǎng)上清液中的分泌蛋白)、“細胞表面蛋白質組”、“磷酸化蛋白質組”和“相互作用組”(研究在細胞中發(fā)生的一系列蛋白質-蛋白質相互作用)等概念相繼被提出[16]。臨床蛋白質組學常用的定量方法為凝膠基聚丙烯酰胺凝膠電泳和二維差異凝膠電泳以及無凝膠同位素標記技術。無凝膠方法包括用于相對和絕對定量的同量異位標簽，利用細胞培養(yǎng)物中的氨基酸進行穩(wěn)定同位素標記以及無標記定量，其可以克服凝膠方法在分析低豐度、不溶性或大分子量蛋白質時繁瑣且低效率等諸多缺點[17-18]。

近年來，蛋白質組學逐漸成為視覺科學研究工作的一部分，旨在提高對健康和疾病中眼功能的理解[19]。早期眼蛋白質組學研究重點是對眼特定成分中存在的離子和蛋白進行描述，隨著技術的進步，研究方向開始轉向帶有生物功能的翻譯后修飾[20]。2012年，人眼蛋白質組計劃作為人類蛋白質組計劃的一部分正式啟動[21]。到目前為止，包括來自AMD患者或健康人的血漿、玻璃體、房水、視網膜、脈絡膜、視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞等多種組織和細胞的蛋白質組學數據已經得到較為全面的展示[22-25]。本文對蛋白質組學技術在AMD中的應用進展進行綜述。

2 蛋白質組學在AMD中的應用

2.1 血液蛋白質組學分析

由于特殊的免疫背景及血-視網膜屏障的存在，眼部病變中蛋白種類和含量的變化很難通過血液體現出來，但由于血液標本更易獲得且操作更加安全穩(wěn)定，目前仍然存在基于血液標本的眼蛋白質組學研究。高豐度蛋白質一直是血液蛋白質組學分析的一個難點。

Xu等[26]利用比較蛋白質組學從26例AMD患者以及6位健康志愿者的血漿標本鑒定出28個有顯著改變的蛋白，這些蛋白的生物功能包括免疫應答、細胞生長、決定細胞命運、傷口愈合和代謝等多個方面。Kim等[27]研究發(fā)現，膜相關蛋白紐蛋白為nAMD的潛在血漿生物標志物，且通過紐蛋白與AMD風險基因年齡相關性黃斑疾病易感性2(age-related maculopathy susceptibility 2，ARMS2)基因和補體因子H(complement factor H，CFH)基因的受試者工作特征曲線(Receiver operating characteristic，ROC)曲線分析顯示，紐蛋白結合基因建模能夠對AMD進行更加精確地區(qū)分和診斷。Kim等[28]在后續(xù)的研究中還發(fā)現，與健康人相比，AMD患者血漿中磷脂轉移蛋白和甘露聚糖結合凝集素絲氨酸蛋白酶-1的表達量均有增加，且在晚期nAMD患者中增加更為明顯，該2種蛋白與ARSM2和CFH基因類型組合建模同樣增強對AMD的鑒別能力。Arya等[29]研究通過將具有CFH變體(T1277C)基因并同時視網膜下沉淀物中結合有球狀羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)的個體與野生型以及單純CFH基因突變個體的血漿進行對比，發(fā)現血液中6種蛋白的濃度受到CFH基因突變的影響，明確了遺傳差異在視網膜下沉積物形成中的相關定性和定量信息。由于drusen等視網膜下沉積物的形成發(fā)生在AMD疾病過程的極早期，這個發(fā)現提示我們與HAP結合的關鍵蛋白可以減緩甚至防止drusen的形成，進而提供一種在疾病早期強有力的預防和治療策略。以上這些研究結果證明對AMD患者的血漿進行蛋白質組學分析不僅能夠找到疾病相關的生物標志物，還能將這些結果與基因型相結合提高對疾病的鑒別和診斷；另外對于疾病早期血液蛋白生物標志物的篩選，不僅能夠加深我們對疾病相關機制的認識，甚至會可能改變AMD患者的診斷和治療。

2.2 淚液蛋白質組學分析

淚液由淚腺、瞼板腺、附屬腺體和杯狀細胞產生，覆蓋在眼表面，起到保護、潤滑和營養(yǎng)的作用[30]。由于淚液樣本的獲取容易且無創(chuàng)，淚液一直作為蛋白質組學研究各種眼部和全身疾病，如干眼癥[31-32]，糖尿病[33]等的樣本。

Winiarczyk等[34]對14例AMD患者和6例對照組患者的淚液進行蛋白質組學分析，共鑒定出了110種nAMD特異性表達蛋白以及97種干性AMD特異性表達蛋白。nAMD中的特異性表達蛋白主要參與吞噬作用、炎癥、蛋白質水解的調節(jié)或者在細胞骨架功能中起關鍵作用，而在干性AMD特異性表達蛋白則主要參與氧化應激、炎癥和蛋白水解等生物功能過程；該研究還發(fā)現10種熱休克蛋白(heat shock protein，Hsp)90相關蛋白在2種類型AMD淚液中高表達，其可能成為未來藥物靶標的方向。另外，Winiarczyk等[34]在淚液中首次鑒定了8種與AMD疾病相關的新的蛋白，如SRC激酶信號傳導抑制劑，Graves病載體蛋白和蛋白S100-A7A等。這些蛋白補充了對AMD發(fā)病機制的認識，也提供了該特定蛋白在AMD患者淚液中表達的證據。

2.3 房水蛋白質組學分析

房水是一種重要的眼內液體，負責向眼內無血管組織提供營養(yǎng)物質并帶走代謝廢物。房水蛋白水平在眼前后節(jié)疾病中均發(fā)生改變，表明房水蛋白可能在其發(fā)病機制中發(fā)揮作用[35-36]。與血清相比，房水中蛋白質濃度較低，為0.20～0.5 mg/ml，且存在一些高豐度蛋白如白蛋白、球蛋白和轉鐵蛋白等，這為房水蛋白質組學研究帶來了新的挑戰(zhàn)[37]。

Kim等[38]對nAMD患者房水進行全蛋白質組成分分析，鑒定出10種新的房水蛋白質，并發(fā)現nAMD患者房水蛋白主要參與急性期反應、補體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)等信號通路；通過篩選潛在的生物標志物發(fā)現，與對照組相比，nAMD患者房水中轉化生長因子-β誘導蛋白ig-h3、血漿蛋白酶C1抑制劑和血漿銅藍蛋白有著更高的相對豐度且可以作為疾病的生物標志物和治療的靶點。Yao等[39]檢測并對比了6例nAMD和6例白內障患者房水中蛋白的組成，發(fā)現差異表達的蛋白主要與炎癥、細胞凋亡、血管生成和氧化應激有關，其中nAMD患者房水中載脂蛋白-1的表達量顯著增加，該蛋白是潛在的脂質過氧化產物的清除劑，其可能在nAMD中起到保護作用。

除了對房水中所有蛋白質成分及表達水平變化的研究外，還有一些研究重點關注了房水中某些特定的蛋白群體。有證據表明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)的抑制會導致RPE細胞中毒性蛋白和炎性成分的積累，Lee等[40]對nAMD患者和對照者的房水進行蛋白質組學的分析后，鑒定出了6種UPS相關蛋白，包括26S蛋白酶體非三磷酸腺苷酶調節(jié)亞基1(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 1 r，Rpn2)在內的4種蛋白在AMD患者房水中含量較高，其中Rpn2的表達量在治療前、后均高于對照組，提示該蛋白可能為nAMD的生物標志物。Kang等[41]收集nAMD患者抗VEGF治療前及治療后房水，對其中外泌體蛋白的分析結果顯示，在nAMD患者的房水中有6種蛋白表達增加，其中細胞角蛋白8在ROC曲線分析中表現最好，但其是否為生物標志物還需要進一步驗證。隨后Park等[42]研究證明了nAMD患者房水中Wnt抑制因子-1(Wnt inhibitory factor 1，WIF-1)和Dickkopf相關蛋白3表達上調，且WIF-1與視網膜結構損傷的情況相關，首次將蛋白與疾病的解剖學和表型進行聯系，使得被鑒定到的蛋白不僅可以作為疾病診斷的生物標志物，還能作為疾病進展程度及預后情況的預測分子。

Baek等[43]對干性AMD患者的房水標本進行了去除高豐度蛋白后的全蛋白質組學分析，共定量到119個房水蛋白，有3個蛋白之前并未發(fā)現在drusen中存在或與干性AMD有聯系，其中上調的Lumican蛋白和角膜蛋白多糖(Keratocan)均與細胞外基質的調節(jié)相關。

以上對于AMD患者房水樣本的蛋白質組學分析表明房水中某種或某類特定蛋白的表達能夠受到疾病的影響，這些變化不僅僅局限于對新生血管的調節(jié)，還與氧化應激、免疫調節(jié)等方面有很大的相關性。房水生物標志物的篩選除了應用于疾病診斷外，還在疾病分級和預后判斷上起到重要作用。

2.4 玻璃體液蛋白質組學分析

眼內液體包括房水和玻璃體液。從解剖學角度來講，玻璃體液與視網膜、RPE細胞等眼底組織和細胞的距離較房水更近，理論上更能直接地體現出眼底病變時對蛋白質的影響。

Koss等[44]應用毛細管電泳結合質譜分析73例初次接受治療的nAMD患者及15例特發(fā)性玻璃體混濁患者的玻璃體液樣本并鑒定AMD的潛在蛋白標記物，發(fā)現nAMD患者的玻璃體液中19種蛋白質上調，這些蛋白多由血漿衍生，參與生物(離子)轉運、急性期炎癥反應和血液凝固過程；對隨機選擇的5種蛋白質進行驗證顯示α-1-抗胰蛋白酶為AMD的潛在蛋白標記物。Nobl等[45]在132例nAMD患者玻璃體液標本中鑒定出101種差異表達蛋白質，使用嚴格的統(tǒng)計分析并實施封閉測試程序后篩選出候選生物標志物后，后續(xù)ELISA驗證結果顯示叢集素蛋白和色素上皮衍生因子在nAMD患者玻璃體液中顯著增加。

除了橫向探究AMD患者璃體液標本中的生物標志物外，Ecker等[46]首次完成了連續(xù)監(jiān)測nAMD患者玻璃體液蛋白質組變化的前瞻性研究；該研究利用反相蛋白質微陣列技術測量了標本中37種蛋白質的表達水平，并將其變化與視網膜下水腫(subretinal fluid，SRF)厚度進行相關性分析，發(fā)現基質金屬蛋白酶9水平隨SRF厚度的變化而發(fā)生改變，這為繼續(xù)探究nAMD病情變化的相關分子機制提供了基礎。

由于樣本采集的特殊性，目前對于AMD患者玻璃體樣本的研究數量較少且主要集中于nAMD人群。在以上3個研究中，研究者們通過對比找到了nAMD的生物標志物，并完成了對玻璃體內蛋白質變化情況的監(jiān)測，這使得疾病中的某一病理特征與特定蛋白表達水平相聯系，有助于實現精準治療。

2.5 視網膜和脈絡膜蛋白質組學分析

視網膜的不同區(qū)域在分子構成上是有差異的，分別發(fā)揮著獨特的功能并體現出對疾病的不同易感性。對這些區(qū)域和層次中每一個部分進行單獨的蛋白質組學分析可以提供對疾病機制的多角度見解，包括AMD、糖尿病和青光眼等。因此在進行蛋白質組學分析之前，對視網膜進行區(qū)域和層次的分離是必要的[47-48]。而作為受AMD疾病影響最大的眼底組織，脈絡膜的蛋白質組學分析更能精準地體現不同階段及不同類型AMD的分子機制。

Ethen等[49]將從人AMD供體上獲得的視網膜樣本按照黃斑視網膜和周邊視網膜分別進行蛋白質組學分析并按照疾病進展分為4期，研究發(fā)現共有26種蛋白的表達水平隨著疾病嚴重程度的改變發(fā)生變化，其中參與微管調節(jié)的蛋白在AMD發(fā)病的早期發(fā)揮作用，包括微管蛋白、prefoldin-1、T-復合多肽1、共因子a和微管不穩(wěn)定蛋白；同時該研究還發(fā)現雖然黃斑區(qū)與周邊區(qū)視網膜有超過一半的蛋白表達存在差異，但是兩個區(qū)域仍有40%的蛋白變化一致，表明AMD引起的病理變化涉及到全視網膜而不僅僅局限于黃斑部位。同樣的，Yuan等[50]將獲得的AMD患者及健康對照者去世后捐獻Bruch膜/脈絡膜復合體的樣本按照疾病的不同階段進行分類，在鑒定出的901種蛋白質中，大多數蛋白在AMD和對照樣品之間的差異很小，而根據疾病進展的不同進行分析顯示升高的蛋白中大約60%參與免疫反應和宿主防御過程；同時該研究結果顯示，RPE65、細胞視黃酸結合蛋白1(cellular retinoic acid-binding protein 1，CRABP1)、細胞視黃醛結合蛋白以及視黃酸受體間結合蛋白這4種視黃酸加工蛋白表達僅在早/中期AMD患者Bruch膜/脈絡膜復合體中升高，表明這些蛋白在AMD發(fā)病起始中發(fā)揮作用；而晚期糖基化終產物受體半乳糖凝集素3表達在晚期干性AMD患者Bruch膜/脈絡膜復合體中升高明顯，提示晚期糖基化終產物在干性AMD進展中發(fā)揮作用。以上這些結果均證實了不同階段和不同類型的AMD涉及的蛋白及分子途徑不同。

Sohn等[51]使用雙向電泳和/或質譜法來評估114只人眼脈絡膜-RPE復合體薄、厚脈絡膜間的蛋白差異，在較厚的脈絡膜中絲氨酸蛋白酶SERPINA3水平較高，而在薄的脈絡膜中金屬蛋白酶組織抑制劑-3表達水平較高。這種蛋白酶和蛋白酶抑制劑之間的失衡不僅有利于我們更好理解脈絡膜變薄的相關機制，同時還能指導開發(fā)AMD新療法。

綜上，就目前的研究而言，對于AMD患者視網膜和脈絡膜組織的蛋白質組學分析大多根據解剖結構和疾病分期來分類，盡管這可能損失掉部分對某一特定類型AMD的分析結果，但這樣的分析方法與很多臨床上對于疾病的研究相一致，這使得蛋白質組學數據能與臨床數據相匹配并在一定程度上支撐和解釋臨床相關結果。

2.6 Drusen蛋白質組學分析

無論遺傳和環(huán)境因素如何，AMD患者早期的一個關鍵的表現是drusen的形成，這種包含脂質和炎性廢物的細胞外沉積物隨著年齡的增長積聚在RPE下方Bruch膜上，但drusen形成的具體分子機制尚未明確[19]。

Crabb等[52]開發(fā)了一種分離微克量級drusen和Bruch膜的方法用于蛋白質組分析，結果顯示在AMD患者的drusen中晶狀體蛋白更常見，此外還發(fā)現蛋白質的氧化修飾在AMD的發(fā)病機制中起到了關鍵作用。這些結果與在動物實驗中的發(fā)現保持一致[53]。

2.7 RPE細胞蛋白質組學分析

RPE細胞是血-視網膜屏障的關鍵組成部分，且是人體中具有最高吞噬活性的細胞，能通過吞噬并回收光感受器外節(jié)來維持視網膜的健康，因此RPE細胞發(fā)生功能障礙或死亡可導致光感受器細胞的減少，對AMD的發(fā)生及發(fā)展起到了十分關鍵的影響[19]。早期一系列重要的圍繞RPE細胞展開的蛋白質組學研究大多以脂褐素為中心，脂褐素是一種由不同類別生物分子混合在一起的復雜混合物，且其中許多成分都存在氧化修飾[19]。由于脂褐素與AMD密切相關，闡明其詳細分子組成對于理解AMD具有十分重要的意義。

有研究檢測并對比了視網膜脂褐素和黑色素脂褐素的蛋白組成，證實了人脂褐素蛋白中氧化修飾的存在，同時發(fā)現了2者存在來源的差異[54-55]。然而在Ng等[56]研究卻發(fā)現，從RPE中分離出的脂褐素顆粒雖然存在蛋白質氧化修飾，但所占比例很小，這暗示著脂褐素致病機制可能并不依賴于相關蛋白質氧化修飾來發(fā)揮作用。

Nordgaard等[57]對來自AMD患者供體的原代RPE細胞進行了全蛋白質組學分析，通過比較四個階段AMD的RPE蛋白質組成，鑒定出早期疾病階段的蛋白標志物，包括Hsp(如Hsp70等)和凋亡信號通路(如αA晶狀體蛋白等)的成分，其中一些蛋白與線粒體功能相關，晚期AMD衍生的RPE細胞顯示蛋白質的變化與類視黃醇相關功能的擾動有關，如CRABP1表達水平的改變?；诖搜芯拷Y果，該團隊使用相同的方法學策略專注于探究RPE細胞中的線粒體蛋白質組，結果顯示，線粒體翻譯和延伸所必需的線粒體延伸因子Tu在早期AMD階段RPE細胞中過表達，ATP合酶復合物的幾個亞基在3期和4期AMD的RPE細胞中的表達水平降低，參與核編碼蛋白質向線粒體的轉運的線粒體熱休克蛋白70在晚期AMD階段RPE細胞中表達降低，這些均表明在AMD的整個階段中均存在線粒體功能障礙，具體機制可能與線粒體翻譯，核編碼蛋白導入和ATP合成酶活性的改變有關[58]。

除了探討RPE細胞本身及其內部成分，An等[59]對來自于AMD供體和原代RPE細胞的分泌蛋白組進行了分析，發(fā)現RPE細胞分泌多種細胞外基質蛋白，補體因子和蛋白酶抑制劑，2個組間差異蛋白主要參與組織發(fā)育、血管生成以及補體調節(jié)和蛋白質聚集。在后續(xù)的研究中，該團隊還發(fā)現在AMD的發(fā)病機制中，高溫必需蛋白A1(high temperature requirement A1，HTRA1)與補體調節(jié)和淀粉樣蛋白沉積之間存在關聯[60]。

這些研究的結論與前文所述其他樣本來源研究在整體上并無明顯差異，對于AMD疾病的蛋白質組學研究從人體組織或液體過渡到細胞層面使得我們在實驗室開展相關蛋白驗證和疾病機制的探索變得更加直接。

3 蛋白質組學在AMD應用中面臨的挑戰(zhàn)和前景展望

作為nAMD的一線治療方案，盡管抗VEGF療法已經取得了突出的成績，但仍有約10%的患者并不能從中受益，且大量研究顯示這可能與特定的遺傳學因素相關，主要包括VEGF相關基因、補體相關基因、白細胞介素相關基因、ARMS2和HTRA1等[61]。在過去的十年中，遺傳學被認為是AMD發(fā)展的一個重要危險因素。然而，最近的一項有史以來最大樣本量隊列研究表明，即使納入19個基因位點對AMD進行預測，結果依然顯示遺傳因素對AMD進行預測的準確性較低[62]。因此，使用蛋白作為生物標志物或許可以對疾病的發(fā)生和發(fā)展起到更好的預測作用，且目前研究顯示將蛋白質組學與基因結果相結合的分析方法能夠在疾病的診斷中表現得更為突出。目前利用蛋白質組學對AMD進行研究發(fā)現，差異蛋白主要集中于患者可能存在的氧化應激、炎癥、補體、細胞外基質調節(jié)等過程的紊亂，這提示我們可以將疾病治療的方向轉向這些方面來應對部分患者出現的抗VEGF治療無應答的情況。然而目前對出現抗VEGF治療無應答患者生物標志物的鑒定和相關機制的研究仍處于起步階段，我們課題組正在對有療效差異的兩組患者房水標本進行蛋白質組學檢測，盡管現在尚未得到確切的結論，但我相信通過我們的研究能夠幫助大家加深對疾病以及治療抵抗相關機制的理解和認識，同時提供在AMD疾病的預防、診斷和治療過程中的新思路。值得注意的是，蛋白質組學在眼部疾病的應用中也具有局限性，如，眼部組織獲取的風險高，獲取樣本的量也相對較少等。另外，膜蛋白和低豐度蛋白質的分析也是眼部蛋白質組學研究的主要限制。與其他學科的研究一樣，眼科蛋白質組學不僅僅局限于疾病中差異表達蛋白的篩選，接下來的一項主要任務是嘗試對蛋白質進行功能學鑒定，這包括對蛋白質相互作用和反應以后修飾的研究。未來應用于AMD的蛋白質組學研究不僅要克服以上困難，還應注重治療前后發(fā)生的蛋白分子變化[63]以及擴大樣本量，總結現有研究并開辟新的研究方向。

總之，盡管蛋白質組學在AMD中的應用面臨著不小的挑戰(zhàn)，但是由于其對疾病宏觀認識的支持以及深入探索疾病相關機制的巨大潛力，該項技術在AMD和其他眼部疾病中具有廣闊的應用空間。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突