微藻細(xì)胞破碎及蛋白質(zhì)提取純化技術(shù)研究進(jìn)展

張?jiān)屏?，朵慧，張?yáng)陽(yáng)，栗金富，徐麗萍*，竇博鑫*

1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院（哈爾濱 150076）；2.蘭州蘭生血液制品有限公司（蘭州 730030）

由于人口增加與采用富含蛋白質(zhì)的飲食，眾多國(guó)家蛋白質(zhì)消耗量增加，且隨著人類(lèi)生活水平的不斷提高，這種影響可能會(huì)加劇，因此篩選對(duì)環(huán)境友好的新型蛋白質(zhì)來(lái)源非常重要。微藻是一種廣泛存在于陸地與海洋中的植物，其胞體內(nèi)具有眾多不飽和脂肪酸、功能性蛋白質(zhì)、多糖等對(duì)人體有益的物質(zhì)[1-4]，且具有環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)、培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)占地面積小等眾多優(yōu)點(diǎn)[5-6]，但由于微藻加工成本及耗能高等一系列瓶頸問(wèn)題的存在，微藻蛋白質(zhì)至今難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。

微藻細(xì)胞壁對(duì)生物活性物質(zhì)的提取具有極大的影響[7-8]，大部分微藻細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，諸如小球藻和柵藻有兩層細(xì)胞壁，紅球藻有三層細(xì)胞壁，萊茵衣藻有五層細(xì)胞壁[7,9]。因此，為提高微藻細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取率，必須利用機(jī)械或非機(jī)械破碎的方法對(duì)微藻的細(xì)胞壁進(jìn)行破碎處理，且選擇合適的破碎技術(shù)與破碎力度對(duì)于提取微藻蛋白質(zhì)具有決定性的作用。綜述主要探討了傳統(tǒng)細(xì)胞破碎方法中的珠磨法、超聲處理法、生物酶解法與新興細(xì)胞破碎方法動(dòng)態(tài)高壓微射流處理法、超臨界流體空化法、多針-板電暈放電法及純化雙水相萃取法7種微藻細(xì)胞破碎技術(shù)及蛋白質(zhì)提取技術(shù)的研究進(jìn)展與研究方向，為日后微藻細(xì)胞破碎提取內(nèi)容物提供技術(shù)參考。

1 傳統(tǒng)細(xì)胞破碎處理方法

1.1 珠磨法

傳統(tǒng)細(xì)胞破碎方法中的珠磨法被認(rèn)為是最有利于放大為工業(yè)生產(chǎn)的細(xì)胞破碎方法之一。珠磨法是通過(guò)器械腔體內(nèi)的磨珠高速轉(zhuǎn)動(dòng)，機(jī)軸的不斷轉(zhuǎn)動(dòng)帶動(dòng)腔體內(nèi)微藻細(xì)胞與珠磨之間相互碰撞、剪切，從而造成微藻細(xì)胞的破碎，使內(nèi)容物溶出[10]。珠磨法可連續(xù)應(yīng)用于細(xì)胞破碎且細(xì)胞破碎率高，通過(guò)球磨機(jī)自身所帶的冷卻水冷卻系統(tǒng)，能很好地控制細(xì)胞破碎過(guò)程中溫度的升高，利用于工業(yè)化生產(chǎn)具有極高的可能性。

目前珠磨法已被廣泛應(yīng)用于微藻細(xì)胞蛋白質(zhì)與油脂的提取過(guò)程中，Safi等[11]通過(guò)研究不同細(xì)胞破碎方法表明高壓勻漿法與珠磨法在細(xì)胞破碎釋放蛋白質(zhì)中最為有效，細(xì)胞崩解率＞95%，總蛋白釋放量達(dá)50%，且能量輸入較脈沖電場(chǎng)處理法低數(shù)十倍，該研究表明珠磨法是一種耗能低、蛋白質(zhì)釋放率高的細(xì)胞破碎技術(shù)。Alavijeh等[12]采用珠磨法-酶水解相結(jié)合的方法，將細(xì)胞經(jīng)球磨處理后，用不同的水解酶水解，單純珠磨法脂類(lèi)、碳水化合物和蛋白質(zhì)的回收率分別為75%，31%和40%，而采用酶處理可顯著提高此結(jié)果，各組分的回收率均達(dá)到最大值，固相可得88%油脂，液相可分離出74%的碳水化合物和68%的蛋白質(zhì)，故在研究應(yīng)用過(guò)程中生物酶解技術(shù)與物理珠磨法的結(jié)合更有利于微藻細(xì)胞蛋白質(zhì)溶出。劉習(xí)軍[13]通過(guò)利用超聲波輔助渦輪式珠磨機(jī)破碎球藻細(xì)胞，表明輔用超聲波法后，珠磨法破碎細(xì)胞時(shí)間由35 min降至20 min，且細(xì)胞破壁率達(dá)到95%以上，可促進(jìn)珠磨法在工業(yè)中的應(yīng)用。由此可見(jiàn)，細(xì)胞破碎技術(shù)的結(jié)合使用比單獨(dú)使用一種破碎方法蛋白質(zhì)溶出率更高、溶出時(shí)間更短，除此之外的其他結(jié)合方法與實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用有待日后科研人員的研究探討。

1.2 超聲處理法

超聲波處理法是通過(guò)超聲波高強(qiáng)度聲能輸入下達(dá)到細(xì)胞破碎的一種方法[14-15]。此方法與超聲波空化現(xiàn)象相關(guān)[16]，超聲處理法通過(guò)高強(qiáng)度聲能的輸入，使含有微藻細(xì)胞的溶液局部出現(xiàn)負(fù)壓區(qū)，進(jìn)而在負(fù)壓區(qū)形成大量的空泡與微小的氣泡，負(fù)壓區(qū)的氣泡穩(wěn)定性極差，產(chǎn)生后不久便會(huì)破碎，當(dāng)大量的氣泡破損的瞬間將產(chǎn)生較大的爆破壓力，從而產(chǎn)生劇烈的沖擊波，在沖擊波的作用下細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)受到?jīng)_擊而破碎內(nèi)容物溶出[13]。

Schwede等[17]、Lee等[18]、Lee等[19]研究表明利用超聲波處理法進(jìn)行細(xì)胞破碎，破壁率與超聲波振幅、頻率、超聲處理時(shí)間、細(xì)胞種類(lèi)等因素均有密切關(guān)系，處理過(guò)程各因素的試驗(yàn)參數(shù)需要按照不同細(xì)胞種類(lèi)進(jìn)行試驗(yàn)確定，不同因素間的互交作用有待進(jìn)一步研究。Al-Zuhair等[20]研究表明超聲處理參數(shù)為1 000 W、3 min時(shí)，柵藻和萊茵衣藻的蛋白質(zhì)提取率＞70%。Zhang等21]研究建立了乙醇浸泡、酶消化、超聲和均質(zhì)技術(shù)相結(jié)合的細(xì)胞破碎方法。利用該方法從微藻中提取了72.4%的蛋白質(zhì)，此結(jié)果微藻細(xì)胞蛋白質(zhì)溶出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Safi等[11]利用高壓勻漿法與珠磨法結(jié)合，總蛋白釋放量達(dá)50%，此研究也進(jìn)一步證實(shí)各破碎方法的結(jié)合是一種潛在的微藻蛋白提取方法，有助于微藻細(xì)胞蛋白資源在功能性食品和醫(yī)藥中的充分開(kāi)發(fā)利用，自此更多細(xì)胞破碎技術(shù)的互交作用的機(jī)理與應(yīng)用參數(shù)有待進(jìn)一步的探討。

1.3 生物酶解法

生物酶解法因其溫和的作用條件、高度的專(zhuān)一性早已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞破碎處理中，但高度專(zhuān)一性的酶篩選不易，且將生物酶解法應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)中成本較高，因此該法在細(xì)胞破碎工業(yè)化生產(chǎn)中的利用具有一定的困難。

張睿林[22]通過(guò)生物酶解、乙醇浸泡、超聲處理與均質(zhì)處理結(jié)合提取球藻蛋白研究表明，利用纖維素酶pH 5.0條件下水解3 h，超聲處理功率1 000 W處理36 min，萃取10 min，蛋白提取率高達(dá)72.3%。相比Alavijeh等[12]采用珠磨法-酶水解相結(jié)合方法68%的蛋白質(zhì)溶出率更高。兩者研究的對(duì)比更進(jìn)一步證實(shí)了多種細(xì)胞破碎方法優(yōu)點(diǎn)的結(jié)合更有利于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的提取，但各個(gè)技術(shù)相互作用的影響、是否可進(jìn)行互交及參數(shù)的確定需進(jìn)一步研究。

生物酶解法應(yīng)用于細(xì)胞破碎雖條件溫和，有利于保留蛋白質(zhì)及功能性多肽的活性，但處理成本過(guò)高，現(xiàn)階段可考慮通過(guò)使用固定化酶技術(shù)將酶進(jìn)行固定化，實(shí)現(xiàn)生物酶的連續(xù)化使用，降低生產(chǎn)成本。在使用生物酶法處理過(guò)程當(dāng)中還需嚴(yán)格控制酶的處理溫度及pH等酶活性的關(guān)鍵影響因素，以防止在酶解過(guò)程中由于不當(dāng)操作而造成的酶變性失活。在今后研究過(guò)程中，也可致力于高度專(zhuān)一性、抗高壓、抗高溫酶的篩選，以適應(yīng)不同細(xì)胞破碎環(huán)境，進(jìn)而大幅度提高細(xì)胞破碎率及蛋白質(zhì)溶出率。

2 新興細(xì)胞破碎處理方法

2.1 動(dòng)態(tài)高壓微射流處理法

動(dòng)態(tài)高壓微射流處理法是一種耗能的新興高壓細(xì)胞破碎技術(shù)，該方法與傳統(tǒng)的高壓勻漿法不同，操作過(guò)程中碰撞所產(chǎn)生的能量更大、壓力更高。微射流法是通過(guò)將兩股含有細(xì)胞顆粒的懸濁液高速撞擊，利用細(xì)胞激烈撞擊時(shí)所產(chǎn)生的巨大瞬間能量，促使細(xì)胞破碎[23-24]，因此利用該法進(jìn)行細(xì)胞破碎的細(xì)胞破損率與細(xì)胞濃度、碰撞次數(shù)、處理壓力等因素具有直接聯(lián)系。由于該法是利用細(xì)胞劇烈碰撞產(chǎn)生能量而促使細(xì)胞破碎，故細(xì)胞破碎瞬間會(huì)產(chǎn)生大量的熱能，使操作室溫度急劇升高，因此如何高效控制操作室溫度、避免對(duì)細(xì)胞溶出物活性的影響還需進(jìn)一步探究。

Cha等[25]采用體外消化和人腸道Caco-2細(xì)胞模型，研究表明微射流處理可提高微藻細(xì)胞葉黃素膠束化效率，在68.96 MPa以上壓力下處理后，掃描電鏡觀察細(xì)胞平均粒徑由3.56 μm降至0.35 μm。與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，137.93 MPa條件下的微藻細(xì)胞水溶液微射流處理后生成葉黃素膠束的效率提高了3倍。Xia等[26]采用微射流和密度分離相結(jié)合的方法，從碎米中提取蛋白質(zhì)，輔以后續(xù)酶處理（淀粉酶和糖化酶）后，蛋白質(zhì)回收率高達(dá)81.87%，純度達(dá)87.89%，結(jié)果表明，酶輔助微射流技術(shù)是一種無(wú)破壞、選擇性提取蛋白的有效方法，但利用于微藻細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取工藝需進(jìn)一步研究。除生物酶解技術(shù)與微射流處理法結(jié)合作用于微藻細(xì)胞蛋白質(zhì)提取外，其他技術(shù)與高壓微射流處理相結(jié)合的作用與效果有待進(jìn)一步探討，進(jìn)一步發(fā)掘出使蛋白質(zhì)提取率更高的方法，而且如何使該方法能耗與產(chǎn)出相對(duì)合理分配，也需結(jié)合作用機(jī)理進(jìn)一步研究。

2.2 超臨界流體空化法

超臨界流體空化法是通過(guò)使用CO2、N2等利用高壓將其滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，再將高壓環(huán)境瞬時(shí)降為低壓環(huán)境，通過(guò)外壓環(huán)境的瞬間變化使細(xì)胞膨脹破裂的方法[27]。相比于傳統(tǒng)的珠磨法、高壓勻漿法與高壓微射流處理法，超臨界流體空化法避免了劇烈能量的變化而造成的溫度過(guò)高現(xiàn)象，亦避免了生物酶解處理過(guò)程中污染嚴(yán)重、雜質(zhì)增加、控制參數(shù)繁多等不利影響，是一種微藻細(xì)胞破碎處理的綠色、高效、穩(wěn)定的處理方法。

劉明磊[28]通過(guò)流體空化法對(duì)綠球藻細(xì)胞進(jìn)行破壁處理，當(dāng)破壁時(shí)間為30 min時(shí)，破壁率可達(dá)90%，改變處理壓力從0.1 MPa升至0.25 MPa時(shí)，綠球藻細(xì)胞破壁率提高了30%。胡愛(ài)軍等[29]采用超臨界CO2流體輔以超聲處理，在超臨界CO2流體處理海藻細(xì)胞破碎的同時(shí)輔以超聲處理法，兩種方法的結(jié)合不會(huì)破壞海藻細(xì)胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)，且能夠有效地增加海藻細(xì)胞內(nèi)二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的提取率。將超臨界CO2流體結(jié)合超聲處理的方法應(yīng)用于微藻細(xì)胞蛋白質(zhì)提取過(guò)程參數(shù)與對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響還待研究。Dierkes等[30]通過(guò)超臨界CO2流體處理淋球菌，使菌體細(xì)胞破碎內(nèi)容物脂質(zhì)與蝦青素溶出，兩種物質(zhì)提取率分別達(dá)80%與90%左右，相對(duì)于傳統(tǒng)細(xì)胞破碎方法，超臨界流體空化法清潔、高效的破碎效果使其在細(xì)胞破碎提取內(nèi)容物研究當(dāng)中具有很高的潛力。

2.3 多針-板電暈放電技術(shù)

多針-板電暈放電法是一種新型的細(xì)胞破壁提取內(nèi)容物的方法，該方法是通過(guò)將多余正負(fù)電荷中和而產(chǎn)生能量的過(guò)程，中和過(guò)程產(chǎn)生的能量將細(xì)胞壁與細(xì)胞膜電穿孔，使膜崩解，從而造成細(xì)胞內(nèi)容物溶出得以提取利用[31]。趙麗[32]通過(guò)研究利用多針-板電暈放電技術(shù)在電壓8 000 kV、處理時(shí)間1 min的條件下即可破碎藻體細(xì)胞，使藻體細(xì)胞內(nèi)溶物溶出，相較于其他細(xì)胞破碎方法，該方法處理時(shí)間短且高效，但該技術(shù)在微藻細(xì)胞破碎的相關(guān)研究較少，且如何控制高壓與放電方式等對(duì)于微藻細(xì)胞破碎的影響及參數(shù)的確定暫無(wú)相關(guān)詳細(xì)報(bào)道。

多針-板電暈放電技術(shù)操作簡(jiǎn)單且細(xì)胞破碎效率高、耗時(shí)短、破碎過(guò)程所需成本低，具有工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)利用的良好優(yōu)勢(shì)，但如何進(jìn)行規(guī)范進(jìn)行大規(guī)模使用、如何控制參數(shù)的變化、如何使用正確放電技術(shù)需相關(guān)研究進(jìn)一步探討。

3 雙水相萃取純化微藻蛋白

微藻細(xì)胞破碎后內(nèi)容物蛋白質(zhì)溶出還需進(jìn)行下一步分離純化以得到純度高的蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)的微藻蛋白分離純化的方法有羥基磷灰石層析法[33]、凝膠層析法[34]、離子交換法[35]等，這些傳統(tǒng)的方法在蛋白質(zhì)分離純化過(guò)程中步驟繁多、耗能大、分離周期長(zhǎng)，且在工業(yè)化生產(chǎn)利用過(guò)程中價(jià)格昂貴，故大批量生產(chǎn)困難。

雙水相萃取技術(shù)是使用多種物質(zhì)以一定比例的質(zhì)量分?jǐn)?shù)溶解于水中，以形成互不相容的水溶液體系，有聚合物-有機(jī)鹽-水、聚合物-聚合物-水、聚合物-無(wú)機(jī)鹽-水、表面活性劑-表面活性劑-水、有機(jī)溶劑-無(wú)機(jī)鹽-水等類(lèi)型[36]，與傳統(tǒng)分離純化的層析法相比，雙水相萃取法環(huán)保、純化效率高，通過(guò)與超濾、等電點(diǎn)沉淀、結(jié)晶等粗提取方法結(jié)合，更有利于細(xì)胞流出蛋白質(zhì)的純化。王巍杰等[37]利用一定比例濃度的PEG與酒石酸鉀鈉雙水相萃取，pH 6.0條件下在此雙水相體系中藻藍(lán)蛋白被萃取至上相，最高純度為3.69，回收率高達(dá)到94.56%。付麗麗等[38]利用PEG與酒石酸鉀鈉形成的雙水相體系進(jìn)行純化鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白，在pH 6.5條件下藻藍(lán)蛋白回收率達(dá)到93.07%。田盼盼等[39]通過(guò)建立逐級(jí)鹽析結(jié)合雙水相萃取技術(shù)，在不同濃度的(NH4)2SO4數(shù)次鹽析后得藻藍(lán)蛋白，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的聚乙二醇6000、18%的(NH4)2SO4進(jìn)行雙水相萃取。所得產(chǎn)物純度可達(dá)到8.6，回收率為71.40%。由此對(duì)比可得逐級(jí)鹽析與雙水相萃取結(jié)合的方法能顯著提高產(chǎn)物的純度。盛晶夢(mèng)等[40]采用粉末活性炭吸附與雙水相萃取法相結(jié)合，對(duì)藻藍(lán)蛋白進(jìn)行純化提取，利用PEG與硫酸鹽組成的雙相中進(jìn)行萃取，在pH 7.0條件下藻藍(lán)蛋白純化后純度達(dá)3.46，回收率達(dá)63%。雙水相萃取法與其他預(yù)處理或預(yù)提純等方法的結(jié)合與互作還需進(jìn)一步考察。

相比于傳統(tǒng)的萃取方法，雙水相萃取法在純化蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)的過(guò)程中，提供了溫和的大環(huán)境，在提取過(guò)程中避免了傳統(tǒng)萃取方法所造成的蛋白質(zhì)變性與活性破壞等不利影響，但雙水相萃取技術(shù)起步較晚，且雙相系統(tǒng)中所使用的聚合物多集中于市面上常見(jiàn)的聚合物質(zhì)，雙水相萃取技術(shù)能否大量應(yīng)用于微藻蛋白質(zhì)提取，還需進(jìn)一步探究與其他技術(shù)相結(jié)合的互作影響，提取過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)變化影響及提取工藝的進(jìn)一步優(yōu)化。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

微藻細(xì)胞由于蛋白質(zhì)含量高、蛋白質(zhì)量?jī)?yōu)質(zhì)等眾多優(yōu)點(diǎn)而被廣泛開(kāi)采利用，但微藻細(xì)胞復(fù)雜的胞壁結(jié)構(gòu)，必須進(jìn)行適當(dāng)?shù)募?xì)胞破碎后才能使蛋白質(zhì)溶出、提取、利用?，F(xiàn)有的細(xì)胞破碎方法多數(shù)耗能高、溫度變化大，對(duì)蛋白質(zhì)提取具有眾多不利影響。為充分破碎微藻細(xì)胞、提高微藻蛋白質(zhì)純度及回收率，可注重研究各細(xì)胞破碎方法之間的結(jié)合利用與互作影響。各預(yù)處理技術(shù)與深度純化技術(shù)相結(jié)合，提高蛋白質(zhì)的回收率。篩選抗高溫、高壓條件的酶類(lèi)與細(xì)胞破碎技術(shù)結(jié)合利用，深度研究雙水相萃取技術(shù)與其它萃取技術(shù)的結(jié)合使用，更需進(jìn)一步深層次地研究其各細(xì)胞破碎、預(yù)處理、純化技術(shù)的作用機(jī)理，以實(shí)現(xiàn)微藻蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)。