二次諧波成像原理及在眼科中的研究進展

何歡歡 高蓉蓉 王勤美 黃錦海

傳統(tǒng)顯微鏡的分辨率由于受衍射極限和光源的限制已達到極限。1961年，F(xiàn)ranken等首次觀察到了激光倍頻現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)將激光器波長調(diào)制為694.3 nm的紅外激光（基波）照射石英晶體時，有2束激光從晶體中穿出，一束為紅外激光，另一束為激光與晶體發(fā)生相互作用產(chǎn)生的波長為347.15 nm的紫外激光，紫外激光的頻率為基波的2倍，波長為基波的1/2，稱之為二次諧波（Second harmonic generation，SHG）現(xiàn)象，根據(jù)光波與介質(zhì)相互作用產(chǎn)生的非線性光學(xué)效應(yīng)可對生物體進行成像和探測。從此，SHG的研究進展迅速，在肌腱、血管和眼部組織得到了應(yīng)用[1]?，F(xiàn)筆者簡述SHG的產(chǎn)生原理、成像特點及其眼科應(yīng)用。

1 SHG成像的原理和特點

波長為λ、頻率為ν的入射光作用在介質(zhì)上時使介質(zhì)從基態(tài)激發(fā)為激發(fā)態(tài)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)回落到基態(tài)時產(chǎn)生1個波長為1/2 λ、頻率為2 ν的光波，即SHG。SHG成像源于激光與不同介質(zhì)的非線性相互作用，信號的強度與激發(fā)光的光場強度和介質(zhì)本身性質(zhì)有關(guān)，所以通過控制激發(fā)光光場強度和探測SHG信號強度即可得知介質(zhì)的電子態(tài)、排列方式和旋向等微觀結(jié)構(gòu)[1]。

SHG信號的產(chǎn)生需同時滿足以下2個條件：①介質(zhì)為非中心對稱結(jié)構(gòu)：角膜基質(zhì)中的Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維、鞏膜中致密的膠原纖維[2，3]以及篩板（Laminacribrosa，LC）和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（Retinal ganglion cell，RGC）軸突中的微管（Microtubule，MT）[4]均為高度非中心對稱，所以可以產(chǎn)生強信號；②相位匹配條件：傳播中的倍頻光波和新激發(fā)出的SHG保持相位上的一致性才能產(chǎn)生信號。

SHG信號是生物組織產(chǎn)生的原發(fā)信號，無需加分子探針即可得到信號值，信號強度的影響因素包括：①介質(zhì)種類：同一光源照射角膜膠原纖維和肌腱膠原纖維所得的信號強度不同；②膠原纖維的類型：Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型膠原纖維的SHG信號強度各不相同；③激發(fā)光偏振方向、光線與膠原纖維形成角度以及成像深度。

SHG顯微成像裝置主要包括激光發(fā)射器、物鏡、濾光片組和信號探測系統(tǒng)。在眼科成像中通常選用775～860 nm 的激發(fā)光源，在保證產(chǎn)生較強信號的同時避免樣品受損。信號收集方式分為前向和背向探測，前向成像較清晰地顯示了單個膠原纖維的形狀和方向，背向成像雖較模糊但能顯示膠原纖維片層的分布。臨床上實時觀測活體角膜需采用背向信號，無法采集前向成像。因為SHG和雙光子熒光（Two-photon excited fluorescence，TPEF）都是二階非線性現(xiàn)象且空間分辨率相當(dāng)，成像系統(tǒng)兼容，所以已商品化的TPEF顯微鏡只需要更換濾光片即可用于實現(xiàn)尚未商品化的背向SHG成像。

SHG成像與傳統(tǒng)光學(xué)成像技術(shù)相比具有以下優(yōu)點[1]：①近紅外激發(fā)光源減少了樣品的光損傷，而且發(fā)生非線性效應(yīng)，光線不被吸收，減少了熱損傷；②樣本的制備無需固定、切片和染色，簡化了實驗流程，避免破壞樣本形態(tài)和染料的光毒性；③SHG一般只發(fā)生在焦點附近的極小區(qū)域，對周圍樣品損傷大大減少，無需使用共焦小孔即可獲得三維圖像；④分辨率高，具有較高的信噪比，允許在組織的不同深度進行成像，成像深度優(yōu)于常規(guī)技術(shù)。

2 SHG成像與其他成像技術(shù)的結(jié)合

目前對SHG信號了解不夠深入，因此通常還需要與TPEF顯微鏡和共聚焦成像等其他方式結(jié)合使用，獲得信息互為補充。

2.1 SHG與光學(xué)相干斷層掃描（OCT）的結(jié)合

SHG成像基于組織的非線性光學(xué)特性，而OCT則基于組織的線性光學(xué)散射特性（折射率）。OCT軸向分辨率高、敏感度高、探測速度快且無創(chuàng)，在眼前節(jié)和眼底成像方面已得到廣泛應(yīng)用，在SHG成像中引入OCT，可以提高探測的靈敏度，增加成像深度。但是OCT不能消除焦點以外的雜散光，限制其成像分辨率，SHG在成像質(zhì)量和光損方面有了明顯提高，且側(cè)重于纖維排列，在OCT中引入SHG成像可以發(fā)現(xiàn)組織更早期的變化，有利于早期診斷。隨著光纖技術(shù)的高度發(fā)展，SHG-OCT技術(shù)可與光纖光學(xué)結(jié)合，有望實現(xiàn)活體的內(nèi)窺鏡檢查。

2.2 SHG與TPEF的結(jié)合

SHG是非線性散射，與樣品的二階非線性極化率的空間分布有關(guān)，主要呈現(xiàn)膠原纖維；TPEF則是基于熒光發(fā)射后的非線性吸收成像，可發(fā)射波長為750～826 nm的激發(fā)光，通過對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和黃酮類腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）的激發(fā)來顯像細胞結(jié)構(gòu)[5]。SHG成像和TPEF成像的聯(lián)合使用，無需任何染料即可顯示整個角鞏膜的纖維和細胞[6-8]以及視網(wǎng)膜的多種細胞[9]。

3 SHG在眼科中的應(yīng)用

SHG成像技術(shù)可以直觀評估眼部的角膜基質(zhì)、小梁網(wǎng)、鞏膜、神經(jīng)節(jié)細胞軸突中的微管等結(jié)構(gòu)，在相關(guān)眼病的診治中已有研究應(yīng)用。

3.1 角膜基質(zhì)的SHG成像

基質(zhì)層占角膜全層的90%，由少量的角膜基質(zhì)細胞和大量的膠原纖維構(gòu)成，膠原纖維呈非中心對稱柱狀結(jié)構(gòu)，在強激光激發(fā)下可以產(chǎn)生SHG強信號。Bowman層膠原纖維短且排列方向不規(guī)則，前向成像呈明顯的點狀信號，背向成像呈模糊和漫反射的信號，板層間分支和吻合很多，Bowman層的弧形纖維和錨定纖維有助于固定膠原板層；在前基質(zhì)層，膠原纖維變寬變長，排列方向更一致但仍隨機分布，板層間分支和吻合減少，前向成像呈隨機排列的短纖維束，背向成像呈明顯交織的薄片；后基質(zhì)層的膠原束隨深度增加變得更長、更寬，方向更規(guī)律，分支和吻合進一步減少[10，11]。

3.2 圓錐角膜的SHG成像

SHG可以觀察到圓錐角膜患者的中央和旁中央角膜變薄、變陡，插入Bowman層的弓形纖維和錨定纖維減少，Bowman層和膠原纖維斷裂，纖維板層分支和吻合明顯減 少[12-15]。角膜膠原交聯(lián)術(shù)后，SHG還可以觀察角膜膠原纖維的主要排列方向，從而評估交聯(lián)效果[16]，在角膜基質(zhì)前1/3最顯著，且效果在一定范圍內(nèi)隨時間延長而增加[17-19]。

3.3 角膜屈光手術(shù)術(shù)后的SHG成像

角膜屈光手術(shù)后，SHG可以清楚觀察到角膜的切削邊界和膠原纖維的形態(tài)變化，評估手術(shù)效果和監(jiān)測角膜擴張等并發(fā)癥的出現(xiàn)。Kivanany等[20]使用SHG和TPEF聯(lián)合檢測了板層角膜切削（Lamellar keratectomy，LK）術(shù)后細胞和細胞外基質(zhì)的改變，觀察到術(shù)后角膜細胞的遷移、纖維化、重塑和再生的全過程：術(shù)后在切削平面下發(fā)生角膜基質(zhì)細胞的死亡；術(shù)后第7 和第21 天成纖維細胞與膠原板層共同排列，成纖維細胞的移動受膠原板層調(diào)控，同時基質(zhì)細胞分泌細胞外基質(zhì)蛋白；術(shù)后60 d，細胞和基質(zhì)形成板層結(jié)構(gòu)。

3.4 角膜感染的SHG成像

Robertson等[21]使用SHG成像和多光子熒光顯微鏡定量研究了離體和在體兔角膜感染期間，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）侵入角膜基質(zhì)中的定向運動，發(fā)現(xiàn)PA的運動方向和膠原纖維的排列方向明顯相關(guān)，感染多發(fā)生在膠原纖維排列方向更一致的角膜中央，PA順著膠原纖維的走形在纖維間隙通行導(dǎo)致感染擴散，而角膜緣區(qū)和鞏膜區(qū)的膠原纖維分布雜亂，感染不常見。PA浸潤最密集的地方引起膠原纖維壞死，背向SHG只能檢測到極小的信號。SHG成像顯示膠原纖維，多光子熒光顯微鏡顯示PA，二者結(jié)合可以獲知PA的感染路徑和對膠原纖維的破壞程度，有望成為評估角膜微生物感染的的工具[22]。

3.5 網(wǎng)格狀角膜營養(yǎng)不良（Lattice corneal dystrophy，LCD）的SHG成像

LCD是淀粉樣變性病的典型類型。淀粉樣蛋白肽的SHG信號等于甚至高于內(nèi)源性膠原纖維的信號，可用作生物成像的SHG探針[23]。超短淀粉樣蛋白肽是長度為微米級、直徑僅7～10 nm的螺旋纖維，形態(tài)與膠原纖維相似。SHG顯微鏡提供了簡單且無標(biāo)記的方法來檢測淀粉樣蛋白肽，定量分析其取向、形態(tài)和亞微米異質(zhì)性，可用于體內(nèi)診斷LCD等角膜疾病。與常規(guī)熒光成像技術(shù)相比，SHG光學(xué)穿透力更深、光損傷更低和觀察時間更長。

3.6 房水流出通道的SHG成像

小梁網(wǎng)是房水流出的主要路徑，SHG可以檢測小梁網(wǎng)中膠原纖維的分布，TPEF成像顯示小梁網(wǎng)的彈性纖維和代謝活性細胞，二者組合可提供生理狀態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵信息，具有明顯的對比度和特異性?？焖俑道锶~分析二次諧波成像（Fast fourier transform-second harmonic generation，F(xiàn)FT-SHG）成像利用2D 空間傅里葉分析，使用纖維取向、間距和厚度等參數(shù)來量化小梁網(wǎng)膠原纖維，還可對Schlemm管、虹膜和睫狀體的脈管系統(tǒng)進行成像，更好地了解青光眼和角膜的生理病理學(xué)[24]。

3.7 鞏膜的SHG成像

鞏膜由致密且互相交織的膠原纖維和少量的彈性纖維構(gòu)成，前部與角膜相接，后部分為內(nèi)外兩層，外層移行為視神經(jīng)鞘膜，內(nèi)層呈網(wǎng)眼狀，RGC軸突由此穿出眼球。大部分膠原纖維都平行于鞏膜表面，SHG可對鞏膜中的膠原纖維進行在體高分辨率的斷層掃描，揭示膠原束的分布和取向[25]。與角膜膠原纖維的板層排列不同，鞏膜膠原纖維呈束狀排列，且分布更密集無序。鞏膜膠原纖維的直徑和間隙與角膜基質(zhì)膠原纖維不同，背向SHG信號更強。由于鞏膜不透明，因此部分背向信號可能來自高度散布的鞏膜組織的前向信號的反向散射。Zyablitskaya等[3]利用SHG探測了羥基甲基甘氨酸鈉進行鞏膜治療性組織交聯(lián)（Therapeutic tissue crosslinking，TXL）對高度近視眼的治療效果，觀察到TXL導(dǎo)致鞏膜膠原纖維束的SHG信號增強和波紋度減少，且具有濃度依賴性。

3.8 視乳頭（Optic nerve head，ONH）的SHG成像

在眼后極附近，LC和臨近的鞏膜組織即視乳頭周圍鞏膜（Periodicity plus smooth，PPS）共同形成了ONH的結(jié)締組織成分。LC是由復(fù)雜的、網(wǎng)狀陣列的束形成的，大部分束是圍繞毛細血管的富含膠原蛋白的結(jié)締組織鞘。LC區(qū)域的生物力學(xué)復(fù)雜，多孔LC的結(jié)締組織密度較低，在脆弱的RGC軸突周圍形成應(yīng)力集中區(qū)域，LC的機械變形引起RGC軸突損傷，可能是青光眼發(fā)生軸突損傷的最初部位，LC的機械特性在青光眼中起著重要作用[26]。LC很難通過傳統(tǒng)成像獲得，而SHG可以對LC的每個束進行清晰成像[27]，基于二維離散傅里葉變換（Discrete fouriertransform，DFT）的方法，可以獲得束的排列方向的一致程度和分散程度。對整個LC進行三維成像并與生物力學(xué)相結(jié)合，有助于闡明青光眼的發(fā)病機制[28]。PPS的最內(nèi)層表現(xiàn)出規(guī)整一致的徑向排列，中部則表現(xiàn)出圍繞ONH的膠原纖維的強圓周取向。PPS的膠原纖維結(jié)構(gòu)是決定眼內(nèi)壓引起ONH變形的重要因素。通過SHG和小角度光散射（Small-angle light scattering，SALS）對橫向和縱向人類ONH冷凍切片進行成像，量化首選纖維方向（Preferred fibre orientation，PFO）和纖維排列的程度（Degree of fibre alignment，DOFA），發(fā)現(xiàn)DOFA在PPS中最高，在LC中相對較低。老年人PPS的DOFA高于年輕人，正常人通常高于青光眼患者[29]。在所有LC中，大多數(shù)纖維在整個鼻－顳方向具有優(yōu)先取向。青光眼LC中的大部分PFO與對照組存在明顯差異，且下顳葉LC纖維排列取向更一致。LC內(nèi)纖維排列的差異可能是青光眼視神經(jīng)病變所特有的，可能是ONH重塑和（或）塌陷的結(jié)果。

3.9 MT的SHG成像

RGC的凋亡以及軸突逐漸丟失是青光眼的典型特征。RGC軸突中的MT為非中心對稱分子結(jié)構(gòu)且均勻極化，完整的MT骨架結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生強SHG信號，量化RGC活性[30]。微管的二次諧波成像無需使用外源性染色劑或基因工程即可顯示視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維束，有益于探索青光眼的發(fā)病機制。DBA/2J小鼠模型的SHG成像發(fā)現(xiàn)MT破壞可引起SHG密度的衰減，且比MT厚度的衰減率高約97%，表明MT的破壞早于RGC軸突的喪失和纖維束形態(tài)或厚度的改變，為“MT青光眼假說”提供了支持[4]。SHG密度的降低使RGC軸突更易受到眼內(nèi)壓升高的影響，可敏感地檢測軸突損傷，且SHG信號強度對MT裝配的規(guī)律性高度敏感，故還可探測整個RNFL上不穩(wěn)定的細胞骨架元件的結(jié)構(gòu)完整性，可在RNFL變薄之前靈敏地發(fā)現(xiàn)青光眼的早期病變[31]。

4 總結(jié)和展望

SHG可用于獲取離體組織和在體組織的成像。目前只有背向SHG可實現(xiàn)在體成像，但清晰度較差，限制了SHG技術(shù)的應(yīng)用。隨著SHG的發(fā)展和與其他成像技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，SHG有望成為角膜擴張性疾病和角膜感染的臨床檢測手段，并用于角膜交聯(lián)和屈光手術(shù)術(shù)后評估療效和并發(fā)癥的檢查；在鞏膜和視網(wǎng)膜上，對LC和RGC的成像研究有助于青光眼和視神經(jīng)損害等疾病的發(fā)病機制的探索和治療的評估，在疾病的早期診斷方面具有廣闊應(yīng)用前景。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明何歡歡：收集文獻資料、分析；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進行文章修改。高蓉蓉、黃錦海：參與選題設(shè)計；指導(dǎo)資料的分析和解釋；對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱和修改。王勤美：對論文的知識性內(nèi)容作批評性審閱