茶樹(shù)離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展

張照亮，任露露，顏小梅，聶昕茹，楊天元

茶樹(shù)離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展

張照亮1，任露露2，顏小梅1，聶昕茹2，楊天元1

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，合肥 230036)

茶樹(shù)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)，利用茶樹(shù)莖段、腋芽、葉、花粉、種子等器官作為外植體建立茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化的再生系統(tǒng)，對(duì)獲得優(yōu)質(zhì)茶樹(shù)種質(zhì)資源至關(guān)重要。目前關(guān)于茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究，主要集中在農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法。綜述當(dāng)前茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化再生系統(tǒng)的研究進(jìn)展，并對(duì)今后茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化提出展望。

茶樹(shù)；遺傳轉(zhuǎn)化；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；基因槍法

茶（(L.) O. Kuntze）屬于山茶科多年生木本植物。茶葉是世界三大無(wú)酒精飲料之一，由于獨(dú)特的清香風(fēng)味和鎮(zhèn)靜消炎功效，深受國(guó)民的喜愛(ài)。截至2019 年，我國(guó)茶葉產(chǎn)量達(dá) 279.34 萬(wàn)t，其中出口茶葉36.65 萬(wàn)t，茶園面積4 597.86萬(wàn)畝（數(shù)據(jù)來(lái)源網(wǎng)絡(luò)），因此茶樹(shù)是我國(guó)一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的茶樹(shù)品種是我國(guó)科研工作者的育種目標(biāo)，常規(guī)育種和雜交育種是常用的茶樹(shù)育種方法，但由于受茶樹(shù)自交不親和、育種年限長(zhǎng)等因素的制約，茶樹(shù)育種工作難以得到突破性進(jìn)展。

植物遺傳轉(zhuǎn)化（plant genetic transformation）是指通過(guò)生物學(xué)手段將外源基因從一個(gè)有機(jī)體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)有機(jī)體，隨后在基因組中穩(wěn)定表達(dá)和整合、并能夠穩(wěn)定遺傳的過(guò)程[1]。植物遺傳轉(zhuǎn)化包括以農(nóng)桿菌和病毒為載體的載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；以種質(zhì)和植物生殖細(xì)胞為種質(zhì)媒介放入種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以及直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，分為物理法和化學(xué)法。植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)打破了常規(guī)育種的界限，縮短了育種年限，對(duì)物種品質(zhì)改良、增強(qiáng)抗逆性等具有重要意義。

利用植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)茶樹(shù)定向育種，加快育種進(jìn)程，從而獲得品質(zhì)優(yōu)良的茶樹(shù)新品種。近年來(lái)，以茶樹(shù)花藥、莖段、子葉、腋芽等不同器官建立茶樹(shù)的再生系統(tǒng)，以農(nóng)桿菌為介導(dǎo)、基因槍和花粉管通道等方法進(jìn)行茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化，取得了一定的進(jìn)展。本文將系統(tǒng)總結(jié)當(dāng)前的茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究進(jìn)展，并對(duì)改進(jìn)和提高茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化提出一些建議和展望，以期為利用茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系輔助茶樹(shù)新品種選育提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 茶樹(shù)再生體系

為了建立茶樹(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，需要通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)建立茶樹(shù)器官的再生系統(tǒng)。植株的再生一般要經(jīng)歷4個(gè)階段：①外植體經(jīng)歷脫分化形成愈傷組織；②愈傷組織分化形成體細(xì)胞胚或器官；③體細(xì)胞胚成熟萌發(fā)或芽的發(fā)育；④植株再生[2]。目前，盡管茶樹(shù)器官再生體系已得到一定的優(yōu)化和改進(jìn)，但仍有一些問(wèn)題待解決。如茶樹(shù)外植體的再生能力不一致、內(nèi)生菌污染及外植體的褐化等因素都制約茶樹(shù)誘導(dǎo)和分化效率，導(dǎo)致茶樹(shù)器官的再生系統(tǒng)建立困難。

關(guān)于茶樹(shù)器官再生的研究始于20世紀(jì)60年代，日本勝尾清[3]對(duì)茶樹(shù)花藥進(jìn)行誘導(dǎo)，緊接著研究人員便對(duì)茶樹(shù)種子、莖段、腋芽、葉片等不同器官進(jìn)行研究。下面將從不同器官的誘導(dǎo)、培養(yǎng)基的優(yōu)化和外源添加物等方面闡述茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化再生體系方面的研究進(jìn)展。

1.1 不同器官的誘導(dǎo)

1.1.1 花藥 20世紀(jì)，日本勝尾清等[3]最先以茶樹(shù)花藥為誘導(dǎo)材料，獲得了愈傷組織和根。國(guó)內(nèi)研究者陳振光等[4]于20世紀(jì)80年代第1次通過(guò)茶樹(shù)品種福云7號(hào)的花藥培養(yǎng)獲得了具有根、莖、葉的完整植株。研究指出：茶樹(shù)花藥培養(yǎng)受其發(fā)育程度影響，花粉發(fā)育在單核中晚期，花藥顏色以橙黃色為宜[4]。

1.1.2 種子 茶樹(shù)的種子包括果皮、種皮、胚和子葉，茶樹(shù)種子的誘導(dǎo)主要是子葉和胚的誘導(dǎo)。茶樹(shù)子葉可誘導(dǎo)出胚狀體最后再生成完整植株[5]，胚狀體由茶樹(shù)子葉表皮細(xì)胞發(fā)育而來(lái)[6]，逐步確定了“子葉外植體→體細(xì)胞胚（分化芽）→再生植株”的茶樹(shù)再生體系[7]；另外，未成熟胚也可誘導(dǎo)出愈傷組織并分化芽苗，最后形成完整植株[8-9]；大葉茶的成熟種子也可誘導(dǎo)愈傷組織并分化出叢生苗[10]。

1.1.3 茶樹(shù)腋芽 腋芽是茶樹(shù)中離體培養(yǎng)的常用外植體，具有穩(wěn)定的遺傳特性。腋芽是微體繁殖中保持親本最安全的材料，且腋芽在親本基因型保真度方面最高[11]。茶樹(shù)腋芽可誘導(dǎo)出愈傷組織[12]并分化出芽[13]，但在繼代過(guò)程中生長(zhǎng)變慢。

1.1.4 茶樹(shù)莖段 20世紀(jì)80年代，國(guó)外學(xué)者利用莖段成功誘導(dǎo)出茶樹(shù)完整植株。隨后，黃亞輝[14]以茶樹(shù)莖尖為外植體誘導(dǎo)出愈傷組織；Akula等[15]采用莖段培養(yǎng)產(chǎn)生體細(xì)胞胚，并獲得茶樹(shù)完整植株；劉德華等[16]利用茶樹(shù)莖段產(chǎn)生胚性愈傷組織、體細(xì)胞胚和不定芽；孫仲序等[17]以茶樹(shù)嫩莖為外植體，誘導(dǎo)出叢生芽，并移栽生成完整植株。

1.1.5 茶樹(shù)葉片 1989年劉德華等[18]發(fā)現(xiàn)：將茶樹(shù)品種毛蟹的葉片作為外植體，放置于含有不同激素種類和配比的MS培養(yǎng)基上，葉具有較強(qiáng)的分化成愈傷組織、胚性細(xì)胞團(tuán)、胚狀體以及芽的能力。1994年王毅軍等[19]以春季云南大葉茶第1葉和第2葉為外植體，將葉片置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS 培養(yǎng)基中加入 4 mg·L-16-芐氨基嘌呤(6-BA)、 3 mg·L-1赤霉素（GA）、2 mg·L-1吲哚乙酸（IAA）和 0.2% ～ 0.3% 活性炭）上，50 d后可誘導(dǎo)出光滑且呈現(xiàn)淡黃色的愈傷組織，隨后愈傷組織的表層細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)又可再次啟動(dòng)并脫分化形成胚狀體，并最終分化形成完整茶樹(shù)植株，但發(fā)育過(guò)程中有畸形胚出現(xiàn)。1994年嚴(yán)學(xué)成等[20]以云南大葉茶和海南野生茶的春季幼葉為外植體，在不同的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)出正常器官和畸形器官兩種結(jié)果。1995年暨淑儀等[21]以云南大葉茶葉片為外植體，誘導(dǎo)出愈傷組織，并對(duì)葉薄壁細(xì)胞脫分化形成愈傷組織的過(guò)程做了細(xì)胞組織學(xué)觀察。

1.2 培養(yǎng)基的選擇

誘導(dǎo)不同的外植體所用的培養(yǎng)基也有所不同，常用的培養(yǎng)基有 Murashige and Skoog（MS）、1/2 MS、Woody Plant medium（WPM）、H、Gamborg’s （B5）、改良MS、Eriksson（ER）、Murashige and Tucker（MT），其中 MS 培養(yǎng)基應(yīng)用最為廣泛。

陳振光等[4]先后用了 MS、N6、SJ-1、Blaydes、H 等不同基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基誘導(dǎo)茶樹(shù)花藥愈傷組織并作培養(yǎng)效果比較，結(jié)果表明不同培養(yǎng)基對(duì)花藥愈傷組織的誘導(dǎo)效率存在差異，具體表現(xiàn)為SJ-1＞H、MS＞Blaydes＞N6。郭玉瓊等[22]研究發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)花藥誘導(dǎo)愈傷組織受基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基種類的影響，SJ-1培養(yǎng)基最有益于茶樹(shù)花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率。

茶樹(shù)種子的誘導(dǎo)，主要以ER、MS 等為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。Kato[23]以茶樹(shù)種子子葉為外植體，研究出最佳的初代培養(yǎng)基，即在 MS培養(yǎng)基中加入0.5 mg·L-1維生素 B1、0.5 mg·L-1煙酸、0.5 mg·L-1維生素 B6、2.0 mg·L-1甘氨酸（Gly）和100 mg·L-1肌醇。

1.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

在花藥培養(yǎng)中，郭玉瓊等[22]發(fā)現(xiàn)，不同蔗糖和激素的濃度會(huì)影響茶樹(shù)花藥愈傷組織的誘導(dǎo)。結(jié)果表明，在MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蔗糖濃度不變且均為3%時(shí)，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)效率隨2, 4-二氯苯氧乙酸 (2, 4-D) 濃度的增高而增大；在基本培養(yǎng)基及 2, 4-D 濃度相同時(shí)，適于茶樹(shù)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的蔗糖濃度為 5%～7%。楊娟等[24]探索影響茶樹(shù)花藥愈傷組織誘導(dǎo)條件發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基為 MS + 0.5 mg·L-12, 4-D + 0.5 mg·L-1激動(dòng)素(KT)時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)生率最高，達(dá)到 34.4%。

茶樹(shù)種子誘導(dǎo)主要添加萘乙酸(NAA)、6-BA、吲哚丁酸 (IBA)等激素。劉德華等[25]利用茶籽子葉誘導(dǎo)分化出芽，所用培養(yǎng)基為MS + 0.5 mg·L-1維生素 B1+ 0.5 mg·L-1煙酸 + 0.5 mg·L-1維生素 B6+ 2.0 mg·L-1甘氨酸 + 100 mg·L-1肌醇 + 4 mg·L-16-BA + 2 mg·L-1IBA，pH 為 5.7；蔡海云等[26]用農(nóng)抗早成熟胚為外植體，發(fā)現(xiàn) 2,4-D 和 6-BA 在一定配比下，愈傷組織的誘導(dǎo)率高達(dá) 97%，在 MS 培養(yǎng)基中加2 mg·L-16-BA 適合胚直接誘導(dǎo)成幼苗；楊國(guó)偉等[27]在茶樹(shù)誘導(dǎo)愈傷組織中發(fā)現(xiàn)，不同激素的誘導(dǎo)影響是不同的，2, 4-D＞6-BA＞NAA。

李家華等[28]研究不同激素配方誘導(dǎo)大葉種茶樹(shù)新梢，結(jié)果表明在 MS 培養(yǎng)基中加1.0% 瓊脂、3.0% 蔗糖、0.5 mg·L-16-BA和 4 mg·L-12, 4-D 對(duì)促進(jìn)腋芽生成單生芽效率最高；在MS 培養(yǎng)基中加1.0% 瓊脂，3.0% 蔗糖，10 mg·L-16-BA 和 0.5 mg·L-1NAA 對(duì)腋芽誘導(dǎo)愈傷組織效果較好。張建華等[13]用不同培養(yǎng)基和激素配比探討茶樹(shù)腋芽的誘導(dǎo)情況，發(fā)現(xiàn)在 MS 培養(yǎng)基加 3%蔗糖、0.7% 瓊脂、4 mg·L-1BA 和 0.1 mg·L-1NAA誘導(dǎo)的愈傷組織和芽效果比較好，而在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，ER 培養(yǎng)基加3%蔗糖、0.7% 瓊脂、3 mg·L-1BA 和 0.1 mg·L-1NAA，分化芽效果顯著。

黃亞輝[14]以 MS 為基礎(chǔ)鹽，加0.5 mg·L-1維生素 B1、維生素 B5、維生素 B6、1.2 mg·L-1維生素 C、20 g·L-1的蔗糖、0.02 mg·L-1GA、1.5 mg·L-1IAA和2.0 mg·L-1BA，適宜茶樹(shù)莖尖的誘導(dǎo)。孫仲序等[17]發(fā)現(xiàn)以春季嫩莖和冬季催芽萌發(fā)的嫩莖為外植體誘導(dǎo)更好；在MS 培養(yǎng)基加 1.5 mg·L-1BA 和 0.5 mg·L-1玉米素 (ZT)，誘導(dǎo)分化高達(dá) 83%；以1/2 MS 添加0.2 mg·L-1IBA 和 20 g·L-1蔗糖誘導(dǎo)生根最佳。張亞萍等[29]發(fā)現(xiàn) MS 培養(yǎng)基+10 mg·L-16-BA+ 5 mg·L-12, 4-D 對(duì)茶樹(shù)莖尖誘導(dǎo)愈傷組織最佳。楊國(guó)偉等[30]以龍井茶幼嫩莖段為外植體，發(fā)現(xiàn)最適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：MS + 3% 蔗糖 + 1.0 mg·L-12, 4-D + 1.0 mg·L-1NAA + 0.5 mg·L-16-BA。

陳玉玲等比較了不同激素配比對(duì)茶樹(shù)葉片和幼莖誘導(dǎo)愈傷組織的影響，發(fā)現(xiàn) MS + 0.4 mg·L-16-BA + 2 mg·L-12, 4-D為最適宜培養(yǎng)基。

茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化受體體系的建立與完善對(duì)茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系具有重要影響。在受體體系的研究進(jìn)展中，需要解決的問(wèn)題有：（1）不同器官都可作為外植體來(lái)誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)而分化成叢生芽，但因茶樹(shù)品種、采樣時(shí)間、環(huán)境影響等因素，誘導(dǎo)結(jié)果存在差異，因此，應(yīng)該找到一個(gè)最容易誘導(dǎo)的品種和誘導(dǎo)效率最高的茶樹(shù)器官，以普遍用于茶樹(shù)受體體系研究；（2）激素對(duì)茶樹(shù)器官誘導(dǎo)結(jié)果影響也較大，但是不同的研究中所用的激素種類、濃度也有所不同，從而導(dǎo)致茶樹(shù)器官誘導(dǎo)的效果也存在差異。應(yīng)根據(jù)激素的生理作用和在茶樹(shù)組織培養(yǎng)中的作用找到激素對(duì)茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化再生體系中的普遍作用，并且能夠找到最適合茶樹(shù)器官誘導(dǎo)的激素種類和濃度。

2 茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)

農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒具有將DNA整合到植物染色體上并使之與植物內(nèi)源基因同步表達(dá)的能力。因此，農(nóng)桿菌經(jīng)常作為一種“橋梁”用于植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中。在20世紀(jì)90年代，科研人員初探農(nóng)桿菌介導(dǎo)茶樹(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化并不斷改進(jìn)和完善，比如在農(nóng)桿菌濃度、株系的選擇、共培養(yǎng)條件的優(yōu)化、外源物添加及受體的篩選等方面。到目前為止，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化很大程度上僅限于基因瞬時(shí)表達(dá)體系的應(yīng)用。

2.1.1 根癌農(nóng)桿菌 根癌農(nóng)桿菌含有 Ti 質(zhì)粒，一般采用共培養(yǎng)法，即在適宜條件下將根癌農(nóng)桿菌與愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、莖切段和子葉切片等離體材料共同培養(yǎng)。張學(xué)文等[32]研究發(fā)現(xiàn)，利用福鼎大白茶的胚根、胚軸、子葉和胚芽作為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織，與帶和II 基因 Ti 質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，通過(guò)卡那霉素抗性篩選，得到了抗性愈傷組織，最終獲得抗性芽。駱?lè)f穎等[33]構(gòu)建了一個(gè)含有基因內(nèi)含子和Ⅱ基因的Ti質(zhì)粒，將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，通過(guò)三親交配法導(dǎo)入到 LBA4404、EHA105、pRi15834 等農(nóng)桿菌菌株中，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入茶樹(shù)葉片和愈傷組織中, 獲得了報(bào)告基因的瞬間表達(dá)組織。

Mondal等[34]首次利用攜帶II 和基因的根癌農(nóng)桿菌（EHA105 和 LBA4404 ）侵染茶樹(shù)體細(xì)胞胚，得到了既有 Kan 抗性又有活性的體細(xì)胞胚，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中長(zhǎng)出嫩梢，最后獲得了轉(zhuǎn)基因茶樹(shù)。趙東等[35]在研究根癌農(nóng)桿菌侵染茶樹(shù)葉片效果的影響因素時(shí)得出：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹(shù)較為適宜的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為 LBA4404（600= 0.5 ～ 0.8）侵染外植體10 min左右，隨后在28 ℃黑暗條件下共培養(yǎng) 2 ～ 3 d。

在外源添加物方面，乙酰丁香酮（AS）是能夠提高農(nóng)桿菌 T-DNA 導(dǎo)入植物核基因組的效率。Matsumoto等[36]研究發(fā)現(xiàn)AS濃度達(dá)到100 ～ 500 μmol·L-1時(shí)對(duì)茶樹(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化起促進(jìn)作用。項(xiàng)威等[37]發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加100 μmol·L-1AS可使農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率達(dá)到10%。此外，趙東等[35]發(fā)現(xiàn)不宜在茶樹(shù)和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)階段添加硝酸銀。

篩選劑也在一定程度上影響根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率。駱?lè)f穎等[33]研究發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)愈傷組織對(duì)卡那霉素不敏感，而對(duì)潮霉素非常敏感。田麗麗等[38]研究了頭孢霉素、潮霉素和特美汀等抗生素對(duì)茶樹(shù)體胚抑菌和生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明3種抗生素對(duì)茶樹(shù)體胚的抑菌和生長(zhǎng)存在顯著差異。茶樹(shù)體胚生長(zhǎng)趨勢(shì)隨抗生素濃度的變化而有所不同。

2.1.2 發(fā)根農(nóng)桿菌 攜帶Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌在植物遺傳改造過(guò)程中具有增強(qiáng)次生代謝的功能，但是將其用于茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化的研究比較少。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染茶樹(shù)常用方法有直接注射法和共培養(yǎng)法兩種。

奚彪等[39]首次利用發(fā)根農(nóng)桿菌A4T侵染浙農(nóng) 9501、9502 品系的組培幼葉，發(fā)現(xiàn)在高濃度的發(fā)根農(nóng)桿菌和負(fù)壓條件下，能夠誘導(dǎo)茶樹(shù)葉片長(zhǎng)出發(fā)狀根。高秀清等[40]將發(fā)根農(nóng)桿菌(15834、9402、1601和A4)與龍井43的春梢嫩芽共培養(yǎng)，得到茶樹(shù)毛狀根，其中15834侵染株系的誘導(dǎo)效率最高。張廣輝等[41]利用茶樹(shù)品種浙農(nóng)129無(wú)菌苗的莖段作為外植體，再用攜帶基因的雙元載體質(zhì)粒 pCAMBIA 2301 的發(fā)根農(nóng)桿菌 15834侵染，成功誘導(dǎo)出發(fā)根，經(jīng)PCR 和 GUS 組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)外源基因已經(jīng)插入到基因組 DNA 中并獲得表達(dá)。鄧婷婷等[42]總結(jié)了發(fā)根農(nóng)桿菌侵染茶樹(shù)的機(jī)制、感染方法，還介紹發(fā)根農(nóng)桿菌影響遺傳轉(zhuǎn)化的因素，它們包括農(nóng)桿菌株系、茶樹(shù)基因型和外源添加物等。Alagarsamy等[43]用野生型發(fā)根農(nóng)桿菌感染農(nóng)抗早品種的下胚軸，產(chǎn)生含有野生型芽和轉(zhuǎn)基因根的復(fù)合茶樹(shù)。

2.1.3 存在問(wèn)題 茶樹(shù)不同于其他植物，其含有豐富的多酚類物質(zhì)。這類物質(zhì)的抑菌功能使其在轉(zhuǎn)化過(guò)程中殺死農(nóng)桿菌從而降低轉(zhuǎn)化效率；同時(shí)，多酚類物質(zhì)又可作為蛋白質(zhì)沉淀劑，拮抗農(nóng)桿菌致病基因，阻塞農(nóng)桿菌的 T-DNA 向茶樹(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，從而間接影響茶樹(shù)的轉(zhuǎn)化效率[44]。因此，需要對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行完善。Sandal等[45]在不影響農(nóng)桿菌侵染的情況下，共培養(yǎng)階段時(shí)加入一定濃度的 L-谷氨酰胺，能夠減輕多酚類物質(zhì)的抑菌作用，從而提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率。Rana等[46]研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入活性炭或聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）等吸附物可吸附酚類化合物，降低其毒性，從而提高茶樹(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化效率。

2.2 基因槍法

1987年，美國(guó)康奈爾大學(xué)的Sanford等人首次發(fā)明了基因槍技術(shù)。其原理主要是利用重金屬顆粒釋放電子而加速，在細(xì)胞表面打孔，從而將其表面攜帶的外源基因引入植物受體細(xì)胞，讓其整合到細(xì)胞染色體中，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化過(guò)程。與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法相比較而言，基因槍法適用大多數(shù)細(xì)胞或組織，克服了受體材料的限制，在煙草、豆類、果樹(shù)花卉和大多數(shù)禾本植物中均獲得成功。然而目前鮮有基因槍法運(yùn)用于茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化的報(bào)道。

20 世紀(jì) 90 年代，科研者開(kāi)始探究基因槍技術(shù)在茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用。奚彪等[47]比較了基因槍入射次數(shù)和不同發(fā)射壓力對(duì)茶樹(shù)體胚再生頻率的影響，單槍入射發(fā)射壓力是1 100 ～ 1 300 psi 時(shí)，再生頻率在20% ～ 30%之間；轟擊2次時(shí)，1 300 psi 會(huì)造成過(guò)多的傷口，且不能再生新的體胚。吳姍等[48-49]優(yōu)化了基因槍介導(dǎo)茶樹(shù)轉(zhuǎn)化體系的制彈程序和相關(guān)參數(shù)，制彈程序即：在60 mg·mL-1鎢粉懸浮液 10 μL 中加入 1.6 μL 質(zhì)粒 DNA，分別加入 0.1 mol·L-1的亞精胺4 μL , 2.5 mol·L-1CaCl215 μL ，最后定容至 48 μL ，每次轟擊上樣量為 8～10 μL，獲得抗性愈傷組織為5.0% ～ 12.1%；隨后，對(duì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，含有 PVP 的培養(yǎng)基可提高轉(zhuǎn)化頻率；每槍 DNA 和鎢粉用量分別為0.25 和125 μg 時(shí)可得到較高的轉(zhuǎn)化率；轟擊壓力為 7 MPa，射程為 5 cm 時(shí)，不論是對(duì)表達(dá)還是愈傷的再生都是較為合適的轟擊條件。

3 展望

茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系的瓶頸是器官再生困難和轉(zhuǎn)化效率低。因此，結(jié)合茶樹(shù)的特殊性，茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系的完善需要逐一解決這兩個(gè)問(wèn)題。

目前，茶樹(shù)主要通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行。與其他植物相比，茶樹(shù)的組織培養(yǎng)存在周期長(zhǎng)、材料受限、愈傷組織誘導(dǎo)率低等問(wèn)題。茶樹(shù)的各個(gè)器官在適宜的誘導(dǎo)條件下均可以產(chǎn)生不同類型的愈傷組織。茶樹(shù)的葉片在培養(yǎng)基中容易形成致密的愈傷組織，但是大多不具備繼續(xù)分化的能力。茶樹(shù)的子葉經(jīng)過(guò)適合的誘導(dǎo)，可以形成一定數(shù)量的胚性愈傷組織，為進(jìn)一步的器官分化提供可能。但是只在每年的8-—11月可以收獲到不同成熟度的茶籽，且茶籽的保存難度較大，因此直接以茶籽的子葉為材料會(huì)嚴(yán)重制約茶樹(shù)離體器官再生的發(fā)展。針對(duì)以上問(wèn)題，在茶樹(shù)的轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)中，可嘗試直接分化再生系統(tǒng)、原生質(zhì)體和胚狀體再生系統(tǒng)以提高茶樹(shù)器官再生的效率。Maher等[50]報(bào)道可以越過(guò)組織培養(yǎng)這一階段，通過(guò)基因編輯分生組織實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化。

除農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍等茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化方法需要不斷優(yōu)化和完善外，還可以嘗試其他方法如：脂質(zhì)體、PEG、電擊、花粉管通道法等。Demirer等[51]利用碳納米管將遺傳物質(zhì)傳遞到植物細(xì)胞中，在茶樹(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化操作過(guò)程中也可嘗試。吳姍等[49]將農(nóng)桿菌與基因槍結(jié)合使用發(fā)現(xiàn)比兩種方法單獨(dú)使用時(shí)茶樹(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化效率更高。

本文系統(tǒng)總結(jié)了當(dāng)前茶樹(shù)器官再生和茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究進(jìn)展，對(duì)于今后茶樹(shù)穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的建立并為茶樹(shù)分子輔助育種及培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的茶樹(shù)品種提供理論支撐和實(shí)踐方法。

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Research progress on regenerationand genetic transformation system of

ZHANG Zhaoliang1, REN Lulu2, YAN Xiaomei1, NIE Xinru2, YANG Tianyuan1

(1. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;2. School of Horticulture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)

Tea plant is one of the important economic crops in China. The regeneration system of tea genetic transformation established by tissue culture technology of organs such as stem segments, axillary buds, leaves, pollen and seeds is essential to obtain high-quality tea germplasm resources. The current research on the genetic transformation methods of tea plants mainly focuses on the-mediated method and the particle bombardment. In the paper, we reviewed the research progress of regeneration systems and genetic transformation systems in recent years, and prospected tea plant genetic transformation in the future.

; genetic transformation;-mediated; particle bombardment

S571.1

A

1672-352X (2021)05-0738-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20211022.002

2021-10-25 10:16:34

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20211022.1529.004.html

2021-01-27

茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（SKLTOF20170115和SKLTOF20170117）資助。

共同第一作者:張照亮，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：zhlzhang@ahau.edu.cn 任露露，碩士研究生。E-mail：luluren07@163.com