組織工程氣管中生物可降解支架的選擇與應(yīng)用

潘子寅 潘樞 肖遠(yuǎn)帆 仲毅 史宏?duì)N

揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院胸心外科，揚(yáng)州大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心225001

0 引 言

人體氣管呈中空管道狀，主要由15～20 個(gè)C 形軟骨及附有纖毛的上皮組織構(gòu)成以實(shí)現(xiàn)其生理功能[1]。炎癥、外傷及腫瘤等原因引起的氣管疾病已日益常見，切除病變或狹窄部分并行端端吻合是其外科治療的金標(biāo)準(zhǔn)，但最大的可切除氣管長(zhǎng)度不得超過(guò)成人氣管長(zhǎng)度的1/2 或兒童氣管長(zhǎng)度的1/3[2]。除此以外，由于供體器官來(lái)源有限，移植療法不能被廣泛推廣使用。為了更好地解決這一問(wèn)題，組織工程成為近年來(lái)氣管修復(fù)的研究熱點(diǎn)，其主要包括3 要素：種子細(xì)胞、生物支架以及促進(jìn)收獲細(xì)胞分化結(jié)構(gòu)的生物反應(yīng)器[3]。氣管支架作為細(xì)胞黏附與生長(zhǎng)的微環(huán)境，重要性不言而喻。根據(jù)不同氣管疾病的具體情況，支架材料的選擇不盡相同，但總體而言，理想的氣管支架應(yīng)具備以下特征：①良好的生物相容性，即無(wú)抗原性，能大大降低移植物的免疫排斥反應(yīng)[4]。②生物可降解性，支架降解產(chǎn)物的安全性必須經(jīng)過(guò)測(cè)定，且支架降解速率適宜并可調(diào)節(jié)。③足夠的機(jī)械強(qiáng)度和生物柔韌性。④能提供三維多孔結(jié)構(gòu)，利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞黏附[5]。⑤支架材料較易從自然可再生物質(zhì)中提取或通過(guò)簡(jiǎn)單流程合成制造。因此，生物可降解支架應(yīng)運(yùn)而生，但在臨床氣管修復(fù)治療中運(yùn)用仍不多。本文將著重介紹不同支架材料的可降解性及其在組織工程氣管領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

1 生物可降解支架材料的分類

1.1 天然高分子物質(zhì)材料支架

天然高分子物質(zhì)材料支架的構(gòu)成物質(zhì)主要從動(dòng)植物中提取。該類支架按其材料的分子構(gòu)成主要分為多糖類和蛋白質(zhì)類。前者包括殼聚糖、藻酸鹽、透明質(zhì)酸[6]等，后者包括膠原[7]、絲素蛋白、明膠等。其中，絲素蛋白、殼聚糖和藻酸鹽目前在組織工程氣管中應(yīng)用較為廣泛。

1.1.1 絲素蛋白

絲素蛋白是一種可從家蠶中獲得的纖維蛋白，以甘氨酸和丙氨酸為主要氨基酸殘基，由蛋白質(zhì)自身組裝的β-折疊結(jié)構(gòu)形成，該結(jié)構(gòu)使絲素蛋白支架具有較好的穩(wěn)定性，機(jī)械性能也得以提高[8]。幾種常見的細(xì)胞或細(xì)胞系如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs)等[9]，均能黏附于絲素蛋白支架上，并表現(xiàn)出較好的生物活性和細(xì)胞功能性。絲素蛋白在體內(nèi)會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降解，降解過(guò)程主要由蛋白酶介導(dǎo)，降解產(chǎn)生的多肽可由細(xì)胞完全代謝，對(duì)人體無(wú)毒副作用[10]。因此，以絲素蛋白為基礎(chǔ)制備的支架逐漸受到學(xué)者的關(guān)注與研究。Li 等[11]將絲素蛋白以水凝膠的形式注入大鼠后肢及背部皮下，每隔4 d 使用多模超聲技術(shù)探測(cè)絲素蛋白植入物表面新血管在體內(nèi)的形成情況以及植入物的生物降解速度，觀察直至第20 天。結(jié)果證明質(zhì)量濃度為40 g/L 的絲素蛋白于植入后的前16 d 主要以水解和吞噬的形式降解，于植入后第18～20 天快速降解并與周圍微血管一并形成新生血管。組織工程氣管中成功移植的關(guān)鍵在于呼吸上皮、軟骨、血管的再生，因此，絲素蛋白支架在組織工程氣管中有著巨大的應(yīng)用潛力。無(wú)獨(dú)有偶，McGill 團(tuán)隊(duì)[12]在手術(shù)誘導(dǎo)的具有嚴(yán)重氣管軟化癥狀的新西蘭兔中植入絲素蛋白外部氣道夾板，于觀察時(shí)間點(diǎn)均發(fā)現(xiàn)氣道面積的平均變化量減少，證實(shí)了絲素蛋白夾板在氣管嚴(yán)重軟化的兔模型中具有良好的耐受性和有效性，植入后氣道塌陷情況得到顯著改善。雖然絲素蛋白材料具有種種優(yōu)勢(shì)，但將其應(yīng)用于組織工程之前仍有一些問(wèn)題尚待解決，如：①如何提高支架的柔韌性與伸縮性，減少對(duì)創(chuàng)面的傷害。②如何更好地匹配所制支架的降解速率與靶組織的再生速率等。

1.1.2 殼聚糖

殼聚糖在結(jié)構(gòu)上類似于軟骨中存在的糖胺聚糖，通?？蓮募讱ゎ悇?dòng)物（如蝦、蟹和昆蟲）的外殼或藻類、菌類的細(xì)胞壁中分離提取。它是一種具有抗菌活性的多功能化合物，也是目前唯一發(fā)現(xiàn)的天然堿性黏多糖。殼聚糖具有可降解性及生物黏附性，降解產(chǎn)物為單糖，對(duì)人體組織無(wú)毒性作用[13]。Pang 等[14]制備了與氨中和的殼聚糖支架，壓力測(cè)試結(jié)果顯示其達(dá)到壓縮極限時(shí)，仍能保持與原來(lái)相似的機(jī)械性能且具有良好的彈性。此外，體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該支架有利于新西蘭兔MSCs 的黏附。Nematollahi 等[15]采用冷凍鑄造技術(shù)制備了一種殼聚糖絲質(zhì)支架，并選擇了3 種固結(jié)速率和3 種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交聯(lián)劑（戊二醛）來(lái)改變支架的機(jī)械性能及孔隙率?；诶鞆?qiáng)度、楊氏模量和降解速率的測(cè)量結(jié)果選出兩種合適的支架用于體外細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果顯示使用1 ℃/min 和2 ℃/min 的冷凍速率以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的交聯(lián)劑制備的殼聚糖支架具有與人原生氣管最為相容的無(wú)毒多孔結(jié)構(gòu)。此外，支架表面軟骨細(xì)胞良好的黏附與增殖現(xiàn)象證實(shí)了該支架用于軟骨再生的能力，這與氣管工程的目標(biāo)點(diǎn)所契合。然而作為一種天然材料，殼聚糖支架的機(jī)械強(qiáng)度有待提高，形態(tài)變化規(guī)律不太明確，包封于支架中的生長(zhǎng)因子的釋放速率需得到更好地控制。這些問(wèn)題同樣需要在未來(lái)的研究工作中進(jìn)一步探索[16]。

1.1.3 藻酸鹽

藻酸鹽是從褐藻中提取的一種天然親水性多糖，水解產(chǎn)物主要是D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸[17]。作為一種天然高分子生物材料，藻酸鹽不僅兼具良好的生物相容性和生物可降解性，還可形成膠狀載體。由于純化后毒性低、結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)相似、利于細(xì)胞黏附生長(zhǎng)，藻酸鹽支架逐漸在組織工程研究中受到青睞。Hashemibeni 等[18]用藻酸鹽支架包裹自體脂肪來(lái)源干細(xì)胞，并利用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，再將軟骨細(xì)胞植入氣管環(huán)缺損處，甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果證實(shí)缺損處有軟骨組織的形成。

由上可知藻酸鹽材料具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但也不可避免地存在一些缺陷大大限制了其在組織工程中的應(yīng)用，如支架力學(xué)性能較差、存在pH 敏感性等。近年來(lái)，通過(guò)物理共混（在其中摻入一種或多種其他材料）和化學(xué)改性方式（支架材料的接枝改性以及采用細(xì)胞特異性配體和細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)分子對(duì)材料進(jìn)行功能化修飾）已經(jīng)可以在一定程度上彌補(bǔ)藻酸鹽材料的缺陷[19]。Ceccaldi 等[20]和Liao 等[21]分別使用藻酸鹽泡沫支架以及藻酸鹽水凝膠復(fù)合負(fù)載葡萄糖/鈣的多孔微球形成的支架，均在組織工程軟組織中取得了進(jìn)展。

1.2 人工合成聚合物材料支架

天然材料支架本身能促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖分化，并具有良好的生物相容性；但其缺點(diǎn)也很明顯，如力學(xué)性能不佳、降解速率不易控制、性能變化與結(jié)構(gòu)變化較難預(yù)測(cè)等。因此人工合成材料支架應(yīng)運(yùn)而生，并具有自身的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，如性能易于調(diào)控、可根據(jù)患者的特定要求和尺寸量身制造、理想狀態(tài)下較易被有效地殺菌消毒。過(guò)去幾年中，不同類型和組合的人工合成材料支架已陸續(xù)出現(xiàn)和被使用。

1.2.1 聚羥基乙酸

聚羥基乙酸（polyglycolic acid,PGA），又稱聚乙醇酸，是由乙醇酸經(jīng)脫水縮合反應(yīng)得到的聚合物。在人體活性酶的催化下，PGA 可分解成為水和二氧化碳，經(jīng)肺部和腎臟排出體外，對(duì)人體無(wú)毒副作用。目前，PGA 主要用于手術(shù)縫合線的制造。此外，將PGA 材料填入軟骨撕裂破損處，可明顯緩解因軟骨缺損而帶來(lái)的不適癥狀[22]，說(shuō)明其對(duì)軟骨再生具有一定的應(yīng)用意義。目前組織工程氣管面臨的一大難題為如何提升血管再生的性能，以使氣管替代物在植入后的初始階段得到足夠的血液供應(yīng)以維持組織的生存需要。而PGA 支架被證明能在一定程度上協(xié)助解決該問(wèn)題。Li 等[23]將胰島移植物經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞包被后附著于PGA 支架上，蘇木精-伊紅染色及雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示該支架能提高內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)胰島的包被效率，且輔以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可促進(jìn)血管再生的進(jìn)程。除了有助于軟骨組織與血管的重生，PGA 支架對(duì)于組織上皮化也卓有成效。1992年Okumura 等[24]在修復(fù)成年犬損傷氣管的過(guò)程中，將可降解的PGA 網(wǎng)織物與非降解性聚丙烯材料進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，PGA 網(wǎng)織物表面的上皮細(xì)胞數(shù)量以及黏膜下結(jié)締組織的厚度均明顯大于聚丙烯材料組，因此從氣管損傷處傷口愈合的角度來(lái)看，使用可降解性支架更為合適。PGA 支架對(duì)于組織工程氣管體內(nèi)構(gòu)建的關(guān)鍵因素具有積極意義，但其仍有很大的改進(jìn)空間，如機(jī)械性能有待提升，使其受力不易變形，避免損傷種子細(xì)胞；調(diào)控其在人體內(nèi)的降解速率，解決其降解過(guò)快的問(wèn)題等。

1.2.2 聚乳酸

聚乳酸是一種脂肪族聚酯高分子聚合物，可通過(guò)生物發(fā)酵法制備。由于聚乳酸同樣具有無(wú)毒無(wú)刺激性等優(yōu)勢(shì)，一直以來(lái)亦為學(xué)者研究的重點(diǎn)，且被認(rèn)為是最具前景的支架材料。除了生物相容性良好以外，聚乳酸的另一大特點(diǎn)為具有生物可降解性，其降解產(chǎn)物為乳酸（在體內(nèi)3～6 個(gè)月可被完全降解），進(jìn)入三羧酸循環(huán)后最終以二氧化碳和水的形式排出，對(duì)人體較為安全。但也有學(xué)者認(rèn)為降解產(chǎn)生的乳酸形成的酸性環(huán)境會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)[25]。聚乳酸與PGA 的結(jié)構(gòu)較為相似，相比之下，聚乳酸分子中的酯鍵更耐水解，使得聚乳酸疏水性能更強(qiáng)進(jìn)而改變了聚乳酸支架的降解速率及機(jī)械穩(wěn)定性。但單一的聚乳酸支架的脆性不能提供氣管替代物所需的機(jī)械靈活性[26]，為解決這一問(wèn)題，通常在聚乳酸支架中加入不同材料制成復(fù)合支架以提升支架性能，其中使用較多的為聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）支架（由聚乳酸和PGA 共聚復(fù)合得到）。Schopf 等[27]報(bào)道了第1例PLGA/聚異戊二烯復(fù)合支架植于新西蘭白兔氣管壁，創(chuàng)新性地使用了螺旋支架模型，并與單純片段形式進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，螺旋支架組的組織炎癥反應(yīng)大于片段組，推斷該現(xiàn)象是因支架對(duì)組織的機(jī)械損傷所致，而非支架接觸反應(yīng)；此外還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物氣道分泌物積聚引起的氣道阻塞與植入支架壁的厚度過(guò)大有關(guān)，這對(duì)未來(lái)的研究起到啟示作用，未來(lái)應(yīng)在如何盡可能減小支架壁厚度并結(jié)合3D 打印技術(shù)改進(jìn)支架形狀方面投入更多的精力。

1.2.3 聚己內(nèi)酯

聚己內(nèi)酯是生物可降解聚酯成員之一，是一種脂肪族半結(jié)晶聚合物，具有良好的形狀穩(wěn)定性與生物相容性。聚己內(nèi)酯支架具有良好的藥物透過(guò)性，并能長(zhǎng)期穩(wěn)定地釋放藥物。均質(zhì)狀態(tài)下，聚己內(nèi)酯的降解速率較聚乳酸和PGA 慢[28]，在人體內(nèi)降解需2～3年，降解后無(wú)毒副產(chǎn)物[29]，可用作長(zhǎng)期可生物降解植入物的基礎(chǔ)聚合物。聚己內(nèi)酯因強(qiáng)度較差，加之天然的疏水性，一般不作為單一材料使用。近年來(lái)，對(duì)于聚己內(nèi)酯的改造組合取得了進(jìn)展。Morou?o等[30]在聚己內(nèi)酯材料中滲入纖維素納米纖維這一高分子聚合物作為強(qiáng)化填充劑制備復(fù)合支架，在很大程度上提升了支架的抗壓能力，且其降解速率可控。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該復(fù)合支架無(wú)毒、生物相容性良好。目前除了上述對(duì)聚己內(nèi)酯材料的改造方法，聚己內(nèi)酯已主要通過(guò)3D 打印技術(shù)應(yīng)用于氣道重建。Steffens 團(tuán)隊(duì)[31]將3D 打印聚己內(nèi)酯支架與MSCs混合，分別于電子掃描顯微鏡和共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的2D 支架相比，3D 打印聚己內(nèi)酯支架更有助于觀察種子細(xì)胞間的相互作用，并大大縮短了組織/細(xì)胞的更新時(shí)間，這對(duì)于再生醫(yī)學(xué)意義重大。

2 構(gòu)建可降解組織工程氣管支架的主要影響因素

組織工程氣管支架的降解方式對(duì)其在體內(nèi)的構(gòu)建效果具有巨大影響。不論是天然復(fù)合物材料支架還是人工合成聚合物材料支架，均有兩種降解方式：表面降解和本體降解[32]。在表面降解中，材料隨著時(shí)間的推移逐層被侵蝕，在保持支架原有形狀的前提下降低支架厚度；在本體降解中情況變得不同，材料以崩解的形式降解，即材料表面和內(nèi)部同時(shí)分解、溶解或降低相對(duì)分子質(zhì)量，導(dǎo)致材料強(qiáng)度下降，最終出現(xiàn)解離的現(xiàn)象。當(dāng)需要保持氣管替換物的結(jié)構(gòu)完整性時(shí)，考慮這兩種降解方式的差異性顯得尤為重要，若材料降解速度太快，氣管管腔塌陷的可能性更大，從而導(dǎo)致移植失敗。在支架降解過(guò)程中，必須保證依附于其上的種子細(xì)胞能承受外部環(huán)境的變化。理想狀態(tài)下，支架的降解速率應(yīng)是可塑的，能與新組織的形成速率相匹配，一旦新組織形成，支架也應(yīng)近乎完全降解，而這取決于材料的組合方式、化學(xué)鍵的類型及外界環(huán)境的pH 值等因素。例如，聚L-乳酸與殼聚糖復(fù)合后降解變慢，可用作組織再生的引導(dǎo)膜[33]；偏酸性材料在堿性環(huán)境下降解極快；由于聚己內(nèi)酯材料分子的重復(fù)單元中存在5 個(gè)疏水性—CH2基團(tuán)，因此聚己內(nèi)酯在所有聚酯中降解最慢[34]。除了考慮支架的降解速率，還應(yīng)盡量保證其降解產(chǎn)物無(wú)毒副作用，對(duì)人體不造成潛在危害。

3 構(gòu)建可降解組織工程氣管支架的新型方式

隨著生物打印技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，可降解支架材料與之結(jié)合應(yīng)用的實(shí)例不斷涌現(xiàn)，在組織工程中展現(xiàn)出的應(yīng)用潛力已不容忽視。3D 生物打印技術(shù)是在計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件的幫助下，通過(guò)簡(jiǎn)單幾何圖形的組合實(shí)現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)，運(yùn)用可黏合生物材料通過(guò)逐層打印的方式構(gòu)造目標(biāo)打印物的一種技術(shù)[35-36]。3D 打印生物支架根據(jù)用途可分為兩種，一種通常稱為細(xì)胞培養(yǎng)支架，提供細(xì)胞遷移、增殖、分化的微環(huán)境，且不會(huì)降解；另一種為3D 組織工程支架，用于組織植入和生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間在體內(nèi)降解[37]。在組織工程領(lǐng)域以研究后者為主。Asnaghi等[38]采用3D 打印技術(shù)特定設(shè)計(jì)與患者原生氣管相匹配的支架，治療了1例先天性氣管支氣管軟化癥患兒。手術(shù)中切除局部病變氣管，將支架縫合至需要替代的缺損處。該植入支架預(yù)計(jì)將在3年左右的時(shí)間被患兒機(jī)體吸收和降解，該過(guò)程并不影響患兒術(shù)后的生存質(zhì)量，且隨著患兒自身的生長(zhǎng)發(fā)育，遠(yuǎn)程效果良好。上文已述，可降解天然支架材料和人工合成材料各有明顯的優(yōu)缺點(diǎn)，若能對(duì)材料進(jìn)行改性或復(fù)合使用，或許能取長(zhǎng)補(bǔ)短，制備出擁有不同孔隙率及與組織降解速率相匹配的復(fù)合材料支架，而這些可通過(guò)3D 技術(shù)較好地實(shí)現(xiàn)。為了解決聚己內(nèi)酯的疏水問(wèn)題以及提高支架的機(jī)械穩(wěn)定性，Ghorbani 團(tuán)隊(duì)[39]將天然材料膠原蛋白與3D 打印聚己內(nèi)酯框架相結(jié)合構(gòu)建了一種組織工程氣管支架，在支架上接種初級(jí)軟骨細(xì)胞與脂肪來(lái)源MSCs 并將支架縫合至脫細(xì)胞主動(dòng)脈，最后異位植入新西蘭兔中。組織學(xué)染色結(jié)果證實(shí)支架上有軟骨組織形成，組織分泌的細(xì)胞外基質(zhì)中存在糖胺聚糖；經(jīng)體內(nèi)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)幾乎無(wú)因支架植入而帶來(lái)的免疫排斥、炎癥或感染癥狀。此外，該復(fù)合支架的拉伸強(qiáng)度與天然氣管相當(dāng)，細(xì)胞在其上黏附狀態(tài)良好，這為組織工程氣管提供了所需的剛性與生物相容性。

在3D 打印支架的遞送過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)不可避免地受到熱量、振動(dòng)和剪切力的影響，影響程度大小取決于3D 打印所采取的方法及所選的材料。支架的免疫原性仍是必須解決的問(wèn)題，需進(jìn)一步對(duì)支架降解過(guò)程中釋放副產(chǎn)物的短期和長(zhǎng)期影響進(jìn)行評(píng)價(jià)[40]。為解決3D 打印技術(shù)的一系列問(wèn)題，4D 打印技術(shù)已初露頭角，其能在“時(shí)間”上打破3D 打印技術(shù)的靜態(tài)局限：4D 打印支架以臨時(shí)狀態(tài)被移植，當(dāng)于體內(nèi)觸發(fā)其形狀記憶時(shí)，支架能恢復(fù)目標(biāo)形狀并與機(jī)體的解剖結(jié)構(gòu)相匹配。但因4D 打印技術(shù)的創(chuàng)造性強(qiáng)、應(yīng)用程序多且難度大，其在氣管重建領(lǐng)域的運(yùn)用仍不夠成熟。雖然如此，生物打印技術(shù)可根據(jù)患者的具體情況構(gòu)建擁有不同生物性能的材料復(fù)合型支架，使其更具有針對(duì)性，提高治療效率，這為功能性合成組織器官的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用提供了一個(gè)新穎的平臺(tái)[41]。也正因如此，各種生物可降解材料定會(huì)引起專家們更為廣泛的興趣，發(fā)揮更大的作用。

4 展 望

生物可降解支架以其高分子性能和組合多樣性成為目前組織工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，而3D 打印作為一項(xiàng)新興生物科學(xué)技術(shù)，為氣道重建的研究提供了新方向，兩者結(jié)合使用的效果令人期待。但目前仍有一些問(wèn)題需進(jìn)一步的研究以解決，如能否成功減輕支架植入后的免疫反應(yīng)、能否在較短的時(shí)間內(nèi)為患者完成支架的個(gè)性化定制、能否做到對(duì)支架降解速率的精細(xì)控制等。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多學(xué)科的不斷交叉互補(bǔ)，未來(lái)人們終將探索出最適宜人體內(nèi)環(huán)境的生物可降解材料支架，成功解決組織工程氣管在氣道重建中的瓶頸問(wèn)題，取得實(shí)質(zhì)性突破。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突