非洲豬瘟疫苗研究進(jìn)展

吳慧如，梁曉磊，邵洋洋，謝青梅，李鴻鑫

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由 ASF 病毒(African swine fever virus，ASFV)感染而引起的一種豬急性、烈性傳染病，傳播速度極快，死亡率可達(dá)100%，嚴(yán)重危害生豬養(yǎng)殖業(yè)[1]。ASFV屬非洲豬瘟病毒科，是一種大型雙鏈DNA病毒，長(zhǎng)度從170 kb到190 kb不等。該病毒粒子呈二十面體對(duì)稱，平均直徑為260～300 nm，由內(nèi)到外分別為核質(zhì)體、核衣殼、囊膜，可編碼不少于167種蛋白，且其中仍有多種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能未確定。ASFV最早于1921年出現(xiàn)在肯尼亞，我國(guó)于2018年8月首次報(bào)道該病毒存在，現(xiàn)已擴(kuò)散到全國(guó)各地并呈現(xiàn)蔓延態(tài)勢(shì)，也是目前我國(guó)規(guī)定的一類動(dòng)物疫病[2]。受其影響，2019 年我國(guó)生豬產(chǎn)能總體下降了約40%，生豬存欄量同比下降27.5%，能繁母豬存欄下降了約50%[3]。遺憾的是，因該病毒結(jié)構(gòu)復(fù)雜、基因型多樣以及對(duì)該病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能了解有限，盡管過(guò)去幾十年已開展了多種類型疫苗研發(fā)，從滅活病毒、重組蛋白/肽和DNA疫苗到減毒活疫苗(LAV)候選物，但因候選疫苗保護(hù)效果不理想、副作用嚴(yán)重或臨床試驗(yàn)未完成等原因，迄今為止仍未研制出針對(duì)ASFV有效的商品化疫苗[3]。面對(duì)日趨嚴(yán)峻的ASF疫情，安全有效的疫苗是防控ASF的亟需工具。本文總結(jié)了ASF滅活疫苗、減毒活疫苗、病毒活載體疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗研究進(jìn)展及其難點(diǎn)和突破點(diǎn)，為我國(guó)ASF疫苗研發(fā)和防控提供參考。

1 滅活疫苗

滅活疫苗是利用加熱或甲醛等理化方法，使病原喪失感染能力和毒性而保留其免疫原性，并結(jié)合相應(yīng)的免疫佐劑制備而成。滅活疫苗具有制備方法簡(jiǎn)單、價(jià)格低等優(yōu)勢(shì)，是很多疫病疫苗制備首選的工藝。ASF滅活疫苗早在1960年就開始研制，但已有的研究表明這類疫苗基本不能對(duì)ASFV感染起到保護(hù)作用[4]。即使使用高效新型佐劑，如Polygen(TM)或Emulsigen(R)-D配制ASF滅活疫苗，并在感染豬體內(nèi)檢測(cè)到了抗ASFV的特異性抗體，但仍不能誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，抵御不住ASFV的攻擊，甚至可能出現(xiàn)癥狀加強(qiáng)現(xiàn)象[5-6]。因此，根據(jù)目前的研究結(jié)果顯示ASF滅活疫苗無(wú)法提供有效保護(hù)效力。這可能與ASFV在宿主細(xì)胞內(nèi)外具有不同的病毒生物學(xué)特性有關(guān)，在宿主細(xì)胞內(nèi)外不同區(qū)域成熟ASFV粒子的病毒顆粒表面蛋白有著巨大差異，可能導(dǎo)致免疫原性改變從而影響滅活疫苗效果[7]。當(dāng)然準(zhǔn)確的、具體的原因還需要進(jìn)一步深入研究。

2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是病原體經(jīng)過(guò)各類處理后，毒性亞單位的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，病原致病力減弱但仍保留其免疫原性的疫苗，具有使用劑量小、免疫持續(xù)周期長(zhǎng)、成本低和使用方便等優(yōu)點(diǎn)。豬感染ASFV耐受后能夠一定程度抵抗ASFV再次感染，表明減毒活疫苗免疫可能對(duì)ASFV有保護(hù)效果。目前研制的ASF減毒活疫苗按來(lái)源可分為自然弱化活疫苗(包括連續(xù)傳代致弱活疫苗)和重組致弱活疫苗。ASFV 可在Vero與CV1細(xì)胞內(nèi)復(fù)制傳代，并可通過(guò)連續(xù)傳代來(lái)降低其毒力。Krug等[8]在Vero細(xì)胞系中連續(xù)傳代ASFV-G株，至110代次時(shí)ASFV-G喪失毒力，但是弱化的ASFV-G株也丟失了保護(hù)性免疫抗原，即傳代弱化的ASFV毒株因病毒外膜脂質(zhì)的差異不具備毒株原本的中和活性，使得此類疫苗研發(fā)受阻。自然弱化的毒株代表為OURT88/3和HN/P86，該類毒株免疫豬群后可獲得抗親本毒株的免疫保護(hù)，并對(duì)不同基因型ASFV具有部分交叉保護(hù)，保護(hù)率為66%～100%[9-10]。其中OURT88/3可以抵御 OUR/T88/1、genotype X Uganda、Benin 97/1株的攻擊，但是隨著CD8+T淋巴細(xì)胞的消耗，會(huì)使免疫效果減退，造成不完全保護(hù)[9,11]；HN/P86可促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞與NK細(xì)胞的活性，并抵御 ASFV/L60 強(qiáng)毒株的攻擊但會(huì)引發(fā)部分豬群出現(xiàn)慢性感染現(xiàn)象[12-13]。雖然這些弱毒疫苗沒(méi)有研制成功，但這些研究提示CD8+T淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞在ASFV的保護(hù)性免疫中可能有重要作用。另外也有研究表明，不同免疫劑量對(duì)免疫效果也有影響[14]，提示免疫方式與劑量會(huì)對(duì)自然弱化活疫苗免疫效果產(chǎn)生影響。歷史上自然弱化活疫苗最早于上世紀(jì)60年代在葡萄牙和西班牙開始使用，但隨著疫苗的大量推廣，免疫豬群出現(xiàn)越來(lái)越多的慢性ASFV感染，還出現(xiàn)了不同程度的副作用，主要癥狀包括關(guān)節(jié)炎、肺炎、流產(chǎn)、運(yùn)動(dòng)障礙及死亡等，后續(xù)研制雖然改進(jìn)了疫苗的保護(hù)效力，但依然有出現(xiàn)低病毒血癥或關(guān)節(jié)炎等副反應(yīng)[9,12,15]。出于安全考慮，在沒(méi)有解決這些副作用之前，自然弱化的ASF疫苗推廣和使用會(huì)暫時(shí)受到限制。

重組致弱活疫苗是通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病毒的基因或結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造從而實(shí)現(xiàn)病毒的毒力減弱，并以此制備成疫苗?，F(xiàn)有研究表明ASFV在缺失TK、9GL、UK、EP402R、NL或MGF 360/505基因后，病毒仍具有較好的免疫原性且病毒毒力顯著下降，以此制備為減毒活疫苗，可不同程度抵御不同來(lái)源的ASFV強(qiáng)毒株的感染[7,16-17]。TK基因缺失能致弱ASFV毒力，但不同毒株缺失TK基因后免疫原性有差異，Malwi和Gorigia缺失TK基因后致病力均減弱，但只有Malwi株誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)[18]。流行毒株Georgia 2007/1敲除9GL和MGF360/505基因后病毒毒力減弱，但保護(hù)效果不理想，而當(dāng)9GL和UK基因缺失時(shí)，卻具有很好的免疫原性，該毒株制備成的減毒活疫苗能有效抵抗同源強(qiáng)毒株的感染，對(duì)不同基因型強(qiáng)毒株有一定的交叉保護(hù)效果[19]。BA71毒株缺失CD2v基因后，其毒力明顯減弱，將其制備成的基因缺失減毒活疫苗同樣對(duì)同源的強(qiáng)毒株具有強(qiáng)抵抗力，也對(duì)不同基因型毒株(如Georgia 2007/1)具有一定的交叉保護(hù)作用[20]。NL基因缺失同樣可使部分毒株毒力變?nèi)?，?dāng)歐洲株E70缺失該基因后毒力完全致弱[21]。此外，缺失A224L、A238L、A276R基因的NH/P68毒株對(duì)多種基因型毒株也可提供保護(hù)(保護(hù)率為60%～100%)，但對(duì)部分豬免疫后產(chǎn)生病毒血癥等副作用[22]。值得重點(diǎn)關(guān)注的是我國(guó)哈爾濱獸醫(yī)研究所正在研發(fā)的七基因缺失ASFV疫苗進(jìn)展順利，通過(guò)敲除DP148R、EP402R、9GL、UK等基因使病毒毒力減弱，在完成實(shí)驗(yàn)室研究和中試工作后，于黑龍江、河南和新疆等地啟動(dòng)了疫苗臨床試驗(yàn)，且免疫豬群后表現(xiàn)出良好的安全性和有效性[23]。目前，制約ASF重組致弱活疫苗研發(fā)的主要因素是ASFV毒力相關(guān)基因研究不足，但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和優(yōu)化，ASFV的各基因序列和功能將越來(lái)越清晰，可通過(guò)DNA重組技術(shù)、病毒反向遺傳操作及基因編輯等技術(shù)進(jìn)行基因組序列定點(diǎn)替換或敲除，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)病毒關(guān)鍵毒力基因的改造(缺失或修改)，促使毒株致弱、變安全，從而得到候選疫苗株。綜上研究，ASF重組致弱活疫苗可能會(huì)是我國(guó)最早實(shí)現(xiàn)商品化供應(yīng)的候選疫苗。

3 病毒活載體疫苗

重組活載體疫苗是利用基因工程技術(shù)將編碼病原體保護(hù)性抗原的基因插入活載體中并使之表達(dá)的活疫苗，主要包括重組病毒載體活疫苗和重組細(xì)菌載體活疫苗。其兼具滅活疫苗的安全性和活疫苗的效果好、成本低等優(yōu)點(diǎn)。目前常作為動(dòng)物病毒重組活載體疫苗的載體有：痘病毒活載體、皰疹病毒活載體、腺病毒活載體、新城疫病毒活載體及水泡性口炎病毒活載體等[24]。以痘病毒、腺病毒、甲病毒和新城疫病毒為表達(dá)載體的ASFV活載體疫苗也已廣泛開展。Jancovich等[25]通過(guò)痘病毒載體鑒定出47種ASFV保護(hù)性抗原，并篩選出能有效刺激機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫的p30、p72等抗原，以痘病毒為載體制備了候選疫苗，但因免疫豬群有嚴(yán)重的副反應(yīng)，需進(jìn)一步改進(jìn)。Netherton等[26]通過(guò)ASFV OUR/T33株預(yù)測(cè)出133個(gè)抗原肽，并從中篩選出能激活細(xì)胞免疫反應(yīng)的肽段，以此肽段對(duì)應(yīng)基因構(gòu)建腺病毒和痘病毒載體疫苗，免疫豬群可明顯降低血液中病毒滴度，但未能起到攻毒保護(hù)作用。Lopera-Madrid等[27]將ASFV的p72、p54、p12、EP153R、EP402R分別插入減毒牛痘病毒載體中構(gòu)建重組病毒表達(dá)ASFV多個(gè)抗原，采取“雞尾酒”式混合免疫和加強(qiáng)免疫豬群，可誘導(dǎo)針對(duì)ASFV抗原的強(qiáng)烈抗體反應(yīng)和T細(xì)胞反應(yīng)。Lokhandwala 等[28-29]通過(guò)構(gòu)建人5型腺病毒載體和復(fù)制缺陷型腺病毒載體表達(dá)ASFV保護(hù)性抗原基因(p32、p54、p62和p72)，同樣以“雞尾酒”式混合免疫豬群，也誘導(dǎo)了強(qiáng)烈抗體反應(yīng)。Murgia等[30]利用甲病毒載體分別構(gòu)建表達(dá)ASFV p30、p54、p72抗原的載體，并通過(guò)Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒拯救，最終找到了免疫原性特別強(qiáng)的重組毒株ASFV p30。Chen等[31]將ASFV的p72基因插入新城疫病毒構(gòu)建重組病毒，并證實(shí)該重組病毒能在雞胚中復(fù)制，在免疫小鼠中可產(chǎn)生高抗體，且能誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和分泌IFN-γ和IL-4。但上述研究均尚未有完整的豬群攻毒保護(hù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，免疫效果需進(jìn)一步驗(yàn)證。病毒活載體疫苗能誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生體液免疫、細(xì)胞免疫，甚至黏膜免疫，載體中還可以插入多個(gè)外源基因(可以是不同病原的抗原基因)并同時(shí)表達(dá)，是多價(jià)疫苗和多聯(lián)疫苗的開發(fā)的重點(diǎn)方向，并能利用成熟的疫苗載體快速制備新發(fā)毒株或流行毒株的載體疫苗候選毒株，縮短研制周期，提高保護(hù)效果。因此，病毒活載體疫苗是未來(lái)ASF疫苗研發(fā)的重點(diǎn)方向。

4 亞單位疫苗

亞單位疫苗是通過(guò)可控制性的蛋白質(zhì)分解或水解方法，再純化、篩選出具有免疫活性的片段制成的疫苗。該類疫苗克服了傳統(tǒng)減毒活疫苗毒力返強(qiáng)問(wèn)題以及滅活疫苗滅活不完全的安全性問(wèn)題，是目前尚不能培養(yǎng)或繁殖有困難的病毒相關(guān)疫苗研發(fā)的重要途徑。ASF亞單位疫苗是將特定ASFV保護(hù)性抗原基因在合適的系統(tǒng)中進(jìn)行亞單位表達(dá)，純化制備成疫苗，可誘導(dǎo)免疫豬群產(chǎn)生針對(duì)ASFV的保護(hù)性中和抗體。但ASFV可編碼167種蛋白，使得保護(hù)性抗原篩選變得非常困難。而且ASFV蛋白結(jié)構(gòu)、功能復(fù)雜，有些蛋白既是病毒中和靶位也具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的潛能。目前，已證實(shí)ASFV p30、p54、p72 和CD2v等蛋白是病毒粒子重要的免疫原[32-34]。利用重組桿狀病毒表達(dá)CD2v蛋白所制備的疫苗對(duì)同源的ASFV強(qiáng)毒株具有部分的免疫保護(hù)效果[35]。利用桿狀病毒表達(dá)p12蛋白所制備的亞單位疫苗能夠以劑量依賴的形式抑制ASFV在豬肺泡細(xì)胞上的增殖，但無(wú)法提供免疫性保護(hù)[36]。用p30或p54蛋白所制備的亞單位疫苗可誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生中和抗體，但沒(méi)能改變病程，也沒(méi)能阻止免疫豬群的感染死亡，而用p30和p54聯(lián)合制備的疫苗，可使免疫豬群體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體，并在一定程度上改善病程，實(shí)現(xiàn)部分免疫保護(hù)作用[37]，提示ASFV不同的蛋白組合或抗原數(shù)量會(huì)影響保護(hù)效果。但利用重組桿狀病毒同時(shí)表達(dá)p30、p54和 p72蛋白所制備的亞單位疫苗免疫豬群后仍無(wú)法抵御ASFV強(qiáng)毒攻擊[38]。而Ruiz-Gonzalvo等[35]利用桿狀病毒表達(dá)CD2v、p54和p30蛋白來(lái)免疫豬群可誘發(fā)豬體不僅產(chǎn)生中和抗體，而且攻毒后全部存活下來(lái)，可惜免疫豬群可能會(huì)出現(xiàn)病毒血癥。表明ASFV的p72、p54、p30等蛋白誘發(fā)產(chǎn)生的抗體，能夠在一定程度上中和病毒，抑制病毒復(fù)制過(guò)程。另外，ASFV蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜也可能是影響亞單位疫苗免疫效果的重要因素，如p72蛋白作為感染豬體內(nèi)能檢測(cè)到的主要抗原之一，體外單獨(dú)表達(dá)的p72蛋白會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊構(gòu)象，只有在輔助蛋白B602L共同表達(dá)時(shí)才可能得到正確折疊構(gòu)象的p72蛋白。這些研究提示制備ASF亞單位疫苗時(shí)需要注意ASFV抗原蛋白的選擇、組合及種類。隨著ASFV編碼蛋白功能的研究越來(lái)越多，通過(guò)選擇合適的基因及合適的載體研制亞單位疫苗是能夠獲得成功的。

5 DNA疫苗

核酸疫苗是將含有編碼抗原蛋白的外源基因直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，并利用宿主表達(dá)系統(tǒng)合成特異性抗原蛋白，激活宿主的細(xì)胞或體液免疫，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的疫苗。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前開發(fā)的核酸疫苗主要為DNA疫苗。與傳統(tǒng)的滅活疫苗或減毒活疫苗相比，DNA疫苗具有安全、高效、制備便捷等潛在優(yōu)勢(shì)，特別是可通過(guò)對(duì)靶基因的改造從而選擇抗原決定簇，人為實(shí)現(xiàn)同種異株交叉保護(hù)的疫苗株出現(xiàn)。前期研究已表明CTL免疫反應(yīng)在疫苗抗病毒過(guò)程發(fā)揮著重要作用[9,11-13]，而DNA疫苗在誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的CTL免疫反應(yīng)上效果顯著。Argilaguet 等[39]將編碼p54和p30基因的真核表達(dá)質(zhì)粒制成DNA疫苗，免疫豬群時(shí)既不產(chǎn)生T細(xì)胞反應(yīng)也無(wú)法抵抗ASFV強(qiáng)毒的攻擊。用編碼豬白細(xì)胞抗原基因SLAII與p30/p54融合的DNA疫苗免疫豬群則能產(chǎn)生廣泛的免疫反應(yīng)(包括特異性抗體和T細(xì)胞)，但不能誘導(dǎo)抗病毒性感染的中和抗體，將CD2v、p30和p54組合免疫豬群也可以增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫，但也無(wú)法提供免疫保護(hù)，然而將p30、p54、CD2v和泛素基因串連起來(lái)制備為DNA疫苗，可強(qiáng)烈誘導(dǎo)免疫豬群產(chǎn)生細(xì)胞免疫，并給免疫豬群提供了攻毒保護(hù)效果(無(wú)檢測(cè)到抗體產(chǎn)生條件下)，再次證明細(xì)胞免疫在疫苗抗病毒中發(fā)揮的重要作用[40]。為進(jìn)一步刺激CD8+T細(xì)胞的潛在免疫保護(hù)區(qū)，Lacasta等[41]構(gòu)建了幾千個(gè)表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)DNA表達(dá)文庫(kù)識(shí)別參與ASFV保護(hù)性免疫的T細(xì)胞靶點(diǎn)，并以此制備成DNA疫苗免疫機(jī)體，但攻毒保護(hù)率僅60%，而幸運(yùn)的是免疫攻毒后存活的豬群沒(méi)有出現(xiàn)排毒現(xiàn)象。這些研究表明T細(xì)胞在ASFV刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫保護(hù)中發(fā)揮重要作用，ASFV存在多種具有潛在保護(hù)能力的抗原。但目前已報(bào)道的可應(yīng)用于構(gòu)建DNA疫苗的ASFV保護(hù)性抗原仍不足以對(duì)免疫豬群提供完全保護(hù)。未來(lái)ASF DNA疫苗的研發(fā)，需要對(duì)ASFV未知的保護(hù)性抗原進(jìn)行更全面篩選和研究。尋找出更適合的保護(hù)性抗原以及優(yōu)化表達(dá)載體，有效結(jié)合體液免疫和細(xì)胞免疫，提高疫苗的保護(hù)率。

6 小結(jié)

從ASF發(fā)現(xiàn)至今已近百年，對(duì)養(yǎng)豬行業(yè)更是帶來(lái)了無(wú)比沉重的打擊，但對(duì)ASFV各方面的研究和認(rèn)識(shí)還急需進(jìn)一步探索。雖然在ASFV基因的功能結(jié)構(gòu)、入侵方式及宿主抗ASFV免疫反應(yīng)等方面取得了一定成果，也嘗試開發(fā)了多種疫苗，但都因?yàn)椴荒芴峁┩耆Ｗo(hù)或存在不良反應(yīng)等副作用而無(wú)法推廣。以目前的研究進(jìn)展看，減毒活疫苗能相對(duì)完整地保留病毒結(jié)構(gòu)，可在豬群體內(nèi)正常復(fù)制，刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，且能顯著控制病毒毒力，成為最有希望可以實(shí)現(xiàn)的高效、安全、商品化的ASF候選疫苗。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展和對(duì)ASFV致病機(jī)制、免疫逃逸機(jī)制、毒力基因等研究、認(rèn)識(shí)的不斷加深，更加可靠的、可控的非洲豬瘟疫苗將會(huì)在不遠(yuǎn)的將來(lái)成功面世。