綿羊種布魯菌致病機制與防控研究進展

周志雄，顧國婧，李文杰，李博文，趙 宇，羅藝晨，帥學宏，黃慶洲，焦寒偉

(西南大學 動物科學學院 醫(yī)學研究院免疫學研究中心 獸醫(yī)科學工程研究中心,重慶 榮昌402460 )

綿羊種布魯菌病是一種由綿羊種布魯菌(Brucellaovis,B.ovis)引起的以綿羊流產(chǎn)和繁殖障礙為特征的慢性傳染病，主要損害綿羊生殖系統(tǒng)，給綿羊養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。綿羊種布魯菌是布魯菌屬中的一種，于20世紀50年代初被發(fā)現(xiàn)[1]。它的出現(xiàn)給我國的養(yǎng)羊業(yè)造成極大的危害，且綿羊的抗病育種一直成為國內(nèi)外動物領(lǐng)域?qū)＜覐V泛關(guān)注的問題，而且目前綿羊種布魯菌的胞內(nèi)寄生機制和感染機制尚不清楚。因此，現(xiàn)將從病原學、流行病學、致病機制、免疫逃避和疾病防控等方面對綿羊種布魯菌病的研究進展進行概述，為后期挖掘綿羊種布魯菌的致病機理和與其相關(guān)的研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 病原學

綿羊種布魯菌病的病原為綿羊種布魯菌，屬于革蘭陰性細菌，形態(tài)呈球形或短桿形。菌株在初代次分離培養(yǎng)時需要5%～10% CO2，對營養(yǎng)要求較高，在脫纖維羊血固體培養(yǎng)上生長良好，在普通培養(yǎng)基上則生長較差[2]。綿羊種布魯菌外膜由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、外膜蛋白和磷脂層組成。LPS由3個區(qū)域組成，包括脂質(zhì)A(lipid A)、核心多糖和O抗原[3]，是綿羊種布魯菌重要的毒力因子，也是介導動物機體產(chǎn)生免疫的重要抗原。1980年，劉志文等[4]發(fā)現(xiàn)公羊附睪炎病例，并從患病公羊的精液中分離出綿羊種布魯菌O19株。

2 流行病學

綿羊種布魯菌主要感染綿羊，對其他動物基本上沒有傳染性。張高軒等[5]研究發(fā)現(xiàn)，綿羊種布魯菌新疆地方分離株能夠感染恒河猴，說明對人有潛在的感染可能性，該研究與綿羊種布魯菌不感染人的國際普遍看法存在分歧。此外，有大多數(shù)研究表明布魯菌的發(fā)病率與當?shù)貧夂蛎芮邢嚓P(guān)，DADAR 等[6]研究發(fā)現(xiàn)高氣溫地區(qū)與沒有或很少有霜凍日的地區(qū)，布魯菌病的發(fā)病率明顯降低。CAO等[7]研究發(fā)現(xiàn)布魯菌發(fā)病率呈明顯的周期性和季節(jié)性特征，每年3-7月份為發(fā)病高峰期，冬季為發(fā)病低谷期。

3 綿羊種布魯菌致病機制

3.1 綿羊種布魯菌的致病特點綿羊種布魯菌入侵動物機體后，在短時間內(nèi)到達入侵組織附近的淋巴結(jié)，被動物機體內(nèi)的巨噬細胞發(fā)現(xiàn)并將其吞噬，被巨噬細胞吞噬后的細菌在巨噬細胞內(nèi)生長繁殖形成原發(fā)病灶，但不表現(xiàn)臨床特征[8]。當細菌大量增殖后破壞巨噬細胞，從胞內(nèi)沖出進入全身血液循環(huán)，機體表現(xiàn)出明顯的菌血癥。當巨噬細胞的吞噬能力不足以吞噬釋放出的細菌時，動物機體表現(xiàn)出明顯的毒血癥或敗血癥。細菌在動物機體絨毛膜上皮細胞內(nèi)增殖時，引發(fā)胎盤炎。細菌在絨毛膜與子宮黏膜之間出現(xiàn)擴散時，會引起雌性動物子宮內(nèi)膜炎[9]。妊娠動物受到感染時，細菌在動物絨毛膜上皮細胞內(nèi)增殖，引起絨毛膜發(fā)生壞死并有纖維素性膿性分泌物產(chǎn)生，導致胎盤分離，致使胎兒營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，最終出現(xiàn)流產(chǎn)。

綿羊種布魯菌通過呼吸道、消化道和皮膚黏膜等途徑入侵機體淋巴系統(tǒng)，導致機體免疫功能受阻，機體不能及時清除病原體，在動物機體各臟器內(nèi)繁殖擴增并引起毒血癥導致產(chǎn)生各種病理變化[10]。綿羊種布魯菌侵入綿羊體內(nèi)可引起肺臟的布魯菌性結(jié)節(jié)[11]。布魯菌病可能與溶血性并發(fā)癥有關(guān)，包括血栓形成性微血管病和溶血性貧血[12]。布魯菌感染的巨噬細胞激發(fā)并受炎癥環(huán)境影響的活化T細胞促進破骨細胞的產(chǎn)生，導致骨丟失[13]。

3.2 綿羊種布魯菌的胞內(nèi)寄生布魯菌通過抑制宿主細胞的凋亡，來促進自身在細胞內(nèi)的生存和增殖復制[14]。在未被免疫的動物中，布魯菌可以躲避巨噬細胞的吞噬活動，并在巨噬細胞內(nèi)大量增殖[15]。布魯菌的感染性主要體現(xiàn)在，病原菌能夠在宿主體內(nèi)和極端的環(huán)境條件下，長時間內(nèi)保持毒力不發(fā)生改變，因此這一致病特性對疾病的傳播起著關(guān)鍵的作用。

綿羊種布魯菌具有入侵吞噬細胞[16-17]和非吞噬細胞的能力，并能在其中大量增殖和存活[18-19]。綿羊種布魯菌在細胞內(nèi)的存活能力與其自身毒力相關(guān)，它主要的毒力因子包括一個由VIRB編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)(type Ⅳ secretion system,T4SS)和LPS[16]。有病原學研究表明，布魯菌外膜蛋白和T4SS家族蛋白與布魯菌的侵染、胞內(nèi)寄生和繁殖有著密不可分的關(guān)系。T4SS的存在是綿羊種布魯菌毒力持久性存在的關(guān)鍵[16]。T4SS的功能是使綿羊種布魯菌株逃避溶酶體的降解作用，進而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相結(jié)合。T4SS作為綿羊種布魯菌重要的毒力因子，并不是最初定植所必需的，但它對于感染的持續(xù)性存在是至關(guān)重要的。T4SS不僅對綿羊種布魯菌的細胞內(nèi)寄生起著重要的作用，對它在細胞外存活也同樣起著關(guān)鍵作用[20]。有研究表明，與綿羊種布魯菌胞內(nèi)寄生和增殖有關(guān)的除了T4SS外，還有EDCBA編碼的ABC轉(zhuǎn)運蛋白[21-24]，目前對于ABC轉(zhuǎn)運蛋白的大量研究還在繼續(xù)。

布魯菌依靠病原體與宿主細胞之間的分子相互作用的機制侵入宿主巨噬細胞內(nèi)，形成一種布魯菌胞內(nèi)吞噬小體(Brucella-containing vacuoles,BCV)[25]。布魯菌由于受到宿主細胞內(nèi)環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)的局限，自身表達出的一種未知分子與宿主細胞內(nèi)一種尚未明確的分子發(fā)生相互作用，導致BCV內(nèi)部及其膜表面的分子類型隨著感染時間的變化也發(fā)生著規(guī)律性的變化，而此類變化促進了BCV躲避與溶酶體的結(jié)合，而最終到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成復制小體并長期寄居于此。在此過程中宿主動物的免疫系統(tǒng)很難識別出胞內(nèi)寄生的布魯菌是否免疫逃避[26]。此外，隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)中復制小體的增殖，布魯菌的自身部分成分能和宿主細胞發(fā)生相互作用，而這種相互作用能抑制宿主細胞合成殺菌物質(zhì)，影響信號傳遞通路的啟動，誘導超強的變態(tài)反應，最終則引起疾病的發(fā)生。

布魯菌通過在細胞內(nèi)隱藏而不中斷細胞生命周期，在很大程度上設(shè)法逃避宿主的免疫反應，因此，布魯菌繁殖可以持續(xù)很長時間，導致一種復發(fā)形式的無明顯疾病期的疾病。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)布魯菌在明顯健康的個體中，經(jīng)過多年的疾病觀察和成功的治療后，實時熒光定量PCR檢測相關(guān)基因表達顯示宿主體內(nèi)的病原菌并沒有被徹底根除[27]。更為重要的是，BCV的酸性環(huán)境是抗生素的中和劑，因此，大環(huán)內(nèi)酯類藥物通常對布魯菌病不起作用。此外，公認的體外和體內(nèi)具有活性的抗生素對布魯菌可能表現(xiàn)為細胞內(nèi)活性減弱，需要長期聯(lián)合用藥，單一用藥對治療布魯菌病是沒有效果的[28]。當縮短布魯菌病治療方案的持續(xù)時間后，有統(tǒng)計學研究表明布魯菌病可能具有更高的復發(fā)率和失敗率[29]。布魯菌入侵機體以后，體外藥敏試驗與體內(nèi)抗生素性能之間的分離，也會導致治療的失敗[30]。因此，當布魯菌入侵動物機體并在細胞內(nèi)大量增殖后，徹底清除布魯菌對機體的感染是一件極其艱難的事情。

3.3 布魯菌的免疫逃避致病性布魯菌通過脂筏侵入吞噬細胞和非吞噬細胞。脂筏介導布魯菌進入細胞后，細胞內(nèi)的致病性布魯菌居住在胞內(nèi)吞噬小體中，引起胞內(nèi)吞噬小體中的EEA、Rab5和TFR呈陽性表達。致病性布魯菌為了避免在胞內(nèi)吞噬小體(BCV)中進一步與內(nèi)源性細胞相互作用，于是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用和融合，產(chǎn)生一個來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細胞器。布魯菌的自我復制未能保持與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相互作用，并通過與巨噬細胞的融合而降解。一旦致病性布魯菌在復制的BCV中安全地進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，布魯菌就迅速發(fā)生分裂，通過表達毒力因子逃避溶酶體殺傷[31]。

布魯菌能有效地定植單核吞噬細胞并在肝臟和脾臟中大量繁殖，大約有10%的細菌會對巨噬細胞、樹突狀細胞和其他抗原呈遞細胞(APC)的吞噬產(chǎn)生抵抗力[32]。雖然，布魯菌缺乏已知的細菌毒力因子，如溶胞菌素、膠囊、外毒素、分泌蛋白酶、菌毛、噬菌體編碼毒素和毒力質(zhì)粒[33-34]。但布魯菌外膜中含有大量脂蛋白、含鳥氨酸的脂質(zhì)、Br-LPS和相關(guān)多糖，可誘導弱的天然免疫。布魯菌可以通過在含有獲得EEA-1和Rab5抗原的液泡的脂質(zhì)筏中內(nèi)化，以及修改脂多糖(LPS)和鞭毛蛋白等毒力因子來逃避宿主免疫應答[35]。布魯菌鞭毛蛋白不能誘導TLR5受體，是細菌在早期感染時逃避免疫系統(tǒng)的另一種途徑[36-37]。布魯菌感染的早期階段對于逃避宿主免疫系統(tǒng)也是很重要的[38]。

3.4 綿羊種布魯菌引起的細胞自噬細胞自噬是真核生物中進化保守的對細胞內(nèi)物質(zhì)進行周轉(zhuǎn)的重要過程。該過程中一些損壞的蛋白或細胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后，送入溶酶體(動物)或液泡(酵母和植物)中進行降解并得以循環(huán)利用。自噬是真核生物中一個高度保守的過程，細胞質(zhì)、損傷細胞器、入侵細胞的病原微生物等被雙膜囊狀結(jié)構(gòu)包裹，然后被送到溶酶體或液泡，被溶酶體酶解為大分子物質(zhì)和雜質(zhì)，大分子物質(zhì)被細胞重新回收后利用，而雜質(zhì)則被排至胞外[39]。

布魯菌雖然能在巨噬細胞內(nèi)大量增殖，但布魯菌引起細胞內(nèi)的自噬仍然是一個爭論的問題。有研究表明布魯菌可以引起上皮細胞發(fā)生自噬[18]，但巨噬細胞中卻還沒有檢測到自噬性的胞內(nèi)吞噬小體。一種假設(shè)是，自噬的發(fā)生可能是一種宿主自身存在的防御機制，在非吞噬細胞中普遍存在以抵抗入侵的細菌。這種自身存在的防御機制似乎僅限于非吞噬細胞。事實上，巨噬細胞似乎能有效地殺死致病性布魯菌，機體受到布魯菌感染后，80%～90%的細菌會因為機體自身的防御機制，在感染的最初幾個小時內(nèi)死亡，而上皮細胞的情況并非如此。然而，一些致病性細菌能夠抵抗巨噬細胞的殺傷，并能夠在巨噬細胞內(nèi)生存和復制[40]。

4 防控

布魯菌病的控制或消滅方案、方案的實施和不同國家的防制措施因本國國情不同而有很大差異[41]。雖然世界衛(wèi)生組織(WHO)和世界動物衛(wèi)生組織(OIE)提出了控制或根除布魯菌病的戰(zhàn)略或措施，但只有一些發(fā)達國家實現(xiàn)了免疫動物布魯菌病的目標。盡管動物布魯菌病的控制在一些國家取得了顯著成就，但在大多數(shù)發(fā)展中國家和地區(qū)實現(xiàn)消滅仍是一項挑戰(zhàn)。發(fā)展中國家沒有人畜布魯菌病的“一個健康”監(jiān)測和控制系統(tǒng)，應特別努力為低資源國家推出更多的布魯菌病控制方案[42]。對于布魯菌病應該秉持以“預防為主”的原則，采取檢疫、免疫、淘汰患病動物等綜合性措施進行防控。在規(guī)?；B(yǎng)殖場中，科學的飼養(yǎng)管理是有效防控布魯菌病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[43]。

4.1 疫苗接種由于布魯菌主要為胞內(nèi)寄生菌，抗生素對其治療效果非常微弱，動物機體內(nèi)的細胞免疫對抑制該病起了關(guān)鍵性作用。因此對布魯菌病疫苗的研究主要集中在篩選弱毒株,構(gòu)建突變株以及尋找亞單位疫苗等方面[44]?，F(xiàn)如今全世界普遍使用的布魯菌疫苗主要為S19、Rev-1和RB51。

目前，牲畜疫苗接種、血清學陽性攜帶者的頻繁監(jiān)測和屠宰是消滅該病的唯一有效手段[45]。雖然細胞免疫機制在免疫動物中被用來消滅布魯菌[46]，但疫苗接種和對羊群的監(jiān)控往往是無效的。菌株S19、RB51和Rev-1是經(jīng)批準的布魯菌屬(Brucellaspp.)最常用于保護牲畜免受感染和流產(chǎn)的疫苗株。盡管Rev-1疫苗廣泛用于預防綿羊的布魯菌病[47]，但是它的使用會導致懷孕動物流產(chǎn)和不孕[48]，以及流產(chǎn)后陰道分泌物大量擴散到環(huán)境中。此外，由于它部分保留了其毒力特性，因此對接種疫苗的臨床醫(yī)生來說并不完全安全[48]。血清陽性動物的野生型菌株與疫苗株并沒有血清學上的區(qū)別。再加上Rev-1偶爾引發(fā)的廣泛免疫反應，對區(qū)分接種疫苗的動物和真正受感染的動物造成了重大障礙[49]。在綿羊，即使在某些情況下使用Rev-1疫苗，但是這些疫苗的制造商還沒有澄清它的適用性[50]。王世雷等[51]通過采用布魯菌病活疫苗(M5株)皮下注射和結(jié)膜囊點眼方式對330只羊進行免疫試驗，研究發(fā)現(xiàn)布菌病活疫苗(M5株)適合非孕羊的免疫，且效果良好。MALEKI等[52]基于寡聚多糖(OPS)抗原和PLGA納米粒子，研究開發(fā)出了一種抗惡性布魯菌M16的納米疫苗，納米疫苗OPS-PLGA結(jié)合物免疫動物血清可促進布魯菌的有效吞噬作用[52]。

4.2 非疫區(qū)動物群體的預防措施各地區(qū)畜牧獸醫(yī)行政部門及動物疾病防控部門應當將布魯菌病的防控提升為日常工作的重點，還應當強調(diào)預防措施的重要性，注意疾病免疫的科學性；在疾病高發(fā)時間內(nèi)更應該注重動物的預防接種以減少布魯菌病的擴散。對人類布魯菌病是無法預防的，因為目前還沒有有效的疫苗供人類使用。對于受感染的人，抗生素治療是長期的，治療可能導致重新接觸微生物后復發(fā)或再次感染[46]。綿羊的養(yǎng)殖應該堅持自繁自養(yǎng)，需要引進綿羊時應從無疫病地區(qū)引進并對引進的綿羊進行嚴格的檢疫。對于引進的綿羊進行2次以上的布魯菌病免疫學檢查，引入綿羊全群每次檢查結(jié)果為陰性時，才可以將引入綿羊與當?shù)鼐d羊混群養(yǎng)殖。

對綿羊群體進行定期的檢疫和疾病監(jiān)測，定期用免疫學方法對養(yǎng)殖綿羊全群或者抽樣檢查布魯菌病，如果發(fā)現(xiàn)陽性動物，則立即按照布魯菌病處理方法處理全部養(yǎng)殖的綿羊群體。

綿羊群體發(fā)生不明原因流產(chǎn)死亡時，應該懷疑為布魯菌病，則需要立即將患病綿羊進行隔離，對綿羊排出的流產(chǎn)物和綿羊養(yǎng)殖區(qū)域進行嚴格的消毒處理。對流產(chǎn)胎兒和妊娠雌性綿羊進行診斷與檢測，如為布魯菌病，則該綿羊群體按照感染綿羊群處理。

4.3 疫區(qū)動物群體的防控措施嚴格執(zhí)行定期檢疫，對所有綿羊每年進行2次疾病檢疫，檢疫出的患病動物要進行嚴格的隔離飼養(yǎng)，嚴禁與健康的綿羊發(fā)生接觸。對感染的綿羊群體，以免疫學方法進行反復多次檢疫，檢出患病動物應該立即淘汰，而血檢陽性動物，應該隔離飼養(yǎng)，避免與健康動物接觸，這樣逐步檢疫凈化，直至綿羊群動物均為陰性。嚴格執(zhí)行消毒等獸醫(yī)衛(wèi)生措施，對于飼養(yǎng)綿羊的圈舍要定期進行嚴格消毒，發(fā)現(xiàn)雌性綿羊流產(chǎn)時要對流產(chǎn)物進行徹底的無害化處理，同時對污染的環(huán)境要嚴格消毒。飼養(yǎng)綿羊過程中可以采用免疫增強劑和免疫調(diào)節(jié)劑，它可以增強綿羊體內(nèi)巨噬細胞的活性，從而增強對布魯菌的免疫能力[55-58]。

ELDERBROOK等[59]通過對美國懷俄明州家養(yǎng)綿羊種布魯菌血清學及危險因素進行分析，表明老年綿羊(≥6歲)在各年齡組中血清陽性率最高。因此，我們建議將幼齡公羊與老齡公羊分離飼養(yǎng)，以減少繁殖季節(jié)以外疾病的傳播。由于巨噬細胞內(nèi)布魯菌的生存能力和治療周期長，復發(fā)成為了本病的主要挑戰(zhàn)，尤其是治療后的復發(fā)。因此，HOSSEINI等[60]研究發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素包裹固體脂質(zhì)納米粒對布魯菌的治療作用明顯，并且可避免疾病復發(fā)。

自20世紀90年代以來，我國布魯菌病的發(fā)病率逐步增加，特別是我國西北部分地區(qū)相繼報道發(fā)現(xiàn)綿羊種布魯菌，該病發(fā)病率的增加給我國綿羊養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[53,61-65]。布魯菌病已被國家農(nóng)業(yè)部列為二類疫病，因此有效防控布魯菌病有助于阻止動物疫病的傳播和減少綿羊養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟損失，對保障畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展和公共衛(wèi)生安全具有重要意義。對綿羊布魯菌病防控進行總結(jié)，對綿羊種布魯菌目前已有的研究進行歸納分析，為未來研究綿羊種布魯菌致病機制和預防綿羊布魯菌病提供了一定的理論基礎(chǔ)。