影響雞壞死性腸炎病例復(fù)制的關(guān)鍵因素

袁偉康，戚南山，廖申權(quán)，Mudassar Mohiuddin，李躍龍，呂敏娜，吳彩艷，李 娟，林栩慧，蔡海明，胡俊菁，于林增，肖文婉，張健騑，曹 正1,，孫蕓蕓1,，孫銘飛*，顧有方

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物衛(wèi)生研究所 農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站 廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；3.廣東省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，廣東 廣州 510640)

雞壞死性腸炎又稱(chēng)雞腸毒血癥，于1961年首次報(bào)道于英國(guó)，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。隨著集約化養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，目前該病已成為家禽養(yǎng)殖中最重要的腸道疫病之一。該病是一種由革蘭陽(yáng)性、厭氧、有芽孢的產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)引起的疫病[1-2]，該菌株產(chǎn)生的毒素多達(dá)17種，但單一的菌株只能產(chǎn)生某些特定毒素。目前根據(jù)分泌毒素種類(lèi)和致病性的不同，將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A～G共7個(gè)型：其中A型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生alpha (α，CPA)毒素，B型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生α、beta (β，CPB)和epsilon (ε，ETX)3種毒素，C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生α和β毒素，D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生α和ε毒素，E型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生α和iota (ι，ITX)毒素[3]，F(xiàn)型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生α和enterotoxin (CPE) 毒素，G型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生α和necrotic B-like (NetB)毒素[4]。以往的研究發(fā)現(xiàn)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌是雞壞死性腸炎的主要致病菌，少數(shù)為C型，但最近有學(xué)者表示真正可能致病的產(chǎn)氣莢膜梭菌類(lèi)型是G型[5-6]。

在過(guò)去40多年，使用抗生素類(lèi)藥物防治雞壞死性腸炎取得了一定效果，但隨之帶來(lái)許多潛在危害，如細(xì)菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，肉食品藥物殘留的超標(biāo)等，成為嚴(yán)重威脅公眾健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。為此，近年來(lái)西方一些發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)明令禁止某些抗生素和動(dòng)物促生長(zhǎng)劑在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中的使用，而我國(guó)也明文規(guī)定截至2020年7月1日禁止飼料生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類(lèi)藥物飼料添加劑(中藥類(lèi)除外)的商品飼料。這一系列減抗替抗政策的出臺(tái)短期內(nèi)將影響畜禽養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)，一旦不提高養(yǎng)殖管理水平，一些腸道疫病，特別是由機(jī)會(huì)性致病原產(chǎn)氣莢膜梭菌等引起的壞死性腸炎等疫病將難以控制，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[7]。如何尋找一種新的替代抗生素類(lèi)的生物制劑來(lái)預(yù)防控制雞壞死性腸炎疫病是一個(gè)迫在眉睫的任務(wù)，建立有效的發(fā)病模型來(lái)評(píng)價(jià)新型減抗替抗方案的防控效果即成為當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。然而由于目前對(duì)雞壞死性腸炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，且該病的發(fā)生又是一個(gè)多因素控制調(diào)節(jié)的疫病[8]，如何去復(fù)制一個(gè)有效的疫病發(fā)病模型是一個(gè)關(guān)鍵的難點(diǎn)，因此現(xiàn)對(duì)成功復(fù)制雞壞死性腸炎病例的關(guān)鍵因素進(jìn)行了詳細(xì)的綜述，以期為雞壞死性腸炎病的實(shí)驗(yàn)室研究及綜合防控提供理論基礎(chǔ)。

1 雞壞死性腸炎病例復(fù)制的關(guān)鍵因素

1.1 飼料因素以小麥、大麥或黑麥作為原材料的飼料中含有大量的水溶性難消化的非淀粉多糖(non-starch polysaccharides,NSP)，這類(lèi)物質(zhì)能引起腸道消化液黏度和腸黏液的增加，消化液黏度的增加會(huì)延長(zhǎng)腸道內(nèi)容物的停滯時(shí)間，增加腸道內(nèi)容物黏性以及產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量，可增加壞死性腸炎的發(fā)病率[9]。非烘烤大豆類(lèi)的飼料能抑制胰蛋白酶活性進(jìn)而增加壞死性腸炎對(duì)腸道的損傷[10]。

RODGERS等[11]研究表明，在動(dòng)物飼料中添加魚(yú)粉并不會(huì)增加艾美耳球蟲(chóng)與產(chǎn)氣莢膜梭菌聯(lián)合感染所引起雞壞死性腸炎的嚴(yán)重性，但單獨(dú)使用艾美耳球蟲(chóng)誘導(dǎo)或飼料添加魚(yú)粉都會(huì)導(dǎo)致雞群腸道菌群發(fā)生紊亂[12-13]，引起雞壞死性腸炎的發(fā)生，因此無(wú)需同時(shí)使用球蟲(chóng)誘導(dǎo)和飼料添加魚(yú)粉的方法進(jìn)行雞壞死性腸炎病例的復(fù)制。此外，限制雞群的飼料攝入量會(huì)顯著降低壞死性腸炎疫病引起的腸道癥狀的損傷評(píng)分[14]，因此在雞壞死性腸炎病例復(fù)制模型的建立過(guò)程中，試驗(yàn)雞群在飼養(yǎng)過(guò)程中需獲得充足的飼料，避免限料。

1.2 菌株因素

1.2.1菌株毒素的類(lèi)型 目前，基于試驗(yàn)研究，人們普遍認(rèn)為只有具有netB基因陽(yáng)性的G型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株能引起雞壞死性腸炎[15]。netB基因與一個(gè)位于質(zhì)粒上的致病性位點(diǎn)(NELoc-1)相關(guān)[16]，研究人員發(fā)現(xiàn)在復(fù)制病例的過(guò)程中，netB基因會(huì)出現(xiàn)丟失，從而導(dǎo)致病例復(fù)制失敗。造成netB基因丟失的原因主要有兩個(gè)方面，一是其他基因在NELoc-1位點(diǎn)中發(fā)生突變，使調(diào)控基因發(fā)生變異，導(dǎo)致原始菌株中含有netB致病性位點(diǎn)的整個(gè)毒力質(zhì)粒丟失；二是細(xì)菌在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，具有netB基因的質(zhì)粒自行從宿主菌株中失去。可能的原因是netB具有獨(dú)特的染色體基因[17]，當(dāng)netB毒力質(zhì)粒在宿主菌中表達(dá)時(shí)會(huì)對(duì)菌株產(chǎn)生消極的影響，宿主菌株因?yàn)樽晕冶Ｊ貦C(jī)制對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行了修改，從而導(dǎo)致netB毒素基因的自行丟失。因此，保證病例復(fù)制所使用的產(chǎn)氣莢膜梭菌是含有netB毒素的G型菌對(duì)于試驗(yàn)的成功至關(guān)重要。

此外有研究報(bào)道，具有tpeL基因陽(yáng)性的G型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株中netB毒素基因的拷貝數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于tpeL基因陰性的G型產(chǎn)氣莢膜梭菌[17]，即具有tpeL基因的G型產(chǎn)氣莢膜梭菌比沒(méi)有tpeL基因的菌株能引起更嚴(yán)重的雞壞死性腸炎[18]，說(shuō)明tpeL毒素是另一個(gè)引起雞壞死性腸炎發(fā)病的重要毒素。

1.2.2菌株毒素制備方法 對(duì)于雞壞死性腸炎病例的復(fù)制，G型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株的制備非常重要。熟肉培養(yǎng)基與液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(fluid thioglycollate medium，F(xiàn)TG)一樣，在有氧培養(yǎng)條件下都可以支持產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)菌株在FTG培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 h后的致病力比培養(yǎng)24 h更強(qiáng)[19]，因此建議菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 h后即可使用。菌株在有氧環(huán)境下培養(yǎng)15 h后，可以得到(2～5)×108個(gè)群落形成單位(CFU/mL)，健康雞群中小腸每克腸道內(nèi)容物中含產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量是102～104CFU/mL，而發(fā)生壞死性腸炎的雞腸道中產(chǎn)氣莢膜梭菌為 107～109CFU/mL；因此，菌株經(jīng)FTG培養(yǎng)基培養(yǎng)15 h后得到的群落形成單位已經(jīng)足以導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)生疫病[20]。

1.2.3菌株接種方法 使用已經(jīng)制備好的G型產(chǎn)氣莢膜梭菌接種動(dòng)物時(shí)，普遍采用的接種方式有兩種：一是通過(guò)拌料的方式對(duì)雞群進(jìn)行接種，即使用產(chǎn)氣莢膜梭菌與培養(yǎng)基的混合物液體FTG和飼料以1.25～1.50∶1.00的比例(V∶W)均勻混合，雞群在試驗(yàn)開(kāi)始之前需要禁食一整夜，試驗(yàn)開(kāi)始后，每天喂2次預(yù)先處理好的飼料，飼養(yǎng)周期一般為5 d，在接種飼料的最后一天或第2天對(duì)雞只處理并進(jìn)行病變?cè)u(píng)分的統(tǒng)計(jì)。通過(guò)飼料的方式對(duì)雞群進(jìn)行菌株接種雖然免去了每天對(duì)每只雞進(jìn)行單獨(dú)接種菌株的麻煩，但需要大量的肉湯培養(yǎng)基，這可能會(huì)增加費(fèi)用；二是通過(guò)口服或灌胃的方式接種經(jīng)肉湯培養(yǎng)的菌株。具體方法是連續(xù)3 d，每天2次接種3 mL 105～107CFU/mL的菌液，或連續(xù)7 d每天接種1 mL(1～4)×108CFU/mL的菌液。該方法常與感染球蟲(chóng)、IBDV疫苗接種等有關(guān)雞壞死性腸炎的危險(xiǎn)因素相結(jié)合[21]。除了通過(guò)飼料或致病菌株直接灌胃感染以外，目前有研究人員選擇將雞群暴露在被產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的環(huán)境中進(jìn)行自然感染[22]，雖然他們也取得不錯(cuò)的結(jié)果，但此種方法在不同群體間很難標(biāo)準(zhǔn)化，且重復(fù)性差，因此并不值得推廣。

1.3 球蟲(chóng)感染因素球蟲(chóng)引起的腸道上皮損傷是雞壞死性腸炎的主要誘發(fā)因素之一，產(chǎn)氣莢膜梭菌之所以能夠快速?gòu)?fù)制并分泌大量外毒素，可能是因?yàn)榍蛳x(chóng)感染造成雞腸道黏膜損傷為產(chǎn)氣莢膜梭菌提供了有利于菌株生長(zhǎng)的大量氨基酸和富含蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)，也可能是因?yàn)榍蛳x(chóng)病引起的腸黏液分泌異常有利于菌株的生長(zhǎng)繁殖[21]。也有研究表明，由艾美耳屬球蟲(chóng)感染(Eimeriaacervulina、E.brunetti、E.maxima的混合體)引起的腸道微生物菌群的顯著變化是產(chǎn)氣莢膜梭菌快速?gòu)?fù)制并產(chǎn)生毒素的促成因素[23]。由于以上這些原因，在試驗(yàn)誘導(dǎo)壞死性腸炎時(shí)艾美耳屬球蟲(chóng)經(jīng)常與產(chǎn)氣莢膜梭菌聯(lián)合使用。然而，球蟲(chóng)本身會(huì)對(duì)雞群腸道產(chǎn)生嚴(yán)重的損害甚至導(dǎo)致其死亡，因此必須謹(jǐn)慎選擇球蟲(chóng)種類(lèi)和接種劑量。一般使用感染十二指腸的堆型艾美耳球蟲(chóng)(E.acervulina)或感染小腸的巨型艾美耳球蟲(chóng)(E.maxima)進(jìn)行球蟲(chóng)誘導(dǎo)試驗(yàn)。同時(shí)球蟲(chóng)的劑量也很重要，一般使用(2～5)×104E.acervulina或(2～5)×104E.maxima與產(chǎn)氣莢膜梭菌聯(lián)合誘發(fā)疫病。此外，球蟲(chóng)的感染時(shí)間對(duì)于成功誘導(dǎo)雞群產(chǎn)生壞死性腸炎至關(guān)關(guān)鍵，一般不超過(guò)產(chǎn)氣莢膜梭菌接種前4 d對(duì)雞群接種球蟲(chóng)，以便球蟲(chóng)引起的腸道損傷與梭菌引起的癥狀同時(shí)發(fā)生。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物因素

1.4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫抑制 研究表明發(fā)生免疫抑制的雞更容易發(fā)生壞死性腸炎，雞群感染如傳染性法氏囊病病毒、馬立克病病毒、雞白血病病毒等能引起機(jī)體的免疫抑制，從而造成雞群壞死性腸炎發(fā)病率增高。因此有研究人員通過(guò)使用傳染性法氏囊炎(infectious bursal disease,IBD)疫苗來(lái)提高壞死性腸炎病變的嚴(yán)重程度[24]，此方法通過(guò)對(duì)雞只注射IBDV疫苗來(lái)完成。雞只在注射IBDV疫苗后，由于免疫抑制的結(jié)果，發(fā)生壞死性腸炎時(shí)的癥狀會(huì)明顯加重[25]。

1.4.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品種、性別和日齡 不同種類(lèi)的雞對(duì)于雞壞死性腸炎的發(fā)病率是不同的，Cobb雞壞死性腸炎發(fā)病率明顯高于Ross雞或Hubbard雞；不同性別、不同日齡的雞對(duì)于壞死性腸炎的發(fā)病率也存在較大差異：生長(zhǎng)速度較快的公雞相較于母雞更容易感染該病，14～20日齡的雛雞體內(nèi)不具有保護(hù)性的母源抗體，更容易暴發(fā)壞死性腸炎疫病[26]。

2 優(yōu)化人工造模方法

雞壞死性腸炎是一種復(fù)雜的多因素疫病，表1總結(jié)了一些能夠引起動(dòng)物發(fā)病的誘導(dǎo)因素[27-28]，在試驗(yàn)中可以通過(guò)人為控制其中的某些因素來(lái)調(diào)控誘導(dǎo)動(dòng)物發(fā)病后產(chǎn)生癥狀的嚴(yán)重程度。

在進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)攻毒階段時(shí)試驗(yàn)人員可以選擇使用哪些感染方式和感染途徑對(duì)雞群進(jìn)行疫病的誘導(dǎo)感染，其中包括：?jiǎn)为?dú)使用具有致病性的含有netB毒素的G型產(chǎn)氣莢膜梭菌通過(guò)灌胃或者摻拌飼料的方式進(jìn)行給藥(試驗(yàn)證明灌胃給藥的途徑最為快捷有效)感染雞群，雞群飼喂時(shí)飼料的選擇可以參照表1中飼料因素羅列的能加重雞壞死性腸炎的飼料進(jìn)行選擇(推薦使用高淀粉多糖的粉料飼喂雞群)；另一種方法是使用球蟲(chóng)或者IBDV與產(chǎn)氣莢膜梭菌聯(lián)合使用[29]：在人工復(fù)制病例過(guò)程中，球蟲(chóng)的使用會(huì)明顯加重疫病的嚴(yán)重程度[30]，但球蟲(chóng)的感染不是必需的，根據(jù)試驗(yàn)的目的可以選擇用或者不用。不同試驗(yàn)?zāi)康乃扇〉木唧w方法和給藥途徑可能不同，這都取決于研究人員的預(yù)期目的以及現(xiàn)行可用的資源。

表1 雞壞死性腸炎的誘導(dǎo)因素

3 雞壞死性腸炎發(fā)病模型的評(píng)分系統(tǒng)

雞壞死性腸炎病例復(fù)制試驗(yàn)中，對(duì)于雞產(chǎn)生的壞死性腸炎進(jìn)行病變?cè)u(píng)分是確定發(fā)病模型是否成功的關(guān)鍵，壞死性腸炎的大體病變包括多灶性至煤樣化的黏膜纖維化至潰瘍性病變，炎癥引起的黏膜壁增厚和黏膜粘連滲出或黏膜脫落導(dǎo)致的黏膜壁變薄或平滑肌張力喪失，腸道伴有或不伴有氣體膨脹，這些變化在嚴(yán)重程度上各不相同。在病變?cè)u(píng)分時(shí)，非常重要的一點(diǎn)是評(píng)估整個(gè)小腸的病變程度，因?yàn)椴∽兛赡苤皇蔷窒抻谑改c，大多數(shù)最嚴(yán)重的病變出現(xiàn)在空腸，但在壞死性腸炎癥狀非常嚴(yán)重的情況下回腸也會(huì)受到影響。目前全球公認(rèn)的壞死性腸炎病變?cè)u(píng)分系統(tǒng)：分別是0～6分制和0～4分制。0～6 分的評(píng)分系統(tǒng)具體評(píng)分細(xì)則，0分：無(wú)明顯病變；1分：腸壁變薄或易碎；2分：1～5個(gè)局灶性壞死；3分： 6～15個(gè)局灶性壞死；4分：16個(gè)或 16個(gè)以上局灶性壞死；5分：2～3 cm的壞死區(qū)域；6分：廣泛、 彌漫性壞死。此外0～4分評(píng)分系統(tǒng)評(píng)分細(xì)則，0分：無(wú)明顯病變；0.5分：腸系膜及小腸壁嚴(yán)重充血；1 分：腸壁變薄、變脆，出血點(diǎn)多于5個(gè)；2分：腸腔內(nèi)有氣體，腸壁出現(xiàn)大量出血點(diǎn)并伴隨少量壞死或潰瘍點(diǎn)；3分：腸壁出現(xiàn)區(qū)域性壞死、潰瘍；4 分：腸腔內(nèi)有大量氣體并出現(xiàn)彌漫性壞死。

為了試驗(yàn)組和對(duì)照組之間進(jìn)行有意義的比較，任何評(píng)分系統(tǒng)都應(yīng)該明確定義病變的嚴(yán)重程度和范圍，其中必須考慮小腸受損的比例，并且無(wú)論該特定試驗(yàn)中最輕微和最嚴(yán)重的病變是什么，都必須嚴(yán)格按照病變?cè)u(píng)分系統(tǒng)對(duì)受損腸道進(jìn)行評(píng)分。例如，有1 cm腸道發(fā)生了非常嚴(yán)重的病變，但在病變?cè)u(píng)分時(shí)具有這1 cm嚴(yán)重?fù)p傷的整個(gè)腸道不能被定義為具有嚴(yán)重的病變。

一些研究人員試圖尋找免疫參數(shù)來(lái)顯示對(duì)壞死性腸炎的嚴(yán)重性，例如，通過(guò)檢測(cè)腸道黏膜中細(xì)胞因子如IL-8、IL-10和IFN-γ等炎性細(xì)胞因子水平的變化也可在一定程度上反映雞壞死性腸炎的病變程度，但其結(jié)果在不同個(gè)體間差異很大，因此目前要用替代的、間接的系統(tǒng)來(lái)評(píng)估壞死性腸炎疫病的嚴(yán)重性，仍然需要很多年的時(shí)間。

4 小結(jié)及展望

4.1 飼料因素、菌株毒素類(lèi)型、菌株培養(yǎng)、球蟲(chóng)誘導(dǎo)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等多種因素對(duì)人工造模的影響程度非淀粉多糖以及大豆類(lèi)的飼料可以改變動(dòng)物體內(nèi)菌群的數(shù)量和消化酶的活性，增加禽類(lèi)患?jí)乃佬阅c炎的幾率；G型產(chǎn)氣莢膜梭菌是雞壞死性腸炎的主要病原，能夠引起雞群暴發(fā)壞死性腸炎疫?。唤?jīng)FTG培養(yǎng)基培養(yǎng)15 h的G型產(chǎn)氣莢膜梭菌具有最強(qiáng)的致病力，更容易導(dǎo)致雞群發(fā)生壞死性腸炎；經(jīng)球蟲(chóng)誘導(dǎo)后雞群腸道發(fā)生損傷，致使雞群腸道微生物發(fā)生變化，更有利于產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)，能夠增大雞群產(chǎn)生壞死性腸炎的幾率；免疫抑制的雞、Cobb雞、公雞以及不具有母源抗體的雛雞更容易感染雞壞死性腸炎病。

4.2 雞壞死性腸炎動(dòng)物發(fā)病模型能夠成功建立需要注意的關(guān)鍵因素及優(yōu)化方案菌株毒素類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是雞壞死性腸炎動(dòng)物發(fā)病模型能夠成功建立需要注意的最關(guān)鍵因素，建議在人工造模時(shí)優(yōu)先選擇netB陽(yáng)性G型產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)SPF試驗(yàn)雞進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，同時(shí)需要結(jié)合自身實(shí)驗(yàn)室情況對(duì)各種誘導(dǎo)因素進(jìn)行篩選，選擇最適合的條件進(jìn)行試驗(yàn)。

4.3 改進(jìn)雞壞死性腸炎的病變?cè)u(píng)分系統(tǒng)建議實(shí)驗(yàn)人員選擇整個(gè)小腸的病變程度進(jìn)行雞壞死性腸炎的病變?cè)u(píng)分，目前全球公認(rèn)的壞死性腸炎病變?cè)u(píng)分系統(tǒng)：分別是0～6分制和0～4分制。同時(shí)需由多人進(jìn)行病變?cè)u(píng)分，再對(duì)病變?cè)u(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由此得到的病變?cè)u(píng)分結(jié)果才更加具有準(zhǔn)確性，才能使得復(fù)制雞壞死性腸炎疫病能更容易成功，對(duì)進(jìn)一步研究雞壞死性腸炎疫病的病理以及分子機(jī)理，篩選有效預(yù)防和控制雞壞死性腸炎的生物制劑具有積極意義。