基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討野生砂生槐生物活性機制

趙年壽，紀 鵬*，魏彥明，武凡琳，拉巴次旦，吳金措姆，馬興斌，華永麗，姚萬玲

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.西藏自治區(qū)農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009)

砂生槐(Sophoramoorcroftiana, SM)在西藏又被稱之為“狼牙刺”和“藏薊”，豆科槐屬植物，多年生矮灌木，為該地區(qū)重要野生植物資源之一。砂生槐提取物具有良好的抗寄生蟲、抗病毒、抗腫瘤、抑菌等藥理活性[1]，但目前對其化學(xué)成分的生物功效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用靶點及效用機制的相關(guān)研究尚不明確，因此有必要對其化學(xué)成分的作用機制進行探討和研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門融入多學(xué)科的交叉學(xué)科，涉及多種學(xué)科，如系統(tǒng)生物學(xué)、高通量篩選和網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)等[2]，與中醫(yī)藥的整體性和系統(tǒng)性相一致，能對多成分、多靶點、多通路進行整合，適用于藥物潛在生物活性的研究[3-5]，有助于臨床靶向藥物的篩選及研究。因此，本研究就基于成分-靶點-通路的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討野生植物砂生槐的藥用物質(zhì)基礎(chǔ)、作用靶點及生物活性作用機制，為野生砂生槐藥用價值的深入開發(fā)奠定良好基礎(chǔ)。

1 方 法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫

PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)；PharmMapper數(shù)據(jù)庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper)；Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/uniport)；STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)；DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)；Cytoscape 3.7.0軟件；ChemDraw 17.1.0軟件；R 3.6.3軟件。

1.2 砂生槐化學(xué)成分收集

CNKI數(shù)據(jù)庫中檢索與“砂生槐”相關(guān)的關(guān)鍵詞，從文獻中篩選出經(jīng)核磁共振和質(zhì)譜等分析手段確認的化學(xué)成分，獲取的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)在ChemDraw 17.1.0軟件Search選項Find structure from name at ChemACX.Com中獲取，并在PubChem數(shù)據(jù)庫中對獲取的結(jié)構(gòu)式進行確認。

1.3 砂生槐化學(xué)成分潛在靶點預(yù)測及基因名標注

利用PubChem數(shù)據(jù)庫獲取砂生槐化學(xué)成分的3D結(jié)構(gòu)，以SDF格式保存，將SDF文件導(dǎo)入Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫，以“Druggable Pharmacophore Models”作為靶點，進行化學(xué)成分藥效團潛在靶點預(yù)測，預(yù)測結(jié)果以Normalized Fit Score>0.6進行篩選，Uniprot數(shù)據(jù)庫進行UniProt ID的校正和轉(zhuǎn)化。

1.4 砂生槐化學(xué)成分靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選的化學(xué)成分靶點輸入到STRING數(shù)據(jù)庫，將最低交互分數(shù)設(shè)置為0.4，構(gòu)建成分靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，獲取的結(jié)果以TSV格式保存。

1.5 構(gòu)建砂生槐化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

PPI靶點網(wǎng)絡(luò)中將靶點和化學(xué)成分作為“節(jié)點””，Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建化學(xué)成分與靶點、靶點間的互作網(wǎng)絡(luò)，從網(wǎng)絡(luò)中篩選出節(jié)點值較高的核心靶點和有效化學(xué)成分。

1.6 GO、KEGG富集分析

為進一步說明砂生槐化學(xué)成分的靶點是如何通過通路來發(fā)揮作用，將砂生槐的化學(xué)成分靶點輸入DAVID數(shù)據(jù)庫中，Select Identifier設(shè)置為OFFICIAL GENE SYMBOL，進行GO生物學(xué)過程(Biological process, BP)、細胞組分(Cell component, CC)、分子功能(Molecular function, MF)及KEGG通路分析，最后采用R 3.6.3軟件構(gòu)建GO和KEGG富集的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1 砂生槐化學(xué)成分的獲取

通過文獻檢索，共搜集到砂生槐化學(xué)成分18種[6-7]，其化學(xué)成分主要包含生物堿類、黃酮類、酯類、甾體類等，這些化學(xué)成分均經(jīng)過核磁共振和質(zhì)譜等分析，具體化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)式如表1所示。

表1 砂生槐化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)

2.2 砂生槐化學(xué)成分潛在靶點預(yù)測及基因名標注

以Normalized Fit Score>0.6篩選PharmMapper數(shù)據(jù)庫中的靶點，刪除重復(fù)并去除假陽性，共獲得518個靶點，靶點頻率較高的有dhp1、ung、dhaK、bglIIR、CDC33等，部分靶點如表2所示。

表2 部分藥效團模型靶蛋白及基因名標注

2.3 構(gòu)建砂生槐成分靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

砂生槐有效活性化學(xué)成分中的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)共包含240個節(jié)點，577條邊，平均節(jié)點度值為4.81，平均局部聚類系數(shù)為0.355，PPI豐富p值為1.12×10-8，如圖1所示，網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點代表靶點，節(jié)點與節(jié)點之間的邊代表蛋白與蛋白的相互作用，不同的顏色代表不同的相互作用，其中度值越大代表在網(wǎng)絡(luò)中的作用越大。利用R語言對PPI分析結(jié)果中的基因節(jié)點數(shù)目進行排列，排列結(jié)果如圖2所示，核心靶點主要有EGF、CREBBP、ERBB2、MDM2、RAC1等。

圖1 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 核心靶點基因條形圖

2.4 砂生槐化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

Cytoscape 3.7.0 軟件構(gòu)建砂生槐化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，從18種化學(xué)成分中共篩選出15種有效化學(xué)成分，網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點值(Degree)越大就表明在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中越重要。有效化學(xué)成分中的節(jié)點值如表3所示，以β-谷甾醇、羽扇醇和貓尾草異黃酮的節(jié)點值最高；靶點基因中的節(jié)點值如表4所示，涉及重要的靶點有MDM2、ERBB2、AR、MTOR、F2、TJP1、NOTCH1等，圖3為化學(xué)成分靶點和靶點互作網(wǎng)絡(luò)圖，左邊代表化學(xué)成分，右邊代表靶點。

圖3 砂生槐活性成分和靶點網(wǎng)絡(luò)

表3 砂生槐有效化學(xué)成分節(jié)點值

表4 砂生槐有效化學(xué)成分靶點基因節(jié)點值

2.5 GO分析

DAVID數(shù)據(jù)庫中共富集到GO條目168個，其中94個條目為生物學(xué)功能(BP)，28個條目為細胞組分功能(CC)，46個條目為分子功能(MF)，分別占總條目的56%，17%和27%；功能富集分析結(jié)果如圖4～6所示。BP主要涉及低氧反應(yīng)(Response to hypoxia)，細胞運動的調(diào)節(jié)(Regulation of cell motility)；CC主要涉及胞漿(Cytosol)，胞外體(Extracellular exosome)；MF主要涉及蛋白結(jié)合(Protein binding)。

圖4 GO生物學(xué)功能富集分析柱狀圖

圖5 GO細胞組分功能富集分析柱狀圖

圖6 GO分子功能富集分析柱狀圖

2.6 KEGG分析

KEGG通路共富集到15條信號通路，通路分析結(jié)果如圖7所示，分析結(jié)果顯示主要涉及的通路為膀胱癌通路(Bladder cancer)、前列腺癌通路(Prostate cancer)、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)控通路(Regulation of actin cytoskeleton)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤通路(Glioma)及cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)，KEGG富集通路及靶點基因如表5所示。

圖7 KEGG通路富集分析氣泡圖

表5 KEGG通路富集及靶點基因

3 討 論

通過構(gòu)建砂生槐化學(xué)成分-靶點的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，從18種化學(xué)成分中共篩選出15種有效成分，節(jié)點值較高的有效成分為甾醇類β-谷甾醇(degree=54)、三萜烯類羽扇醇(degree=49)、黃酮類貓尾草異黃酮(degree=47)、脂肪酸類亞油酸(degree=33)。有研究結(jié)果表明，β-谷甾醇不僅能對多種腫瘤細胞的增殖有顯著的抑制作用，而且還能誘導(dǎo)多種腫瘤細胞發(fā)生凋亡，具有降血脂、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等功能[8-10]；貓尾草異黃酮能對乳頭狀甲狀腺癌產(chǎn)生抑制作用，并對多種實體瘤具有廣泛的抗癌活性[11]；亞油酸對結(jié)腸癌細胞(SW480)有促生長作用[12]?；钚猿煞?靶點的互作網(wǎng)絡(luò)中涉及的重要靶點有MDM2(degree=19)、ERBB2(degree=18)、AR(degree=18)、MTOR(degree=17)。有研究結(jié)果表明，MDM2 T309G突變可降低前列腺癌風(fēng)險，通過對該基因多態(tài)性進行監(jiān)測，有助于前列腺癌的早期診斷、治療和預(yù)后[13-14]；在多種癌癥類型中，酪氨酸激酶受體ERBB2常被過度表達，那拉替尼對ERBB2泛素化介導(dǎo)的胞內(nèi)降解可顯著抑制卵巢癌細胞生長[15]，且ERBB2的插入突變可導(dǎo)致乳腺癌細胞的加速生長[16]。該結(jié)果與本研究篩選到的結(jié)果相符合，進一步表明砂生槐發(fā)揮藥理活性是其多個化學(xué)成分與多個靶點基因的相互作用。

GO富集結(jié)果表明，生物過程的94個條目中主要為低氧反應(yīng)、細胞運動調(diào)節(jié)，分子功能的28個條目中主要為蛋白結(jié)合，細胞組分的46個條目中主要為胞漿、胞外體，該部分的分析結(jié)果表明，砂生槐中的化學(xué)成分可能通過對節(jié)點值較高的MDM2、ERBB2、AR、MTOR靶點進行調(diào)控，從而影響胞漿和胞外體的細胞學(xué)組分來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成作用，進而影響疾病的產(chǎn)生與發(fā)展。在15條KEGG富集通路中，4條通路涉及癌通路、3條涉及代謝通路及cAMP、FoxO 2條信號通路。靶點MDM2、ERBB2、MTOR在多條富集通路中多次出現(xiàn)，進一步提示砂生槐中的化學(xué)成分物質(zhì)可能通過與關(guān)鍵靶點的相互作用從而對癌癥、代謝等疾病的產(chǎn)生和凋亡進行調(diào)控。cAMP信號通路作為發(fā)揮重要功能作用的第二信使，在動物中介導(dǎo)激素效應(yīng)，參與基因表達、細胞增殖等[17]；FoxO信號通路在腫瘤抑制、細胞損傷代謝調(diào)節(jié)和免疫等方面發(fā)揮著重要作用[18]。因此，可推測MDM2、ERBB2、MTOR靶點與cAMP、FoxO信號通路的共同互作是砂生槐發(fā)揮多種生物活性的最主要原因。

綜上所述，本研究首次借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討并獲取了砂生槐化學(xué)成分的主要活性成分、關(guān)鍵靶點及涉及的生物通路，初步揭示了砂生槐中的多成分、多靶點協(xié)同作用的特點。通過該方法，一方面證實了砂生槐已有成分的生物活性作用研究，另一方面發(fā)現(xiàn)砂生槐通過調(diào)控節(jié)點值較高的靶點及其它基因，從而對代謝類疾病、神經(jīng)性等多種疾病達到治療和預(yù)防的效果。本研究結(jié)果期望能為后期癌癥類、代謝類、神經(jīng)系統(tǒng)類疾病的治療及野生砂生槐作為藥用資源的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。