蘋婆果殼總酚酸提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究

張 鵬，花燕瑩，陳欣榮，唐 森，謝濟運

(1.廣西科技師范學院 食品與生化工程學院，廣西 來賓 546199；2.廣西科技師范學院 特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點實驗室，廣西 來賓 546199；3.廣西科技師范學院 實驗實訓中心，廣西 來賓 546199)

蘋婆果又名鳳眼果、七角果、九層皮，是隸屬于梧桐科(Sterculiaceae)蘋婆屬(SterculiaLinn)的常綠喬木植物蘋婆(SterculianobilisSmith)的種子，該植物自然分布于我國廣東、廣西南部、福建東南部、云南南部和臺灣，印度、越南、印度尼西亞等國均有種植，已有1000多年的栽培歷史[1]。

蘋婆有較高的食、藥用價值和景觀價值。種仁營養(yǎng)豐富，可食用，味如板栗，含有18種氨基酸，富含酚類物質(zhì)，有較強的抗氧化能力[2]。《中藥大辭典》記載蘋婆種子味甘性溫，具有和胃消食、解毒殺蟲、明目壯陽等功效，用于治療翻胃吐食，蟲積腹痛，疝痛，小兒爛頭瘍等癥[3]。蘋婆木材韌性強，可做家具、箱盒及一般建材。樹皮纖維含量為36%，可代替麻制繩索或織麻袋，亦為造紙原料[4]。蘋婆葉片大，兩面光潔，兩廣人喜歡用其葉包粽子，裹糍耙[5]。蘋婆果殼性平味淡，內(nèi)服用于中耳炎，血痢，疝氣，外用于痔瘡[6]。蘋婆樹姿高大優(yōu)美，花形美觀，葉大而碧綠，冠大而蔭濃，是優(yōu)良的園林綠化樹種[7]。

酚酸是在高等植物中廣泛分布的含有酚羥基和羧基的一類重要的次生代謝產(chǎn)物[8]，具有抗氧化[9-10]、抗菌[11]、抗癌[12]等一系列生物活性。目前，蘋婆屬植物資源化學成分的研究主要集中于種子、樹皮、樹葉等原料上，而對于蘋婆果殼總酚酸類物質(zhì)的提取工藝研究卻鮮有報道[2,13-19]。本研究以乙醇-水溶液為提取溶劑對蘋婆果殼進行微波輔助提取，以蘋婆果殼總酚酸提取量為考察指標，通過單因素試驗和Box-Behnken響應(yīng)面分析法，篩選出微波輔助提取蘋婆果殼總酚酸的最優(yōu)提取工藝。最后采用羥基自由基清除能力實驗來評價蘋婆果殼總酚酸的抗氧化活性，以期為蘋婆果殼的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋婆果：采自于廣西壯族自治區(qū)北海市石灣鎮(zhèn)江北街道兩旁蘋婆樹。

無水乙醇，AR(西隴化工股份有限公司)；沒食子酸標準品，HPLC≥98%，批號110831-201906(合肥博美生物科技有限責任公司)；福林酚，BR(上海麥克林生化科技有限公司)；L-抗壞血酸，AR(國藥集團化學試劑有限公司)；水楊酸，AR(天津市致遠化學試劑有限公司)；30%過氧化氫(西隴化工股份有限公司)；無水碳酸鈉，AR(天津市北辰方正試劑廠)。試驗過程中使用的水均為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

中草藥粉碎機(FW-135，天津市泰斯特儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計(UV-2600，島津企業(yè)管理(中國)有限公司)；電子分析天平(FA-2004B，上海越平科學儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-1001VN，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；實驗室微波合成儀(XH-MC-1，北京翔鵠科技發(fā)展有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-IIIG，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-S4，金壇市醫(yī)療儀器廠)；臺式高速離心機(H1850，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(GZX-GF101-3-BS-Ⅱ，上海滬粵明科學儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

選取新鮮蘋婆果，取其果殼，分割成1 cm見方的小塊，置于烘箱內(nèi)45℃烘干。粉碎，過80目標準篩后，置于自封袋密封，儲于干燥避光處備用。

1.3.2 總酚酸提取工藝

稱取蘋婆果殼粉末1.0 g置于250 mL磨口錐形瓶中，按料液比加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液后，置于微波合成儀中并連接冷凝管，按試驗設(shè)計方案設(shè)定的條件進行微波輔助提取，提取液經(jīng)4 000 r/min離心10 min，取上清液，即為總酚酸提取液。

1.3.3 總酚酸含量的測定

1.3.3.1 最大吸收波長的確定 精密稱取5.0 mg沒食子酸標準品，用80%乙醇溶液溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，搖勻，定容至刻度線，即得濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸標準儲備液。采用Folin-Ciocalteu比色法顯色[20-21]，用紫外—可見分光光度計在波長400～800 nm范圍內(nèi)對蘋婆果殼總酚酸和沒食子酸標準溶液進行全波長掃描，根據(jù)獲得的吸收光譜圖來確定最大吸收波長。

1.3.3.2 沒食子酸標準曲線的制作 精密移取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL沒食子酸標準儲備液于10 mL比色管中，分別加入福林酚試劑1.0 mL和20% Na2CO3溶液4.0 mL，混勻，用蒸餾水稀釋至10 mL，定容，避光靜置2 h。以空白試劑作對照，在765 nm 處測定吸光度值Q，以質(zhì)量體積濃度Cg(ug/mL)為橫坐標，吸光度值Q為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3.3 總酚酸提取量的計算 每個提取實驗重復3次，按公式(1)計算總酚酸提取量：

(1)

式中：C——供試品溶液中總酚酸濃度，ug/mL；V——提取液定容體積，mL；N——稀釋倍數(shù)；M——蘋婆果殼質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 微波功率對蘋婆果殼總酚酸提取量的影響 稱取果殼粉末1.0 g，固定液料比80∶1(mL/g)，50%乙醇為溶劑，設(shè)定微波時間為9 min，分別在微波功率為300、400、500、600、700、800 W條件下進行試驗，考察微波功率對總酚酸提取量的影響。

1.3.4.2 乙醇體積分數(shù)對蘋婆果殼總酚酸提取量的影響 稱取果殼粉末1.0 g，固定液料比為80∶1(mL/g)，微波功率為500 W，微波時間9 min，分別以濃度40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇為溶劑進行試驗，考察乙醇體積分數(shù)對總酚酸提取量的影響。

1.3.4.3 微波時間對蘋婆果殼總酚酸提取量的影響 稱取果殼粉末1.0 g，固定液料比80∶1(mL/g)，50%乙醇為溶劑，設(shè)定微波功率為500 W，分別在微波時間為1、3、5、7、9、11 min條件下進行試驗，考察微波提取時間對總酚酸提取量的影響。

1.3.4.4 液料比對蘋婆果殼總酚酸提取量的影響 稱取果殼粉末1.0 g，50%乙醇為溶劑，微波功率為500 W，微波時間9 min，分別以液料比為20∶1、35∶1、50∶1、65∶1、80∶1、95∶1(mL/g)進行試驗，考察液料比對總酚酸提取量的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert V8.0.6.1軟件中Box-Behnken Design(BBD)進行試驗設(shè)計，選取微波功率(A)、乙醇體積分數(shù)(B)、微波時間(C)、液料比(D)四個對總酚酸提取量有影響的試驗因素為自變量，分別以1、0、-1對每個自變量的高、中、低水平進行編碼。以總酚酸提取量(Y)為響應(yīng)值，建立四因素三水平BBD響應(yīng)面試驗研究，各試驗因素及水平設(shè)計見表1。

表1 試驗設(shè)計因素水平表

1.3.6 總酚酸抗氧化活性測定

參考許建本等[18]的方法，在比色管中加入9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液0.5 mL，再加入不同濃度的蘋婆果殼總酚酸溶液1.0 mL，加入9.0 mmol/L FeSO4溶液0.5 mL，3.5 mL蒸餾水，再加入8.8 mmol/LH2O2溶液5.0 mL，搖勻后放置15 min，在510 nm 處測定吸光度，記為A1；用0.5 mL蒸餾水代替FeSO4溶液，測得的吸光度記為A2；取1.0 mL 蒸餾水代替總酚酸提取液測得的吸光度記為A3。各吸光度均平行測定三次，按公式(2)計算羥基自由基清除率P，最后取平均值。同時以VC作陽性對照。

(2)

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

以上所有試驗重復3次。采用Origin 2018軟件作圖，運用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析中的“Duncan”多重比較法分析數(shù)據(jù)間的差異顯著性，P<0.05為差異顯著，圖中用字母標記法表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線的制作

總酚酸提取液及沒食子酸標準溶液顯色后的全波長掃描結(jié)果如圖1所示，在400～800 nm范圍內(nèi)，總酚酸提取液及沒食子酸標準溶液顯色后，最大吸收峰值在765 nm出現(xiàn)。故選擇765 nm為最大吸收波長，同時也表明提取液中存在酚酸類物質(zhì)。以沒食子酸標準溶液質(zhì)量體積濃度Cg(ug/mL)為橫坐標，吸光度值Q為縱坐標繪制標準曲線，在1.0～7.0 ug/mL范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系，擬合線性回歸方程為：Q=0.111Cg+0.015，R2=0.999 1。

圖1 總酚酸提取液及沒食子酸標準溶液顯色后的全波長掃描圖(400～800 nm)

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 微波功率對蘋婆果殼總酚酸提取量的影響

圖2表明，在微波功率為500 W時，總酚酸達到最大提取量為15.42 mg/g，微波功率在300～500 W范圍內(nèi)，總酚酸提取量隨著微波功率的增加而提高。原因可能是微波穿透蘋婆果殼細胞膜到達細胞內(nèi)部，使細胞內(nèi)部的溫度迅速上升，導致細胞破裂，其內(nèi)的酚酸類化合物自由流出并溶解于提取溶劑中[22]。當微波功率大于500 W時，總酚酸提取量開始呈下降趨勢，這可能是由于微波功率過大，整個反應(yīng)體系的溫度急劇上升，導致熱不穩(wěn)定的酚酸類物質(zhì)發(fā)生了降解[22-23]。故確定微波功率為500 W。

圖2 微波功率對總酚酸提取量的影響

2.2.2 乙醇體積分數(shù)對蘋婆果殼總酚酸提取量的影響

圖3表明，在乙醇溶液體積分數(shù)為50%時，總酚酸提取量的最大值為15.67 mg/g。乙醇體積分數(shù)在40%～50%范圍內(nèi)，總酚酸提取量隨著乙醇體積分數(shù)的增加而提高。這表明目標成分更容易溶解于50%乙醇溶液中。當乙醇體積分數(shù)高于50%時，總酚酸提取量下降。可能由于一些脂溶性成分、醇溶性雜質(zhì)溶出降低了組織的通透性，導致總酚酸提取量下降[22]。故將乙醇體積分數(shù)確定為50%。

圖3 乙醇體積分數(shù)對總酚酸提取量的影響

2.2.3 微波時間對蘋婆果殼總酚酸提取量的影響

圖4表明，在微波時間為9 min時總酚酸提取量達到最大值，為15.79 mg/g，在1～9 min內(nèi)，隨著時間的延長，總酚酸含量逐漸升高，可能是酚酸類化合物從植物細胞內(nèi)溶解到溶液中需要一定時間[22]。提取時間超過9 min后，總酚酸提取量開始下降，原因可能是微波處理時間太長，反應(yīng)體系長時間處于高溫狀態(tài)，使已經(jīng)溶出的酚酸類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)遭到破壞[24]，從而使總酚酸的提取量下降。故將微波時間確定為9 min。

圖4 微波時間對總酚酸提取量的影響

2.2.4 液料比對蘋婆果殼總酚酸提取量的影響

圖5表明，當液料比為80∶1(mL/g)時總酚酸提取量達到最大值為15.86 mg/g，在液料比為20∶1～80∶1(mL/g)范圍內(nèi)，總酚酸提取量逐漸增大，由于溶劑的質(zhì)量增加，使溶液傳質(zhì)推動力變強，同時溶液間的滲透壓變化差異大，物料與溶劑的互相作用變多，總酚酸借此更迅速地溶出，提取量也提高[22]。當液料比大于80∶1之后，總酚酸提取量的下降。提取溶劑使用量隨著料液比增加而加大，溶劑使用過量易造成浪費，同時給后續(xù)的離心、溶劑回收等工作增加難度[23]。故將液料比確定為80∶1(mL/g)。

圖5 液料比對總酚酸提取量的影響

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

依據(jù)響應(yīng)面法設(shè)計四因素試驗，本次試驗共有分為兩種類型的29個試驗點，第一類為析因試驗點，是自變量取值在A、B、C、D所構(gòu)成的三維頂點，析因試驗點共有24個。第二類為位于區(qū)域中心的各自變量均為零水平的重復試驗點，用來檢驗回歸方程與中心試驗點的擬合情況，同時可以提供剩余自由度，以提高試驗的精度，本次試驗設(shè)計零點實驗重復5次。軟件設(shè)計出的試驗方案見表2，按“1.3.2項”方法進行總酚酸提取試驗，按“1.3.3項”方法測定總酚酸提取量。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

2.3.2 模型建立與顯著性檢驗

用Design expert V8.0.6.1軟件對表2數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到響應(yīng)值Y與自變量A、B、C、D的回歸方程：Y=15.67+0.16A-0.82B+0.49C+1.09D+0.24AB-0.13AC-0.16AD-0.32BC-0.87BD+0.3CD-1.45A2-1.91B2-0.84C2-1.58D2?；貧w方程各項系數(shù)的正、負反映了各因素對響應(yīng)值影響的方向，系數(shù)絕對值的大小反映影響的程度。4個因素的變化對總酚酸提取量的影響顯著性大小依次為：D>B>C>A，即液料比>乙醇體積分數(shù)>微波時間>微波功率。

回歸模型方差分析見表3，選用模型F=100.24，概率值P<0.000 1，證明本次試驗所選取的二次回歸模型是極顯著的，具有統(tǒng)計學意義；失擬項F=1.17，概率值P=0.479 2>0.05，失擬不顯著，證明該回歸方程不存在失擬因素，回歸模型與實測值擬合較好；一次項A對總酚酸提取量的影響達到顯著效應(yīng)(P<0.05)，一次項B、C、D達到極顯著效應(yīng)(P<0.01)；交互作用項BD影響極顯著(P<0.01)，AB、BC、CD影響顯著(P<0.05)，AC、AD影響不顯著(P>0.05)；二次項A2、B2、C2、D2影響極顯著(P<0.01)，由此可知各因素對總酚酸提取量的影響不是簡單的一次關(guān)系。

表3 回歸模型方差分析表

回歸方程可信度分析見表4，該模型的決定系數(shù)R2為0.990 1，說明有99.01%的響應(yīng)值的變化可以用該模型來解釋，調(diào)整系數(shù)R2為0.980 2，表明該模型有較好的擬合度，變異系數(shù)為1.67，表明試驗有較高的精確度，可靠性強。綜上所述，該模型可以用來優(yōu)化和預測總酚酸的最佳提取工藝條件。

表4 回歸方程可信度分析

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

因數(shù)之間的交互作用可以從等高線的形狀、密集程度和響應(yīng)曲面的陡峭程度來判斷。等高線密集、形狀呈扁平或橢圓形，響應(yīng)曲面比較陡峭表明試驗因數(shù)的變化對響應(yīng)值影響較大，表明兩組因素間的交互作用較大。反之，等高線稀疏、形狀接近圓形，響應(yīng)曲面相對比較平緩表明兩組因素的交互作用較小[20-23]。除此之外，還要結(jié)合方差分析的結(jié)果綜合分析交互作用是否具有顯著性。如圖6并結(jié)合表3結(jié)果可知，AB、BC、CD交互作用對總酚酸提取量影響顯著(P<0.05)。同理BD交互作用影響極顯著(P<0.01)，AC、AD影響不顯著(P>0.05)。

圖6 各因素交互作用對總酚酸提取量的影響

2.3.4 驗證實驗

通過Design-expert 8.0軟件中的“Numerical”程序分析預測得出最佳提取工藝參數(shù)為：微波功率497.09 W、乙醇體積分數(shù)46.34%、微波時間9.9 min、液料比87.33∶1(mL/g)，此時理論預測值為16.19 mg/g?？紤]到試驗的實際操作性，將最優(yōu)工藝條件校正為：微波功率500 W、乙醇體積分數(shù)46%、微波時間9.9 min、液料比87∶1(mL/g)，在此條件下，經(jīng)5次平行實驗得到總酚酸提取量的平均值為16.37 mg/g(RSD=0.28%)，該結(jié)果與理論預測值接近，說明經(jīng)響應(yīng)面試驗優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)是可靠穩(wěn)定的。

2.4 總酚酸抗氧化活性研究

將總酚酸和VC按照一定濃度梯度進行配制，測定·OH清除率，算出相應(yīng)IC50值進行總酚酸的抗氧化性評價。如圖7(a)所示，在為0至0.30 mg/mL的總酚酸質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，·OH清除率不斷增加，當濃度為0.30 mg/mL時，最大清除率為88.97%，選取該范圍內(nèi)的質(zhì)量濃度的·OH清除率進行線性擬合。如圖7(b)所示，R2=0.997，說明線性擬合所得的回歸方程線性關(guān)系顯著。VC也有相似的結(jié)果，如圖7(c,d)所示。依據(jù)上述方法計算出總酚酸IC50值為0.10 mg/mL，VC的IC50值為0.35 mg/mL。由此可知，蘋婆果殼總酚酸對羥基自由基的清除能力強于VC。結(jié)果表明蘋婆果殼總酚酸表現(xiàn)出較強的抗氧化性。

圖7 不同濃度總酚酸(a,b)和VC(c,d)對羥基自由基的清除率及線性擬合結(jié)果

3 結(jié) 論

采用微波輔助提取蘋婆果殼總酚酸，利用響應(yīng)面試驗法得到最佳工藝參數(shù)為微波功率500 W、乙醇體積分數(shù)46%、微波時間9.9 min、液料比87:1(mL/g)，在該條件下總酚酸的提取量為16.37 mg/g。抗氧化試驗結(jié)果表明，蘋婆果殼總酚酸具有很強的羥基自由基清除能力，IC50值為0.10 mg/mL。本研究為從蘋婆果殼中提取總酚酸提供了一種經(jīng)濟可行的方法，為蘋婆植物資源開發(fā)利用提供新思路。