滇重樓多糖對牛蛙心臟和腓腸肌影響的比較研究

吳楊陽，張真真,2，黃蘭杰，沙愛龍*

(1.重慶三峽學(xué)院 教師教育學(xué)院，重慶 萬州 404120；2.重慶市合川瑞山中學(xué)，重慶 合川 401520)

滇重樓[Parispolyphyllavar.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.]為百合科(Liliaceae)重樓屬(Paris)多年生草本植物，別名獨角蓮、草河車、七葉一枝花等，被我國歷版的《中國藥典》所記載[1]，主要分布在我國云南各地州及四川攀枝花、貴州安順和黔西南州等地區(qū)[2]。其作為道地藥材，在中藥學(xué)上具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，滇重樓主要含有甾體皂苷、多糖類、黃酮類和胡蘿卜素等多種活性成分[4-5]，具有抗腫瘤[6]、抗氧化[7]、鎮(zhèn)痛止血[8]和免疫調(diào)節(jié)[9]等藥理作用。目前，滇重樓有效成分藥理學(xué)研究主要集中在皂苷類上，多糖亦為其活性成分之一，但對于滇重樓多糖的研究報道所見甚少，僅見抗氧化[3]、降血脂[10]、保肝護肝[10]和免疫調(diào)節(jié)[9]，關(guān)于滇重樓多糖在心臟和肌肉方面的研究目前未見報道。牛蛙的心臟由心肌構(gòu)成，而其腓腸肌由骨骼肌構(gòu)成，心肌和骨骼肌在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、收縮性、興奮性、傳導(dǎo)性等生理特性和收縮機制方面均不盡相同，因此當(dāng)?shù)嶂貥嵌嗵亲饔糜谂Ｍ苄呐K和腓腸肌時，對二者生理特性影響程度和變化很可能不同。本試驗擬研究不同濃度滇重樓多糖對牛蛙心臟和腓腸肌二者生理特性的影響，并比較其異同。

1 材料與藥品、儀器

1.1 材料

牛蛙(購于重慶市萬州區(qū)永輝超市)12只，體重約250 g～300 g。

1.2 藥品及儀器

滇重樓多糖(樂美天醫(yī)藥/德斯特生物公司生產(chǎn)，批號：DS0190911-170)；任氏液(自制，取 6.5 g NaCl、0.14g KCl、0.12 g CaCl2、0.2 g NaHCO3、0.01 g NaH2PO4、2 g 葡萄糖，加入1000 mL蒸餾水，混勻)；BL-420F生物信號采集處理系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；張力換能器(成都泰盟軟件有限公司)；電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；斯氏蛙心插管、蛙心夾、引導(dǎo)電極(成都泰盟軟件有限公司)。

2 試驗方法

2.1 牛蛙離體心臟的制備及給藥

將牛蛙進行雙毀髓，暴露出完整的心臟。利用常規(guī)的斯氏蛙心插管法進行插管，固定好蛙心套管后離體心臟，及時將血液更換成新鮮任氏液[11]。蛙心夾夾取少許心尖，通過細(xì)線與張力換能器相連，然后通過引導(dǎo)電極連接好BL-420F生物信號采集處理系統(tǒng)，按照常規(guī)方法設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)[11]。向離體的心臟內(nèi)分別灌入低(1.25 mg/mL)、中(2.5 mg/mL)、高(5 mg/mL)濃度的滇重樓多糖溶液，在每次灌流后均用任氏液沖洗心臟3～5次，待心縮曲線恢復(fù)后再進行下一步操作。分別記錄給藥前和給藥后的心肌收縮幅度和心率。

2.2 牛蛙在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本的制備及給藥、記錄

參照沙愛龍等[12]方法制備在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本，向腓腸肌中滴加任氏液浸潤10～20 min穩(wěn)定腓腸肌。利用細(xì)線將腓腸肌與張力換能器相連，然后通過引導(dǎo)電極連接好BL-420F生物信號采集處理系統(tǒng)，按照常規(guī)方法設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)并記錄腓腸肌收縮各指標(biāo)[11]。將腓腸肌完全浸入到盛有高濃度(5 mg/mL)滇重樓多糖溶液的培養(yǎng)皿中，浸泡10 min后立即記錄腓腸肌收縮各指標(biāo)。分別記錄給藥前和給藥后的標(biāo)本閾刺激、最大刺激和腓腸肌收縮潛伏期、收縮幅度、收縮時間、舒張時間。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

3 結(jié)果

3.1 滇重樓多糖對牛蛙心臟生理特性的影響

3.1.1 滇重樓多糖對牛蛙離體心臟收縮幅度的影響

由表1和圖1可知，與給藥前相比，不同濃度的滇重樓多糖對牛蛙心肌收縮幅度均起抑制作用。其中，低濃度組影響不顯著(P>0.05)，而中濃度組和高濃度組抑制均極顯著(P<0.01)，并且隨著濃度的升高，抑制率增加，對心肌收縮幅度的抑制更加明顯。

表1 滇重樓多糖對牛蛙離體心臟收縮幅度的影響

圖1 滇重樓多糖對牛蛙離體心臟收縮的影響

3.1.2 滇重樓多糖對牛蛙心率的影響

由表2和圖1可知，與給藥前相比，低濃度多糖對牛蛙心率并沒有太大影響，給藥前和給藥后的心率都是在32次/min之間變化，中濃度滇重樓多糖對牛蛙心率起促進作用，而高濃度的滇重樓多糖對牛蛙心率起抑制作用。雖然不同濃度滇重樓多糖對牛蛙的心率都有些許影響，但是影響都不顯著，尤其是低濃度的多糖，給藥前和給藥后的牛蛙心率變化率為0。

表2 滇重樓多糖對牛蛙心率的影響

3.2 滇重樓多糖對牛蛙腓腸肌生理特性的影響

本試驗由在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌的試驗數(shù)據(jù)來表示滇重樓多糖對牛蛙腓腸肌生理特性的影響。

3.2.1 滇重樓多糖對牛蛙在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌閾刺激和最大刺激的影響

由表3可知，與浸潤滇重樓多糖前相比，高濃度滇重樓多糖對牛蛙在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌的閾刺激和最大刺激都有一定的影響。其中，對于閾刺激來說，滇重樓多糖起了抑制作用，但變化并不顯著(P>0.05)。而對于最大刺激來說，浸潤后比浸潤前明顯增加，并且促進效果極顯著(P<0.01)。

表3 滇重樓多糖對牛蛙在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌閾刺激和最大刺激的影響

3.2.2 滇重樓多糖對牛蛙在體腓腸肌收縮潛伏期、收縮幅度、收縮速率和舒張速率的影響

由表4和圖2可知，高濃度滇重樓多糖對牛蛙腓腸肌收縮潛伏期、收縮幅度、收縮速率和舒張速率均具有促進作用。其中，對收縮潛伏期促進顯著(P<0.05)，對收縮幅度、收縮速率和舒張速率的促進均極顯著(P<0.01)，特別是舒張速率，在浸潤多糖后，腓腸肌的舒張速率極大增加，促進率甚至高達(dá)436.03%。

表4 滇重樓多糖對牛蛙在體腓腸肌收縮潛伏期、收縮幅度、收縮速率和舒張速率的影響

圖2 滇重樓多糖對牛蛙在體腓腸肌單收縮的影響

4 討 論

心臟不斷地有秩序的、協(xié)調(diào)的收縮與舒張，是實現(xiàn)泵血功能的必要條件，而心臟的這種功能是依賴于心肌細(xì)胞的生理特性，包括自動節(jié)律性、收縮性、傳導(dǎo)性、興奮性等[13]。靜脈竇為牛蛙正常起搏點，牛蛙心室的節(jié)律由靜脈竇自動節(jié)律性所控制，其自律性產(chǎn)生機制主要取決于延遲整流鉀電流(IK)、內(nèi)向離子流(If電流)和T型鈣電流(ICa-T)[14]。靜脈竇發(fā)出的動作電位經(jīng)由特殊傳導(dǎo)系統(tǒng)傳到心室，誘發(fā)心室肌細(xì)胞動作電位，該動作電位產(chǎn)生機制主要取決于去極化的電壓門控快INa通道、ICa-T和復(fù)極化的瞬時外向電流(Ito)、L型鈣電流(ICa-L)、IK、內(nèi)向整流鉀電流(IK1)[14]，尤其是去極化過程。心室肌收縮是在肌膜動作電位觸發(fā)下發(fā)生興奮-收縮耦聯(lián)，引起肌絲滑行實現(xiàn)的。由于心肌細(xì)胞的肌質(zhì)網(wǎng)不如骨骼肌發(fā)達(dá)，貯存的Ca2+量很少，其興奮-收縮耦聯(lián)過程高度依賴于外源性的Ca2+內(nèi)流。由本試驗結(jié)果可知，滇重樓多糖對牛蛙心肌收縮幅度具有明顯的抑制作用，但對其心率無影響，很有可能是因為：滇重樓多糖對IK、If電流和ICa-T無影響，但對快INa通道具有阻斷作用，可通過結(jié)合靶位點1阻斷INa；滇重樓多糖通過抑制心肌膜ICa-L從而抑制外源性Ca2+內(nèi)流。

在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本內(nèi)有許多興奮性不同的運動單位，當(dāng)刺激強度達(dá)到閾刺激時會引起少數(shù)興奮性高的運動單位興奮，表現(xiàn)出少數(shù)肌纖維同時收縮產(chǎn)生較小的肌張力，當(dāng)刺激強度達(dá)到最大刺激時興奮性低的運動單位也會興奮，從而腓腸肌收縮產(chǎn)生最大張力。由本試驗結(jié)果得知，滇重樓多糖對牛蛙在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌的閾刺激沒有明顯影響但可使其最大刺激極顯著增加(P<0.01)，可能是因為滇重樓多糖能使很多興奮性低的運動單位興奮性增強，而對興奮性高的運動單位影響不大。

骨骼肌由肌管系統(tǒng)、肌小節(jié)和肌原纖維構(gòu)成，因肌管系統(tǒng)內(nèi)縱行肌質(zhì)網(wǎng)膜上鈣泵的作用，使得終池內(nèi)Ca2+濃度很高，T管膜和肌膜中的ICa-L可使終池內(nèi)Ca2+順濃度差釋放到胞質(zhì)中，從而觸發(fā)肌絲滑行[14]。最早由Huxley A F和 Huxley H E提出的肌絲滑行理論，目前仍被用來解釋肌絲收縮的機制[15]。當(dāng)肌細(xì)胞收縮時肌原纖維的縮短并不是肌絲本身縮短，而是細(xì)肌絲向粗肌絲滑行，滑行中由于肌肉的負(fù)荷而受阻，產(chǎn)生張力。而橫橋的循環(huán)擺動在肌肉中是非同步的，從而肌肉產(chǎn)生恒定的張力和連續(xù)的縮短，橫橋循環(huán)擺動的參入數(shù)目及擺動速率，是決定肌肉縮短程度、速度和肌張力的關(guān)鍵因素[14]。從本試驗結(jié)果可知，滇重樓多糖對牛蛙腓腸肌收縮潛伏期、收縮幅度、收縮速率和舒張速率均具有明顯促進作用(潛伏期P<0.05，其余3項P<0.01)?？赡苁且驗椋旱嶂貥嵌嗵菍管膜和肌膜中的ICa-L具有激動作用，可使終池內(nèi)Ca2+釋放增多；滇重樓多糖能使參與循環(huán)擺動的橫橋數(shù)量增多，使橫橋擺動速率變快；滇重樓多糖能使縱行肌質(zhì)網(wǎng)膜上鈣泵的活動增強。

心肌收縮與骨骼肌收縮存在差異。由于骨骼肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞產(chǎn)生興奮的時間不同，骨骼肌細(xì)胞動作電位產(chǎn)生快，故骨骼肌可以產(chǎn)生強直收縮；而心肌細(xì)胞動作電位持續(xù)時間長，心肌細(xì)胞興奮過程中有效不應(yīng)期特別長，故心肌不會產(chǎn)生強直收縮，其收縮和舒張始終會交替進行。除此外，心肌和骨骼肌在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、傳導(dǎo)性、收縮機制方面也存在差異。諸多差異便導(dǎo)致滇重樓多糖對心肌和骨骼肌生理特性影響程度和變化不同。

本試驗材料之所以選用牛蛙，其原因主要有以下幾點：牛蛙心室和坐骨神經(jīng)-腓腸肌的解剖結(jié)構(gòu)、生理特性和人、哺乳動物類似，如骨骼肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞的生物電活動、心肌和骨骼肌的收縮舒張等都與人、哺乳動物十分相似[12]，肌絲滑行等生理學(xué)有關(guān)理論也可以用來解釋牛蛙的生理特性；牛蛙為兩棲動物，屬于變溫動物，心臟離體后不需要保證恒溫環(huán)境，其心臟無冠狀動脈，心肌細(xì)胞直接從心腔血液中獲得營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，不需要額外通氧氣?？傊Ｍ茈x體心臟和在體坐骨神經(jīng)-腓腸肌所需生存條件比較簡單，易于掌握和控制，可以在室溫條件下一段時間內(nèi)保持生理活性[12]。故選用牛蛙作為試驗材料，可研究滇重樓多糖對人、哺乳動物心臟和骨骼肌生理特性的影響。本研究結(jié)果表明，滇重樓多糖對心臟收縮具有抑制作用，對骨骼肌收縮舒張具有促進作用。由此可推斷，滇重樓多糖有望用于L型鈣通道阻滯藥、抗高血壓藥、抗疲勞藥[16]、治療骨骼肌疾病(如肌營養(yǎng)不良癥、肌管性肌病、感染性肌病、代謝性肌病)等藥物的研發(fā)。