阿納其根總黃酮提取工藝及其對(duì)Tau蛋白過(guò)度磷酸化的研究

高 莉，孫云鵬，霍仕霞，阿娜爾·馬木提，買買提·艾力，閆 明

(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011)

阿納其根是羅馬除蟲(chóng)菊Anacycluspyrethrum(L.)DC.(AP)的根，干熱、味辛辣而麻舌，具有祛寒強(qiáng)筋、開(kāi)通阻滯、通利經(jīng)水、滋補(bǔ)神經(jīng)等功效[1-2]，主要用于治療白癜風(fēng)、腫瘤、膝骨關(guān)節(jié)炎等疾病[2-4]，主要分布于北非和歐洲南部，我國(guó)新疆有少量的野生資源分布。阿納其根主要含有黃酮類、揮發(fā)油類、N-烷基類、香豆素類等化學(xué)成分[5]，黃酮類被認(rèn)為是其主要活性成分之一，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖[3]、酪氨酸酶激活[6]、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[7]和調(diào)節(jié)情緒[8]等功效。目前，阿納其根的研究報(bào)道主要為對(duì)其化學(xué)成分分析和藥效作用的評(píng)價(jià)方面，而對(duì)于其總黃酮類成分提取及作用機(jī)制方面報(bào)道甚少。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)法是可靠的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析方法，可通過(guò)過(guò)程的回歸擬合計(jì)算出響應(yīng)于各因素水平的響應(yīng)值，在提取試驗(yàn)中往往能夠得到最優(yōu)工藝參數(shù)，是解決多變量問(wèn)題的一種有效統(tǒng)計(jì)方法[9-10]。本研究根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化乙醇提取阿納其根總黃酮的提取工藝，同時(shí)，基于前期研究發(fā)現(xiàn)的其具有改善岡田酸(okadaic acid，OA)對(duì)PC12細(xì)胞損傷的作用基礎(chǔ)上[7]，探討阿納其根總黃酮是否通過(guò)抑制Tau蛋白過(guò)度磷酸化作用起到細(xì)胞保護(hù)作用，為阿納其根進(jìn)行更深入的研發(fā)和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%，上海源葉生物科技有限公司)；阿納其根(新疆麥迪森維藥有限公司)；(+)-兒茶素、福林酚/Folin&Ciocalteu’s phenol reagent、無(wú)水碳酸鈉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、硝酸鋁、石油醚(沸程60-90℃)、濃鹽酸、亞硝酸鈉(均為國(guó)產(chǎn)分析純)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Thermo公司)；一抗Tau(p ser-396)、Tau(p ser 199/202)、Tau(p Thr231)(美國(guó)Abcam公司)；二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)儀器

調(diào)溫電熱套(DZTW型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；電子分析天平(SQP型，德國(guó)賽多利斯)；恒溫水浴鍋(XMTD-7000型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(Go 1510型，美國(guó)Thermo Fisher)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA型上海亞榮生化儀器廠)；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-BA95型，鞏義市英峪予華儀器廠)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；垂直電泳儀(125-BR型，美國(guó)Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR型，美國(guó)Bio-Rad公司)；高速冷凍離心機(jī)(Allegra 64R型，德國(guó)Benkman公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱量干燥恒重蘆丁5 mg，用70%的乙醇溶解并定容至100 mL，得到濃度為0.05 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液至25 mL容量瓶中，加70%乙醇至10 mL，然后分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.7 mL，混勻靜置6 min后，各加入10%硝酸鋁溶液0.7 mL，搖勻后靜置6 min。最后加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，用蒸餾水定容至25 mL，搖勻，靜置15 min。檢測(cè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品510 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=0.1218C+0.0006，R2=0.9976；A為吸光度，C為蘆丁的濃度(mg/mL)。

2.2 阿納其根總黃酮的提取及得率測(cè)定

精密稱取干燥的藥材粗粉2 g，加入70%乙醇溶液20 mL，浸泡12 h，80℃水浴，回流提取2 h，提取2次，減壓抽濾，合并濾液，于70℃條件下減壓濃縮，干燥，稱重。準(zhǔn)確稱取樣品20 mg，加70%的乙醇溶液50 mL。取樣品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，按2.1方法操作，測(cè)定樣品吸光值，按照公式(1)計(jì)算黃酮得率。

黃酮得率(mg/g)=C×5×V/M

(1)

式中：C為回歸方程計(jì)算的樣品黃酮含量，(mg/mL)；5為測(cè)定用樣品體積，mL；V為樣品總體積，mL；M為阿納其根質(zhì)量，g。

2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

精密稱取藥材粗粉2g，其他條件固定不變，分別對(duì)液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溫度、乙醇濃度5個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。液料比分別為6∶1、8∶1、10∶1、12∶1；提取時(shí)間分別為1、2、3、4 h；提取次數(shù)分別為1、2、3、4次；提取溫度分別為60℃、80℃、100℃；乙醇濃度分別為60%、70%、80%、90%；然后減壓抽濾，濃縮，干燥，稱重。按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，依據(jù)回歸方程計(jì)算總黃酮含量。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)、液料比(D)為自變量，阿納其根總黃酮含量(Y)為響應(yīng)值，采用4因素3水平的響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

2.5 阿納其根總黃酮對(duì)OA損傷PC12細(xì)胞存活率的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h，設(shè)空白組、對(duì)照組、模型組和阿納其根總黃酮給藥組(2.5、5.0、10.0 mg/mL)，每組設(shè)6個(gè)平行孔。空白組(不含細(xì)胞)加入等體積不含OA的PBS溶液，對(duì)照組加入等體積不含OA的培養(yǎng)液，模型組和給藥組加入含有20 nmoL/LOA1640培養(yǎng)基，37℃溫育24 h后吸棄培養(yǎng)基，給藥組再加入含有不同濃度阿納其根總黃酮(2.5、5.0、10.0 mg/mL)的培養(yǎng)基(空白組加入等體積PBS溶液，對(duì)照組及模型組加入同體積細(xì)胞培養(yǎng)液)，然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，空白組每孔加入20 μL PBS溶液，其余各組每孔加入20 μL(5 g/L)的MTT，反應(yīng)4 h，吸出溶液，空白組每孔加入100 μL PBS溶液，其余各組每孔加入等體積DMSO，震蕩混勻，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值[11]。細(xì)胞存活率(%)=(加藥組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

2.6 阿納其根總黃酮對(duì)OA損傷PC12細(xì)胞Tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響

用24孔細(xì)胞板培養(yǎng)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)平行孔，同1.6的方法造模、給藥后，吸棄培養(yǎng)基，加入PBS將細(xì)胞吹打下來(lái)，混懸，1000 r/min離心10 min，用PBS反復(fù)洗2次，提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。用5% 濃縮膠和10%分離膠電泳，濕轉(zhuǎn)，封閉。一抗(1：1000)4℃孵育過(guò)夜，1×TBST震蕩洗滌3次，二抗(1：3000)孵育1h，1×TBST洗滌3次。避光，加入現(xiàn)配發(fā)光液，曝光，照相，用軟件定量分析。

2.7 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

從圖1(A)可見(jiàn)，在液料比為8∶1～14∶1范圍內(nèi)，隨著乙醇用量的增加，總黃酮得率逐漸提高，在液料比為12∶1時(shí)趨于平緩，故選擇料液比8∶1～12∶1進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。從圖1(B)可見(jiàn)，在提取時(shí)間為60～100 min范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，總黃酮得率先提高后降低，于2 h時(shí)最高，故選取提取時(shí)間1～3 h 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。從圖1(C)可見(jiàn)，在提取次數(shù)為1～4次范圍內(nèi)，隨著提取次數(shù)增加，總黃酮得率先增大后減小，于提取2次時(shí)最大，故最終確定最佳提取次數(shù)為2次。從圖1(D)可見(jiàn)，在乙醇濃度為60%～90%范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度升高，總黃酮得率先增大后減小，乙醇濃度為70%時(shí)，總黃酮的提取效果最好，故選擇乙醇濃度60%～80%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。從圖1(E)可見(jiàn)，在提取溫度為60～100℃范圍內(nèi)，總黃酮得率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，于提取溫度為80℃時(shí)達(dá)到最高，之后有所下降，故選取提取溫度為70～90℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

綜合單因素結(jié)果，按照表1的因素與水平設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出，各因素的中心點(diǎn)試驗(yàn)阿納其根黃酮含量值均高于析因點(diǎn)試驗(yàn)，與單因素試驗(yàn)結(jié)果相符，說(shuō)明該響應(yīng)面設(shè)計(jì)的29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可信度較高。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3.2.2 回歸方程的建立及方差分析

Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多元二次回歸擬合，見(jiàn)表3。

表3 阿納其根醇提物總黃酮提取回歸模型的方差分析

由方差分析結(jié)果可知，推測(cè)影響提取率因素為A> C> D> B，模型P<0.01，表明響應(yīng)面回歸達(dá)到極顯著水平，模型回歸顯著可靠，A、C、D因素對(duì)阿納其根黃酮得率的影響極顯著(P<0.01)。同時(shí)，A的平方項(xiàng)對(duì)阿納其根總黃酮得率的影響極顯著，C和D的交互作用以及C和D的平方項(xiàng)對(duì)阿納其根總黃酮得率影響顯著，說(shuō)明A、C和D對(duì)阿納其根總黃酮得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，平方項(xiàng)和交互項(xiàng)也有很重要的作用，這與模型分析的結(jié)果相符；失擬項(xiàng)P=0.0633>0.05，表明實(shí)驗(yàn)以外的其他因素對(duì)本實(shí)驗(yàn)的影響?。荒Ｐ偷腞2為 97.63%，接近1，證明試驗(yàn)數(shù)據(jù)較可靠，該模型擬合度較高，可以用于乙醇提取阿納其根總黃酮的理論預(yù)測(cè)。

3.2.3 響應(yīng)面分析

分別以A、B、C和D為響應(yīng)因子，由回歸方程得出對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面分析圖和等高線分析圖，直觀分析各因素交互作用對(duì)阿納其根醇提物總黃酮率的影響。

乙醇濃度與提取時(shí)間、提取溫度和液料比的交互作用對(duì)阿納其根總黃酮提取率的影響如圖2(A)、2(B)、3(C)所示，乙醇濃度在60%～65%時(shí)，阿納其根總黃酮提取率逐漸增高，乙醇濃度超過(guò)65%時(shí)，總黃酮提取率隨乙醇濃度降低而減少，固定乙醇濃度時(shí)，總黃酮提取率均隨提取時(shí)間、提取溫度和液料比的增大而增加；提取時(shí)間與提取溫度和液料比的交互作用對(duì)阿納其根總黃酮提取率的影響如圖2(D)、2(E)所示，固定提取時(shí)間時(shí)，總黃酮提取率隨提取溫度和液料比的增大而增加，而固定提取溫度和液料比時(shí)，總黃酮提取率隨提取時(shí)間的變化不明顯；提取溫度與液料比的交互作用對(duì)阿納其根總黃酮提取率的影響如圖2(F)所示，固定提取溫度時(shí)，總黃酮提取率隨液料比的增大而增加，而固定液料比時(shí)，總黃酮提取率隨提取溫度的升高而明顯增加。圖2(B)、2(C)、2(F)對(duì)響應(yīng)面坡度影響最大，說(shuō)明乙醇濃度與提取溫度、料液比對(duì)總黃酮的提取影響較大。

圖2 不同影響因素交互作用的響應(yīng)面圖(左側(cè))和等高線圖(右側(cè))

3.2.4 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面圖直觀分析，由Design-Expert軟件分析出醇提法提取阿納其根總黃酮的最佳提取條件為提取溫度87.93℃、乙醇濃度64.46%、液料比11.79 mL/g、提取時(shí)間62 min，回歸方程預(yù)測(cè)值為11.0458 mg/g。為了驗(yàn)證該方法的可行性，結(jié)合實(shí)際的操作情況，在提取溫度90℃、乙醇濃度為65%、提取時(shí)間為60 min、液料比12 mL/g 的條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，得到阿納其根總黃酮含量為(11.66±0.12)mg/g，與方程預(yù)測(cè)值相吻。

3.3 阿納其根總黃酮對(duì)岡田酸損傷PC12細(xì)胞存活率的影響

由圖3可見(jiàn)，與對(duì)照組細(xì)胞相比，模型組PC12細(xì)胞經(jīng)20 nmoL/L岡田酸損傷24 h后，細(xì)胞存活率顯著降低，模型組存活率僅為(61.06±4.07)%(P<0.01)。與模型組相比，阿納其根總黃酮各給藥組能夠明顯改善岡田酸損傷PC12細(xì)胞的現(xiàn)象，顯著提高細(xì)胞存活率(P<0.01)，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖3 阿納其根總黃酮對(duì)岡田酸損傷的PC12細(xì)胞存活率的影響

3.4 阿納其根總黃酮對(duì)岡田酸損傷PC12細(xì)胞Tau蛋白過(guò)度磷酸化的蛋白表達(dá)檢測(cè)

由圖4可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞Tau蛋白ser-199/202、ser-231和 ser-396位點(diǎn)磷酸化的表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，阿納其根總黃酮各給藥組細(xì)胞Tau蛋白這四個(gè)位點(diǎn)的磷酸化表達(dá)水平均呈現(xiàn)不同程度的降低，尤其10.0 mg/L劑量組顯著減少Tau蛋白這四個(gè)位點(diǎn)的磷酸化表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，其中阿納其根總黃酮對(duì)Tau蛋白ser-199/202這個(gè)位點(diǎn)的作用最強(qiáng)，在5.0 mg/L劑量時(shí)就能明顯降低其磷酸化表達(dá)水平(P<0.05)。

圖4 阿納其根總黃酮對(duì)岡田酸損傷的PC12細(xì)胞Tau蛋白磷酸化的影響

4 討 論

由Design-Expert響應(yīng)面優(yōu)化得出最佳條件并按實(shí)際操作情況修改的提取阿納其根總黃酮工藝為提取溫度90℃、乙醇濃度65%、液料比12 mL/g、提取時(shí)間60 min。在此工藝條件下，阿納其根醇提物總黃酮得率預(yù)測(cè)值為11.05%，驗(yàn)證值為11.66%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.61%。

前期研究報(bào)道阿納其根醇提物對(duì)記憶障礙小鼠有改善學(xué)習(xí)記憶的作用[12]，以及調(diào)節(jié)岡田酸損傷的PC12細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞早期凋亡的作用[7]，但其作用機(jī)制不清楚。岡田酸能夠促使神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白Tau蛋白過(guò)度磷酸化，而這種現(xiàn)象與神經(jīng)元變性、神經(jīng)細(xì)胞突觸減少以及機(jī)體的記憶障礙相關(guān)[13]。結(jié)果顯示，在此工藝下獲得的阿納其根總黃酮，在2.5～10.0 mg/mL劑量范圍內(nèi)對(duì)岡田酸損傷的PC12細(xì)胞具有明顯的改善作用，提高細(xì)胞存活率，而在10.0 mg/mL 劑量時(shí)能夠顯著降低岡田酸誘導(dǎo)的Tau蛋白在ser-199/202、ser-231和ser-396位點(diǎn)磷酸化水平增高，表明阿納其根對(duì)岡田酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Tau蛋白過(guò)度磷酸化具有明顯的抑制作用，提示其保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用與其具有調(diào)節(jié)微管相關(guān)蛋白穩(wěn)定性，起到維持細(xì)胞骨架和細(xì)胞形態(tài)作用，從而達(dá)到提高神經(jīng)細(xì)胞的存活率和保護(hù)細(xì)胞的作用有關(guān)。

綜上所述，阿納其根總黃酮得率響應(yīng)方程的回歸分析和驗(yàn)證試驗(yàn)表明，此方法合理可行，利用響應(yīng)面法得到的阿納其根醇提物總黃酮提取工藝參數(shù)真實(shí)有效，這是首次對(duì)阿納其根醇提物總黃酮提取的工藝優(yōu)化，具有參考價(jià)值。阿納其根總黃酮能夠抑制岡田酸致PC12細(xì)胞Tau蛋白的過(guò)度磷酸化，具有促進(jìn)Tau蛋白去磷酸化的作用，為其進(jìn)一步的研發(fā)和應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。