冰菖散吸嗅劑制備及其對(duì)MCI模型小鼠的干預(yù)效果研究

周春梅，顧曉群，白 宇，徐奚如，張 彪*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023)

芳香類中草藥干預(yù)神經(jīng)系統(tǒng)疾病古今均有大量研究，在防治認(rèn)知障礙方面也取得了一定的療效成果[1]。輕度認(rèn)知障礙(Mild cognitive impairment, MCI)是介于正常衰老和阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)之間的一種過渡狀態(tài)，被認(rèn)為是防治AD的“黃金期”[2]。中醫(yī)將MCI歸類為“健忘”，其病因：以腎虛精虧為本，以痰淤交阻為標(biāo)。冰菖散是江蘇省中醫(yī)院老年科自主研制用于早期干預(yù)MCI的經(jīng)驗(yàn)方[3-4]，用法是將冰片(Borneolum)、石菖蒲(Acorustatarinowii)、丁香(CaryophylliFlos)、豬牙皂(GleditsiaeFructusAbnormalis)、川芎(RhizomaChuanxiong)等磨粗粉裝嗅泵鼻吸。其中，石菖蒲為天南星科植物石菖蒲的干燥根莖，芳香濃烈，善“開竅豁痰、醒神益智”；豬牙皂為豆科植物皂莢的成熟干燥不育果實(shí)，氣微，能“開竅祛痰”；川芎為傘形科植物川芎的干燥根莖，氣濃香，善“活血行氣”；丁香為桃金娘科植物丁香的干燥花蕾，芳香濃烈，既“開竅”又“健脾益腎”；冰片為龍腦香科植物龍腦香樹脂析出的天然結(jié)晶，氣清香，善“開竅”。全方“開神竅、化痰淤、補(bǔ)脾腎”，藥少力專，前期臨床研究表明：吸嗅冰菖散能顯著改善遺忘型輕度認(rèn)知障礙(Amnestic mild cognitive impairment，aMCI)患者的情節(jié)記憶[3]。

為適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)，本研究將通過鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取出冰菖散中石菖蒲、丁香、豬牙皂、川芎四味中藥的混合揮發(fā)油以提高諸藥“香氣”的利用率，再加入冰片制備成更加科學(xué)規(guī)范的冰菖散吸嗅劑，并通過經(jīng)鼻給藥干預(yù)MCI模型小鼠觀察其療效，以期為MCI乃至AD的預(yù)防提供參考依據(jù)。

1 冰菖散中揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化

1.1 儀器與材料

1.1.1 主要儀器

循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司,SHZ-D(Ⅲ)型)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司,Thermo Trace 1300-ISQ QD型)；超聲波清洗器(KH-500DE型)；電子分析天平(德國賽多利斯集團(tuán)，BL4100型)；電子分析天平(日本島津公司，AUY 120型)。

1.1.2 主要試劑與藥材

石菖蒲(安徽，切制，批號(hào)：201001)、丁香(江蘇，凈制，小份藥無批號(hào))、豬牙皂(山東，凈制，小份藥無批號(hào))、川芎(四川，切制，批號(hào)：202002)、冰片(貴州，批號(hào)：200301)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)朱育鳳教授鑒定符合2015版《中國藥典》一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。氯化鈉(分析純，天津恒興精細(xì)化工，批號(hào)：20181211)；無水硫酸鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180115)；乙酸乙酯(分析純，廣東光華科技股份有限公司，批號(hào)：20181129)，其他試劑均為分析純。

1.2 方法和結(jié)果

1.2.1 揮發(fā)油正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)《中國藥典》2015年版四部揮發(fā)油測定方法及相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]采用鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油并稍作修改，提取時(shí)間統(tǒng)一為2 h。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以揮發(fā)油的提取量為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì) L9(3)3正交試驗(yàn)因素水平表，見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.2 揮發(fā)油的提取與結(jié)果

分別按照上述因素水平表安排實(shí)驗(yàn)，加熱提取過程中隨時(shí)收集揮發(fā)油，結(jié)束后合并[7]，用無水硫酸鈉干燥靜置離心，讀取體積后移入棕色瓶中，密封于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，結(jié)果見表2。

表2 L9(3)3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

1.2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

方差分析顯示(見表3)，NaCl鹽析輔助對(duì)水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油有顯著影響(P<0.05)，而料液比和水浴時(shí)間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 方差分析結(jié)果

1.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取石菖蒲10 g、豬牙皂10 g、丁香10 g、川芎10 g，按上述最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=3)，揮發(fā)油得量分別為1.51、1.49和1.51 mL，可見該工藝條件穩(wěn)定且重復(fù)性好。

1.3 化學(xué)成分檢測

1.3.1 GC-MS條件

HP-5MS超高惰性毛細(xì)管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)，載氣為氦氣(純度為99.999%)，流速為1 mL/min；進(jìn)樣口溫度為250℃；分流進(jìn)樣，分流比40:1；程序升溫，升溫梯度見表4；進(jìn)樣量為1 μL；電離方式EI，離子源溫度為280℃，電子能量70 eV，傳輸線溫度為280℃，質(zhì)量掃描范圍50～500 m/z，溶劑延遲時(shí)間3 min。

表4 程序升溫梯度

1.3.2 GC-MS結(jié)果與分析

在冰菖散混合揮發(fā)油中加入適量乙酸乙酯制成供試品溶液，按上述條件進(jìn)行GC-MS分析，并用NIST質(zhì)譜圖庫進(jìn)行計(jì)算機(jī)檢索和歸一化法計(jì)算相對(duì)含量見表5，總離子流圖見圖1。

圖1 冰菖散揮發(fā)油總離子流

由表5可知，冰菖散混合揮發(fā)油主要化學(xué)成分中一半以上是丁香酚(55.88%)，是丁香和石菖蒲的主要成分之一。石菖蒲另外兩種成分α-細(xì)辛醚和γ-細(xì)辛醚相對(duì)含量分別為2.19%、1.17%，川芎的主要成分藁本內(nèi)酯相對(duì)含量為1.75%。

表5 冰菖散混合揮發(fā)油主要化學(xué)成分

1.4 冰菖散吸嗅劑制備

1.4.1 人用量換算

冰菖散人臨床用法為5 g藥粉(冰片∶石菖蒲∶豬牙皂∶丁香∶川芎=2∶1∶1∶1∶1)吸嗅10 min(每天兩次共兩周)[3-4]，根據(jù)前述正交試驗(yàn)可折算出人每天10 min最多吸嗅混合揮發(fā)油量約0.7 μL。再根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[8]折算出人每天10 min最多吸嗅冰片量約0.3 mg，

1.4.2 小鼠用冰菖散吸嗅劑制備

按人與動(dòng)物體表面積等效劑量比值換算得：小鼠每天混合揮發(fā)油給藥量約0.1 μL，冰片給藥量約0.05 mg。取100 μL混合揮發(fā)油和50 mg冰片細(xì)粉混合并超聲處理5 min即得小鼠用冰菖散吸嗅劑，分裝于棕色瓶內(nèi)密封保存，4℃冷藏備用。

2 冰菖散吸嗅劑經(jīng)鼻給藥干預(yù)MCI小鼠的療效研究

2.1 主要儀器與材料

多功能酶標(biāo)儀(EnSpire，2300型)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，型號(hào)5417R)，熒光倒置顯微鏡攝像系統(tǒng)(Olympus，型號(hào)：DM13000D)，小鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒(上海酶聯(lián)，批號(hào)：20200819)，鹽酸多奈哌齊(99%，北京華威銳科化工，批號(hào)：HW18C2607-2)，剛果紅染液套裝(Servicebio，貨號(hào)：G1056)，冰菖散吸嗅劑(“1.4.2”制備所得)。

2.2 藥物干預(yù)

5月齡雄性APP/PS1小鼠12只隨機(jī)分為：中藥組，西藥組，模型組；5月齡雄性C57BL/6小鼠4只作為對(duì)照組，均購自南京君科生物工程有限公司。中藥組予冰菖散吸嗅劑(用移液槍打入小鼠鼻孔，每孔0.1 μL)；西藥組予鹽酸多奈哌齊灌胃(0.65 mg/kg)，模型組和對(duì)照組予等劑量生理鹽水灌胃。均單籠單只飼養(yǎng)，共給藥兩周。研究過程經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過(倫理審查編號(hào)：201908A011)。

2.3 筑巢行為檢測

2.3.1 方法

給藥兩周后，第二天在每籠中換入厚約1 cm的刨花墊料，于夜節(jié)律前2 h均勻平鋪放入邊長4.5 cm的正方形無味薄紙巾片16張。在2 h后對(duì)小鼠筑巢質(zhì)量進(jìn)行打分，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]改良的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，完全沒碰紙片；1分，紙片散落在籠子各處，無咬痕；2分，紙片被聚集到籠子一側(cè)，但較松散沒有成型的巢，無明顯咬痕；3分，紙片聚攏折疊，可見成型但較平的巢，部分被撕咬；4分，紙片被撕咬成小塊聚攏折疊成較深的巢，見圖2。均采用盲法打分，記錄小鼠筑巢分?jǐn)?shù)。

圖2 筑巢質(zhì)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.3.2 結(jié)果與分析

如圖3所示，給藥兩周后，中藥組和西藥組MCI模型小鼠的筑巢質(zhì)量得分均顯著提高，與模型組相比，均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

圖3 冰菖散吸嗅劑對(duì)5.5月齡小鼠筑巢得分的影響(**P<0.01)

2.4 病理指標(biāo)檢測

筑巢實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選3只小鼠用于取材，統(tǒng)計(jì)分析同“2.3.2”。

2.4.1 方法

2.4.1.1 采用ELISA法檢測TNF-α含量

無菌采血，離心后取血清保存于-80℃?zhèn)溆谩７椒安襟E按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算相應(yīng)小鼠的TNF-α含量，結(jié)果見圖4。

2.4.1.2 通過剛果紅染色檢測Aβ沉積情況

取腦組織固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度4-5 μm)，將切片進(jìn)行脫蠟至水，然后放入剛果紅染液1 h，純水洗2 min，氫氧化鉀溶液分化至背景基本無色、陽性斑塊明顯，純水清洗，蘇木素復(fù)染3-5 min，純水清洗，返藍(lán)液返藍(lán)，再次用純水沖洗，然后脫水、透明，中性樹膠封片，采集圖像，結(jié)果見圖5。并運(yùn)用Image Pro Plus計(jì)算Aβ斑塊面積用于統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖6。

圖6 冰菖散吸嗅劑對(duì)5.5月齡小鼠腦皮層中Aβ斑塊面積的影(***P<0.001)

2.4.2 結(jié)果與分析

2.4.2.1 小鼠血清TNF-α含量

如圖4所示，給藥兩周后，中藥組和西藥組MCI模型小鼠血清中TNF-α含量均顯著降低，與模型組相比，均具有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。

圖4 冰菖散吸嗅劑對(duì)5.5月齡小鼠血清中TNF-α含量的影響(***P<0.001)

2.4.2.2 小鼠腦中Aβ沉積情況

如圖5、6所示：模型組MCI模型小鼠腦皮層和海馬中均出現(xiàn)Aβ斑塊，中藥組MCI模型小鼠腦皮層和海馬均沒有Aβ沉積，而西藥組MCI模型小鼠只有皮層存在少量Aβ沉積，與模型組相比，具有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。

圖5 冰菖散吸嗅劑對(duì)5.5月齡小鼠腦中Aβ沉積情況的影響

3 討 論

阿爾茨海默病(AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性衰退疾病，俗稱老年癡呆，早期以記憶力下降為主，逐漸發(fā)展為失能、失用，后期多半生活不能自理[11-12]。據(jù)推測[13]，到2050年我國的AD患者將超過3000萬，給家庭和社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)。遺憾的是，至今所研制的藥物均不能逆轉(zhuǎn)AD的病情發(fā)展，而MCI是AD的臨床前期，相對(duì)于不可逆的AD，早期干預(yù)MCI更有價(jià)值。西藥副作用大，中藥湯劑雖有效但療程太長易加重脾腎負(fù)擔(dān)，冰菖散是江蘇省中醫(yī)院老年科按照“簡便廉驗(yàn)”的原則自主研制用于早期干預(yù)MCI的經(jīng)驗(yàn)方[3-4]，配伍精妙緊扣MCI病機(jī)。另外，方中君藥冰片善開竅，現(xiàn)代藥理研究也表明，冰片可以促進(jìn)血腦屏障生理性開放[14]，再加上鼻吸的使用方法，使藥物直達(dá)腦組織。

通過鹽析輔助水蒸氣蒸餾法先將四味中草藥(石菖蒲、丁香、豬牙皂、川芎)的揮發(fā)油提取出來，再將冰片按相應(yīng)比例混入制備成更加科學(xué)規(guī)范的冰菖散吸嗅劑。水蒸氣蒸餾法設(shè)備簡單、容易操作，是最為常用的揮發(fā)油提取方法。加入氯化鈉不僅能加速揮發(fā)油餾出，還能促使油水分層，另外將提取時(shí)間限定為2 h，可以減少由于系統(tǒng)開放、溫度較高等原因造成的損失。優(yōu)選出的揮發(fā)油提取條件出油量較高，且穩(wěn)定可行，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)有一定的參考價(jià)值。

進(jìn)一步運(yùn)用MCI模型APP/PS1小鼠進(jìn)行了為期兩周的療效研究。(1)筑巢行為檢測是最為簡便的療效初查手段，給藥兩周后中藥組(冰菖散吸嗅劑)和西藥組(多奈哌齊)筑巢質(zhì)量均顯著提高。(2)由Aβ沉積形成的老年斑是AD典型病理標(biāo)志之一，最早出現(xiàn)于AD臨床癥狀前幾十年即MCI期(從內(nèi)嗅皮層逐漸累及到海馬)，減少Aβ沉積是干預(yù)MCI的關(guān)鍵內(nèi)容之一。結(jié)果表明：在MCI早期使用冰菖散吸嗅劑經(jīng)鼻給藥能顯著減少甚至消除MCI模型小鼠腦組織中的Aβ斑塊。(3)由Aβ沉積引發(fā)的炎癥連鎖反應(yīng)也是MCI的重要病理表現(xiàn)，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生大量的炎癥因子，其中TNF-α是出現(xiàn)最早的促炎因子[15]。分析ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冰菖散吸嗅劑可以顯著降低MCI模型小鼠血清TNF-α濃度。GC-MS分析結(jié)果顯示冰菖散混合揮發(fā)油的主要成分中超過一半是丁香酚，和方中君藥冰片一樣都具有非常強(qiáng)的抗炎、殺菌作用。

本試驗(yàn)仍然存在一些不足，如水蒸氣蒸餾法雖然簡便易行，但耗時(shí)太長、溫度較高、系統(tǒng)開放會(huì)造成一定的損失，條件允許可以采用較完善的超臨界CO2二萃取法；療效實(shí)驗(yàn)的病理指標(biāo)還可以進(jìn)一步挖掘，后續(xù)將開展抗炎機(jī)制(如信號(hào)通路SIRT1/NF-κB)以及抗凋亡作用等方面的研究。