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    X線對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)的影響

    2021-04-17 02:26:36陳利娜
    關(guān)鍵詞:隱桿繁殖力電離輻射

    陳利娜,劉 志,張 超

    (1.南方醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生化與分子生物學(xué)教研室,廣東 廣州 510515; 2.南方醫(yī)院 超聲科,廣東 廣州 510000;3.湘南學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖南 郴州 423000)

    放射治療(radiotherapy)常用于腫瘤治療,然而電離輻射在殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)也會(huì)損傷正常組織和細(xì)胞,提高腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性是提高腫瘤細(xì)胞殺傷效率和減少健康細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。電離輻射(ionizing radiation)是一種有效的DNA損傷因子,可導(dǎo)致細(xì)胞生物損傷[1]。眾多基因和通路可影響腫瘤放療效果,研究與DNA損傷密切相關(guān)的基因是尋找放療靶基因的方法之一。

    秀麗隱桿線蟲(chóng)(caenorhabditis elegans,C.elegans)有許多高度保守的與人類癌相關(guān)的基因和通路,且對(duì)電離輻射表現(xiàn)出較高的敏感性,是一種理想的電離輻射研究模型[2]。本研究采用X線照射秀麗隱桿線蟲(chóng),檢測(cè)DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá),以及線蟲(chóng)死亡率、生育力變化,探討輻射損傷修復(fù)的分子機(jī)制,為尋找放療潛在靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)N2、大腸桿菌OP50(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)予);NGM培養(yǎng)基、M9緩沖液按照參考文獻(xiàn)[3]配制而成,RNAiso Plus試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑和SYBR?PCR試劑盒(TaKaRa公司);PCR引物(廣州嘉吉生物科技有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 秀麗隱桿線蟲(chóng)的培養(yǎng)及計(jì)數(shù):取50條產(chǎn)卵期秀麗隱桿線蟲(chóng)接種至培養(yǎng)有大腸桿菌菌株OP50的NGM瓊脂平板,于20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3 h,挑走母蟲(chóng)后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。線蟲(chóng)計(jì)數(shù)采用稀釋法:M9緩沖液沖洗收集培養(yǎng)皿中線蟲(chóng)至離心管,稀釋50倍,62 ℃水浴1 min后混勻,取1 mL線蟲(chóng)懸液至畫(huà)好方格的35 mm的培養(yǎng)皿,在體式顯微鏡下放大100倍對(duì)線蟲(chóng)計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)重復(fù)3次,取平均值,再乘以稀釋倍數(shù)即為線蟲(chóng)總數(shù)。

    1.2.2 秀麗隱桿線蟲(chóng)的電離輻射:線蟲(chóng)計(jì)數(shù)后將線蟲(chóng)懸液離心使線蟲(chóng)沉淀,棄去上清,加入相應(yīng)體積的M9緩沖液,使得線蟲(chóng)懸液的濃度為5 000條/200 μL。在含有OP50的NGM培養(yǎng)基中加入5 000條線蟲(chóng)(200 μL),培養(yǎng)48 h后成蟲(chóng)繁殖到約80 000條時(shí)進(jìn)行輻射。使用日立MBR-1520R型X線輻射裝置(Hitachi Co., LTD)調(diào)節(jié)輻射強(qiáng)度為20 Gy/min,并增加濾片使照射場(chǎng)強(qiáng)均一。輻照時(shí)敞口垂直于束流方向放置,置于正對(duì)著束流方向的培養(yǎng)基表面分別照射10 min和20 min,累計(jì)輻射劑量分別為200 Gy和400 Gy。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá):RNAiso Plus試劑提取線蟲(chóng)總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒將合格的總RNA反向轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。使用SYBR?PCR試劑盒在ABI公司7500型實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)qPCR。內(nèi)部參照基因采用gpd-1。用于PCR的基因和引物見(jiàn)表1。2-ΔΔCt值反映基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

    1.2.4 秀麗隱桿線蟲(chóng)死亡率和繁殖力的檢測(cè):線蟲(chóng)經(jīng)200 Gy X線照射后2 h內(nèi)取約5 000條線蟲(chóng)(200 μL)轉(zhuǎn)移至加有400 μmol/L 5-氟脫氧尿苷(FUDR)的NGM培養(yǎng)基,以抑制卵的孵出。繼續(xù)培養(yǎng)2 d后對(duì)活線蟲(chóng)計(jì)數(shù)。線蟲(chóng)死亡率計(jì)算公式如下:[Δ存活數(shù)/存活數(shù)(輻射前)]×100。線蟲(chóng)經(jīng)200 Gy X線照射后2 h內(nèi)取約5 000條線蟲(chóng)(200 μL)轉(zhuǎn)移至新NGM培養(yǎng)基,培養(yǎng)2 d后對(duì)活的子代幼蟲(chóng)計(jì)數(shù),反映線蟲(chóng)的繁殖力。線蟲(chóng)計(jì)數(shù)時(shí),于體式顯微鏡下觀察其形態(tài)和運(yùn)動(dòng)情況,呈正弦曲線樣運(yùn)動(dòng)的線蟲(chóng)為活線蟲(chóng);喪失運(yùn)動(dòng)能力, 咽泵停止運(yùn)動(dòng),多次碰觸無(wú)反應(yīng)的線蟲(chóng)為死亡的線蟲(chóng)。

    1.2.5 輻射相關(guān)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析:將輻射后表達(dá)差異基因?qū)氲鞍踪|(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)STRING (https://string-db.org/),并選擇種類為C.elegans,分析各基因編碼蛋白之間的相互作用及關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 X線影響秀麗隱桿線蟲(chóng)多個(gè)基因的表達(dá)

    X線照射后12個(gè)基因(ced-3、ced-4、ced-9、egl-1、cep-1、rad-51、age-1、daf-2、daf-16、ctl-1、clk-1和spe-26)表達(dá)量增加,2個(gè)基因(mev-1、hsp-12.2)表達(dá)量減少。多組比較結(jié)果顯示,400 Gy組中有8個(gè)基因(ced-3、ced-4、ced-9、rad-51、age-1、daf-2、ctl-1、spe-26)的表達(dá)明顯高于200 Gy組。實(shí)驗(yàn)組的4個(gè)基因(ced-4、cep-1、rad-51、daf-2)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。200 Gy組基因mRNA表達(dá)量的倍數(shù)變化如下:ced-4(2.861±0.243)、cep-1(5.540±1.889)、rad-51(5.530±0.647)、daf-2(4.453±0.686)。400 Gy組數(shù)據(jù)如下:ced-4(9.644±1.022)、cep-1(10.140±1.150)、rad-51(19.017±2.627)、daf-2(8.948±0.907)(圖1)。

    2.2 X線導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲(chóng)死亡率增加、繁殖力下降

    與對(duì)照組相比,200 Gy組的線蟲(chóng)存活率明顯下降。200 Gy X線導(dǎo)致線蟲(chóng)77.23%死亡率(圖2A)。對(duì)照組培養(yǎng)2 d后平均產(chǎn)生線蟲(chóng)后代數(shù)是200 Gy組的2.90倍(圖2B)。

    2.3 秀麗隱桿線蟲(chóng)輻射相關(guān)基因的相互作用

    12個(gè)基因之間具有相互作用,并顯著分為兩組作用密切的基因群。其中,age-1、daf-16和ced-9分別為兩組基因的中心節(jié)點(diǎn)。daf-16和cep-1為兩組基因的關(guān)聯(lián)基因(圖3)。

    3 討論

    電離輻射可促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和DNA修復(fù),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在真核細(xì)胞中產(chǎn)生特定生物效應(yīng)所需的電離輻射劑量與細(xì)胞基因組含有基因數(shù)的多少成反比,秀麗隱桿線蟲(chóng)模型用于研究電離輻射特性時(shí)所需的劑量遠(yuǎn)大于哺乳動(dòng)物[4]。本研究中X線輻射線蟲(chóng)的半致死劑量為200 Gy[5],故輻射劑量定為200 Gy和400 Gy。

    Expression levels, relative to gpd-1( a type of housekeeping gene ), were determined by quantitative real time RT-PCR; *P<0.05,**P<0.01 compared with controls

    A.mortality; B.fertility;*P<0.05 compared with controls圖2 X線對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的影響Fig 2 Effect of X-ray on n=6)

    圖3 輻射相關(guān)基因的蛋白相互作用圖Fig 3 Protein interaction of radiation related genes

    egl-1可使ced-9失活,從而拮抗apaf-1同源基因ced-4激活caspase同源基因ced-3的能力。此外,p53同源基因cep-1可以激活egl-1和ced-13的轉(zhuǎn)錄。因此,cep1、egl-1、ced-3、ced-4和ced-9等基因的相互作用形成了調(diào)控秀麗線蟲(chóng)程序性細(xì)胞死亡和DNA損傷誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞死亡的核心凋亡通路[6-8]。本研究中,線蟲(chóng)輻射后存活數(shù)減少,凋亡相關(guān)基因ced-3、ced-4、cep-1表達(dá)量顯著增加,且隨輻射劑量增加而大幅度增加。基因相互作用分析結(jié)果顯示,cep-1、ced-4、rad-51關(guān)聯(lián)密切。提示這3個(gè)基因?qū)﹄婋x輻射敏感度高,可能是X線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心基因。

    進(jìn)化生物學(xué)表明,繁殖需要付出降低壽命的成本,線蟲(chóng)延長(zhǎng)壽命基因的改變會(huì)導(dǎo)致生育能力下降[9-10]。mev-1突變體使秀麗隱桿線蟲(chóng)平均壽命縮短30%,age-1、clk-1和spe-26、hsp-12.2的突變體,可改變秀麗隱桿線蟲(chóng)的年齡特異性死亡率和生育率[11-12],胰島素信號(hào)通路可提高秀麗隱桿線蟲(chóng)的繁殖力[13]。daf-2是一種類似于胰島素受體的基因,調(diào)節(jié)秀麗隱桿線蟲(chóng)的壽命和滯育。daf-16可加強(qiáng)線蟲(chóng)生殖細(xì)胞損傷的適應(yīng)。daf-2和daf-16都是胰島素信號(hào)通路的重要成員,對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的繁殖力起關(guān)鍵作用[14]。本研究中,經(jīng)輻射處理后的線蟲(chóng)成活率較低,經(jīng)過(guò)2 d培養(yǎng)后產(chǎn)生線蟲(chóng)的后代總數(shù)較少,說(shuō)明200 Gy X線導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲(chóng)的死亡率較高,生育力較低。結(jié)合輻射后線蟲(chóng)基因表達(dá)的變化,推測(cè)X線致使daf-2和daf-16異常高表達(dá),從而抑制胰島素信號(hào)通路,降低線蟲(chóng)生殖質(zhì)量,抑制線蟲(chóng)繁殖。X線可顯著提高線蟲(chóng)daf-2、age-1、clk-1、spe-26的表達(dá),從而改變線蟲(chóng)的死亡率和生育能力。

    綜上所述,X線可影響秀麗隱桿線蟲(chóng)多個(gè)DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá),并導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡率增加、繁殖力下降。age-1、cep-1、ced-4、rad-51和daf-2等基因?qū)線敏感,可能成為潛在的放療靶點(diǎn)。

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