氟吡菌酰胺對非靶標生物的急性毒性效應(yīng)

吳 遲，李 敏，劉新剛，崔少青，孫 田，何明遠*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2.廣西思浦林科技有限公司，南寧 530001）

氟吡菌酰胺（fluopyram）是德國拜耳作物科學公司開發(fā)的苯甲酰胺類殺菌劑和殺線蟲劑，其作用機理為抑制病原菌和線蟲的琥珀酸脫氫酶的活性，阻礙線粒體呼吸，干擾細胞的分裂和生長，進而防止真菌病害及線蟲的發(fā)生[1]。

目前酰胺類殺菌劑在全球的使用量逐年遞增，2016年，靶向琥珀酸脫氫酶的殺菌劑全球銷售額為17億美元，占全球農(nóng)藥市場的3%[2]。其中，氟吡菌酰胺具有內(nèi)吸性強、高效、廣譜等優(yōu)點，已在歐盟、美國、中國等國家和地區(qū)登記使用，可有效防治黃瓜、番茄等多種作物線蟲、白粉病、靶斑病、炭疽病[3]。宋益民等[4]在番茄田施用氟吡菌酰胺產(chǎn)品，對根結(jié)線蟲的防效最高可達75%，并使番茄增產(chǎn)；韓瑞華等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在甘薯田施用41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑可促進甘薯的生長，對甘薯黑斑病、軟腐病和線蟲病的防效分別達82.7%、75.6%和81.13%。目前，關(guān)于氟吡菌酰胺的研究除防治效果外，較多關(guān)注于其毒性，研究對象以鼠類為主。氟吡菌酰胺會通過干擾雌烷受體和雄烷受體基因的表達，造成雌鼠的肝臟細胞癌變[6]；雄鼠會產(chǎn)生過量的甲狀腺激素并形成甲狀腺腫瘤[7]。但是農(nóng)藥在使用過程中不可避免地會流入環(huán)境中，對非靶標生物產(chǎn)生毒害作用。目前關(guān)于氟吡菌酰胺對環(huán)境有益非靶標生物的毒性效應(yīng)的研究成果非常有限，因此有必要開展相關(guān)研究評價其環(huán)境安全性。

本文以97%氟吡菌酰胺原藥為試驗藥劑，分別測定8種非靶標生物（表1）的急性毒性，為氟吡菌酰胺的合理使用提供數(shù)據(jù)支撐。

表1 供試生物

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥劑

97%氟吡菌酰胺原藥由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所提供。

1.1.2 試驗儀器

紫外-可見分光光度計，舜宇恒平UV-2600；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安LDZM-60KCS；電子天平，梅特勒-托利多ME104/02；可調(diào)式移液器，10～100 μL、20～200 μL、100～1 000 μL、500～5 000 μL；超聲波清洗器，昆山KQ-250DE；便攜式溶解氧測定儀，衡欣AZ8403型；溫濕度計，山東仁科RS-WS-WIFI-Y4；數(shù)字式照度表，TES-1330A；便攜式pH計，衡欣AZ9861型；人工氣候箱，寧波賽福PRX-350B；不銹鋼鳥籠；蜂盒；量筒；容量瓶；燒杯等。

1.2 試驗方法

氟吡菌酰胺對8種非靶標生物的急性毒性試驗參照GB/T 31270—2014《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》進行，同時對水生生物試驗濃度進行檢測。

1.2.1 非靶標生物急性毒性試驗

（1）日本鵪鶉急性徑口毒性試驗：選用體重約為100 g的日本鵪鶉為試驗用鳥，試驗開始前12 h禁食。采用膠囊法進行經(jīng)口染毒，設(shè)置有效成分質(zhì)量分數(shù)為2.00×103mg/kg（b.w.）的試驗處理，每個膠囊的平均裝藥量為0.206 g，每只鵪鶉灌喂1個裝藥膠囊，染毒后的鵪鶉放置于鳥籠中，2 h后正常喂食。同時設(shè)置空白對照（灌喂1顆空膠囊），各處理組重復10只鵪鶉，雌雄各5只。試驗周期為7 d，試驗溫度（26±1）℃，光暗周期12 h/12 h（光照/黑暗）。藥劑處理8、24、48、72、96、120、144和168 h時分別觀察試驗用鳥的中毒及死亡情況，計算半致死劑量LD50（7 d）。

（2）意大利蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗：使用二甲基亞砜和吐溫-80助溶氟吡菌酰胺，用50%的蔗糖水配制試驗藥液，以121 μg/蜂（有效成分用量）進行試驗處理。試驗用蜂麻醉后移入蜂籠中，將裝有藥液（200 μL）的飼喂管懸掛在蜂籠上，待蜜蜂取食藥液并消耗完畢后取出飼喂管，換50%的蔗糖水正常飼喂，根據(jù)實際消耗藥劑重量計算染毒劑量。同時設(shè)置空白對照和溶劑對照，各處理組3個重復，每重復10只蜜蜂。試驗周期為48 h，試驗溫度（25±1）℃，全程黑暗。染毒24和48 h分別觀察蜜蜂的中毒及死亡情況，并計算半致死劑量LD50（48 h）。

（3）意大利蜜蜂急性接觸毒性試驗：使用丙酮助溶氟吡菌酰胺并配制成質(zhì)量濃度為5.00×104mg/L的儲備液。將蜜蜂麻醉后，在每只蜜蜂的中胸背板點滴2 μL的儲備液，得到100 μg/蜂的試驗處理。在各處理蜜蜂恢復前裝入蜂籠，飼喂適量的糖水。同時設(shè)置空白對照和溶劑對照，各處理組3個重復，每重復10只蜂。試驗周期為48 h，試驗溫度（25±1）℃，全程黑暗。染毒24和48 h分別觀察密蜂的中毒及死亡情況，并計算半致死劑量LD50（48 h）。

（4）家蠶急性毒性試驗（浸葉法）：使用二甲基亞砜和吐溫-80助溶氟吡菌酰胺，并配制成質(zhì)量濃度分別為400、460、529、608、700和805 mg/L的試驗藥液，將（5.0±0.5）g的桑葉浸泡在50 mL藥液中，藥液在葉片表面均勻分布后陰干。葉片放至12 cm的培養(yǎng)皿中，接入2齡起蠶。同時設(shè)置空白對照和溶劑對照，各處理組3個重復，每重復20頭蠶。試驗周期為96 h，試驗溫度（25±1）℃、濕度（80±5）%。染毒24、48、72和96 h分別觀察試驗用蠶的中毒及死亡情況，并計算半致死濃度LC50（96 h）。

（5）玉米螟赤眼蜂急性毒性試驗：用丙酮溶解并配制成質(zhì)量濃度為295 mg/L的氟吡菌酰胺藥液。采用藥膜法，添加0.700 mL的試驗藥液于螺口瓶中，用烤腸機滾勻吹干成藥膜，得到6.26 μg/cm2的試驗處理，黑暗條件下備用。將羽化后48 h的玉米螟赤眼蜂接入藥膜管中，封口（60±2）min后，將赤眼蜂轉(zhuǎn)入無藥的螺口瓶中，飼喂適量的10%蜂蜜水并用黑棉布封口。同時設(shè)置空白對照和溶劑對照，每管100頭赤眼蜂。試驗周期為24 h，試驗溫度（25±1）℃，濕度（75±5）%，全程黑暗。染毒24 h觀察赤眼蜂的死亡情況，根據(jù)半抑制率LR50（24 h）計算安全系數(shù)。

（6）赤子愛勝蚓急性毒性試驗：用丙酮溶解氟吡菌酰胺原藥并配制成質(zhì)量濃度為1.00×104mg/L的儲備液。10 g石英砂中加入14.5 mL儲備液，混合均勻放置通風櫥使丙酮全部揮發(fā)后，與1 490 g人工土壤混合均勻，得到質(zhì)量分數(shù)為100 mg/kg的試驗用土。同時設(shè)置空白對照和溶劑對照，各處理組3個重復，每重復10條蚯蚓。試驗周期為14 d，試驗溫度（20±1）℃，濕度（80±5）%，全程光照，光照強度（600±50）lx。染毒7和14 d分別觀察蚯蚓的中毒及死亡情況，并計算半致死濃度LC50（14 d）。

（7）斑馬魚急性毒性試驗：用曝氣水溶解氟吡菌酰胺原藥并配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的試驗藥液，每24 h全部試驗藥液更換1次。同時設(shè)置空白對照，不設(shè)置重復，各處理組7尾魚。試驗周期為96 h，試驗溫度（22±1）℃，pH為8.3±0.1，溶解氧含量（90±5）%，光暗周期16 h/8 h（光照/黑暗），水硬度180 mg/L（以CaCO3計）。在染毒后24、48、72和96 h分別觀察斑馬魚的中毒及死亡情況，并計算半致死濃度LC50（96 h）。

（8）大型溞急性活動抑制試驗：用曝氣水溶解氟吡菌酰胺原藥并配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的儲備液，設(shè)置26.9、35.0、45.5、59.2、76.9和100 mg/L 6個試驗處理，每24 h全部試驗藥液更換1次。同時設(shè)置空白對照，各處理組4個重復，每重復5只溞。試驗周期為48 h，試驗溫度（20±1）℃、pH8.3±0.1，光暗周期16 h/8 h（光照/黑暗），水硬度180 mg/L（以CaCO3計）。在染毒后24和48 h分別觀察試驗用溞的中毒及死亡情況，并計算半數(shù)抑制濃度EC50（48 h）。

（9）羊角月牙藻生長抑制試驗：用BG11培養(yǎng)基溶解氟吡菌酰胺原藥并配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的儲備液，設(shè)置4.68、6.79、9.84、14.3、20.7和30.0 mg/L 6個試驗處理，使處理的藻細胞初始濃度為5.00×104個/mL，各處理組染毒藻液轉(zhuǎn)入250 mL的三角瓶中，并置于智能人工氣候箱培養(yǎng)72 h。同時設(shè)置空白對照，各處理組3個重復，每重復90 mL。試驗周期為72 h，試驗溫度（23±1）℃，pH為8.02±0.5，全程光照，光照強度（7 100±100）lx。在染毒后24、48和72 h分別觀察記錄各錐形瓶內(nèi)藻細胞的數(shù)量，并根據(jù)生物量生長抑制百分率和生長率抑制百分率來分別計算EyC50（72 h）和ErC50（72 h）。

1.2.2 水生分析方法的建立

在斑馬魚、大型溞和羊角月牙藻的急性毒性試驗中，分別收集氟吡菌酰胺在羊角月牙藻急性毒性試驗開始0和72 h的藻液、斑馬魚和大型溞急性毒性試驗開始0和24 h的試驗藥液進行測定，若氟吡菌酰胺的濃度變化超過20%，則使用實際濃度表示結(jié)果，反之使用理論濃度。

1.2.2.1 提取凈化

將收集的試驗藥液取2 mL至離心管中，加入2 mL乙腈，充分混勻，2 500 r/min振蕩2 min，收集混合液體過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.2.2.2 分析條件

采用高效液相色譜儀（島津LC-40 DXR）對氟吡菌酰胺進行分析檢測。儀器條件為：色譜柱Shim-pack GIST C18（100 mm×2.1 mm，2 μm），進樣體積5 μL，柱溫箱40℃，流動相0.1%甲酸水＋乙腈（體積比35∶65），流速0.3 mL/min，采集時間4.5 min，檢測器類型為紫外檢測器SPD-40，檢測波長210 nm。

1.2.2.3 標準曲線

在1.2.2.2部分描述的儀器分析方法條件下，分析檢測質(zhì)量濃度為0.100、0.500、1.00、5.00、10.0、50.0、80.0、100、150 mg/L的標樣溶液，擬合峰面積和溶液濃度的標準曲線。

1.2.2.4 添加回收和精密度

分別向魚和溞培養(yǎng)基（去氯自來水）中添加氟吡菌酰胺標準品，配制質(zhì)量濃度為1.50和120 mg/L的溶液；向藻類培養(yǎng)基（BG11）中添加氟吡菌酰胺標準品，配制質(zhì)量濃度為0.500和50.0 mg/L的溶液，各質(zhì)量濃度均設(shè)置5個重復，測定濃度，計算回收率。按照3倍信噪比（S/N）計算得出氟吡菌酰胺在魚和溞培養(yǎng)基中的檢出限為2.15×10-2mg/L，定量限為最低添加濃度1.50 mg/L；在藻培養(yǎng)基中檢出限為2.21×10-2mg/L，定量限為最低添加濃度0.500 mg/L。

1.3 數(shù)據(jù)分析與毒性劃分

使用SPSS 25.0軟件分析氟吡菌酰胺對非靶標生物的急性毒性結(jié)果以及95%置信區(qū)間，毒性等級按《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》標準進行劃分。

2 結(jié)果分析

2.1 水生實測濃度

氟吡菌酰胺在去氯自來水和BG11培養(yǎng)基中的回收率為94.6%～105.0%（表2）。在去氯自來水中的檢出限為2.15×10-2mg/L，定量限為1.50 mg/L；在BG11培養(yǎng)基中的檢出限為2.21×10-2mg/L，定量限為0.500 mg/L。

表2 氟吡菌酰胺的平均添加回收率

試驗結(jié)果顯示，氟吡菌酰胺在水中的實測濃度（表3）均低于理論濃度的80%，因此，采用實際濃度計算氟吡菌酰胺對水生生物的急性毒性。

表3 氟吡菌酰胺在水生急性毒性試驗中的實測濃度

2.2 急性毒性結(jié)果

氟吡菌酰胺對非靶標生物的急性毒性測定結(jié)果見表4。

表4 氟吡菌酰胺對非靶標生物的急性毒性

氟吡菌酰胺對日本鵪鶉半致死劑量大于2.00×103mg/kg（b.w.），受試鵪鶉未出現(xiàn)死亡和明顯的中毒癥狀，毒性等級為低毒；對意大利蜜蜂經(jīng)口半致死劑量大于112 μg/蜂、接觸半致死劑量大于100 μg/蜂，受試蜜蜂未出現(xiàn)死亡和明顯的中毒癥狀，毒性等級為低毒；家蠶半致死濃度為702 mg/L，受試家蠶出現(xiàn)拒食、身體變軟、身體扭曲、吐液、側(cè)倒、假死、生長緩慢等中毒癥狀，毒性等級為低毒；對玉米螟赤眼蜂半抑制率大于6.26 μg/cm2，受試赤眼蜂未出現(xiàn)死亡和明顯的中毒癥狀，風險性等級為低風險；赤子愛勝蚓半致死濃度大于100 mg/kg，受試蚯蚓未出現(xiàn)死亡和明顯的中毒癥狀，毒性等級為低毒；斑馬魚半致死濃度大于15.8 mg/L，受試魚未出現(xiàn)死亡和明顯的中毒癥狀，毒性等級為低毒；大型溞半數(shù)抑制濃度為7.01 mg/L，受試溞出現(xiàn)游動能力減弱、附肢輕微顫動、原地轉(zhuǎn)圈游動等中毒癥狀，毒性等級為中等毒；羊角月牙藻EyC50（72 h）為0.675 mg/L、ErC50（72 h）為2.41 mg/L，受試藻液出現(xiàn)無色透明、顏色較淺等抑制效應(yīng)，毒性等級為中等毒。

3 結(jié)語

非靶標生物在環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著十分重要的作用，因此國內(nèi)外均非常重視農(nóng)藥對非靶標生物毒性風險的相關(guān)研究。本文利用不同的方法測定了氟吡菌酰胺對8種非靶標生物的急性毒性，為氟吡菌酰胺的應(yīng)用補充了生態(tài)毒理學數(shù)據(jù)。研究結(jié)果表明，氟吡菌酰胺對陸生生物和水生生物斑馬魚的毒性等級為低毒，對水生大型溞和羊角月牙藻的毒性等級為中等毒，因此，氟吡菌酰胺在實際田間施用時應(yīng)注意對水溞等水生生物的保護，施藥時遠離水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)，避免在水體中清洗施藥用具。

自科聚亞公司于1966年開發(fā)了第一個酰胺類殺菌劑以來，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，酰胺類殺菌劑現(xiàn)有的代表性品種有甲霜靈、噻呋酰胺、環(huán)酰菌胺和氟唑菌苯胺等[8]。楊石有等[9]測定了噻呋酰胺和環(huán)酰菌胺2種酰胺類殺菌劑對4種非靶標生物的急性毒性，結(jié)果表明，噻呋酰胺對意大利蜜蜂急性經(jīng)口、家蠶、赤子愛勝蚓、斑馬魚的毒性等級依次為中等毒、低毒、低毒和中等毒；環(huán)酰菌胺對意大利蜜蜂急性經(jīng)口、家蠶、赤子愛勝蚓、斑馬魚的毒性等級依次為中等毒、低毒、低毒和中等毒。顧林玲[10]研究發(fā)現(xiàn)，氟唑菌苯胺對日本鵪鶉急性經(jīng)口、鯉魚、水溞、羊角月牙藻的毒性等級依次為低毒、高毒、中等毒和低毒。韓文浩等[11]測定了吡噻菌胺對3種水生非靶標生物的急性毒性，結(jié)果表明，吡噻菌胺對斑馬魚胚胎、大型溞、藻類的毒性等級均為中等毒。因此，根據(jù)文獻報道可知，與氟吡菌酰胺相比，其他酰胺類殺菌劑同樣對陸生生物的毒性較低，并對水生生物具有較高的毒性效應(yīng)，但是氟吡菌酰胺對非靶標生物的毒性比多數(shù)酰胺類殺菌劑更低。因此，在殺菌廣譜、高效的酰胺類殺菌劑中，氟吡菌酰胺是對環(huán)境生物毒性較低的種類之一，本文為氟吡菌酰胺安全使用提供了有力的數(shù)據(jù)支撐。

在評估農(nóng)藥施用于田間的風險時，除考慮對環(huán)境生物的毒性外，還應(yīng)根據(jù)施用量、施用方法和農(nóng)藥理化性質(zhì)等其他因素進行風險評估[12]。美國和歐盟早已開展了風險評估相關(guān)工作并建立了完整的評估體系，我國也在2016年發(fā)布了NY/T 2882—2016《農(nóng)藥登記環(huán)境風險評估指南》，促使了我國風險評估程序規(guī)范化的實現(xiàn)。農(nóng)藥對環(huán)境的風險分析包括暴露分析、效應(yīng)分析和風險表征三步驟，暴露分析是通過農(nóng)藥的施用量和施用方法等信息確定其在環(huán)境中的暴露濃度，效應(yīng)分析是通過農(nóng)藥對環(huán)境生物的急性或慢性毒性數(shù)據(jù)進行計算，風險表征是結(jié)合暴露分析和效應(yīng)分析的結(jié)果評估農(nóng)藥在田間施用的風險[13]。雖然，氟吡菌酰胺等酰胺類殺菌劑對環(huán)境生物的毒性較低，但應(yīng)根據(jù)藥劑的具體GAP信息判斷其對環(huán)境生物的安全性。