低溫乙醇法在豬血漿白蛋白提取中的適用性研究

龔慧芳 張淇美 唐青海 陽希 楊海

摘要 [目的]探索豬血漿白蛋白的高效提取方法。[方法]對低溫乙醇法在豬血漿白蛋白提取中的適用性進行了研究，設定豬血漿白蛋白提取步驟，并對離心速度、反應時間、pH、適用溫度4個關(guān)鍵參數(shù)進行優(yōu)化，對目標蛋白進行定性定量分析。[結(jié)果]低溫乙醇法適合提取豬血漿白蛋白，最佳提取條件為離心速度8 000 r/min，反應時間90 min，pH 4.7，溫度-8 ℃;采用改良后的低溫乙醇法，1 L豬血漿可提取白蛋白29.3 g，產(chǎn)品純度為97.3%，提取時長約10 h。[結(jié)論]改良后的低溫乙醇法是一種高效提取豬血漿白蛋白的可靠方法。

關(guān)鍵詞 豬血漿;白蛋白;提取;低溫乙醇法;優(yōu)化

中圖分類號 TS 251.93文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2021）05-0172-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.048

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research on the Applicability of Low Temperature Ethanol Method in the Extraction of Porcine Plasma Albumin

GONG Hui-fang， ZHANG Qi-mei， TANG Qing-hai et al

（Key Laboratory of Conservation and Utilization of Biological Resources in Nanyue Mountain Area， Hengyang Normal University， Hengyang， Hunan 421008）

Abstract [Objective] To explore an efficient method to extract porcine plasma albumin. [Method] The applicability of low temperature ethanol method in the extraction of porcine plasma albumin was studied， and the four key parameters， centrifugal speed， reaction time， pH and suitable temperature， were optimized;the target protein was analyzed qualitatively and quantitatively. [Result] The results showed that low temperature ethanol method was suitable for the extraction of porcine plasma albumin. The optimum centrifugation speed was 8 000 r/min， the reaction time was 90 min， the pH was 4.7， and the temperature was -8℃;the improved low temperature ethanol method could extract 29.3 g albumin from 1 L pig plasma， the purity of the product was 97.3%， and the extraction time was about 10 h. [Conclusion] The improved low temperature ethanol method is a reliable and efficient method for the extraction of porcine plasma albumin.

Key words Porcine plasma;Albumin;Extraction;Low temperature ethanol method;Optimization

隨著養(yǎng)豬業(yè)的迅猛發(fā)展，豬血等副產(chǎn)品產(chǎn)量急劇增加。據(jù)統(tǒng)計，2018年我國豬血產(chǎn)量接近200萬t，其中被收集利用的不到50%[1]。如何充分利用豬血資源開發(fā)高附加值產(chǎn)品，是擺在科研人員面前的現(xiàn)實課題[2]。

血液占活豬體重的3%～5%，主要由血漿和血細胞組成，其中血漿占血液總體積的55%，蛋白質(zhì)約占血漿總質(zhì)量的6.0%～7.5%。豬血漿含有豐富的纖維蛋白原、白蛋白、球蛋白、凝血因子等活性蛋白，是極具開發(fā)價值和開發(fā)潛力的稀有蛋白[3]。因此，從豬血中提取各種活性蛋白，是生物藥物行業(yè)的現(xiàn)實需求。

隨著血液蛋白提取技術(shù)的日益成熟，大量具有生物活性的血漿源蛋白被提取出來，并最終形成高附加值的醫(yī)療產(chǎn)品，極大地促進了疾病治療和生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。血漿中的白蛋白因在血液循環(huán)、滲透壓維持、解毒、脂類代謝以及物質(zhì)運輸、抗氧化等方面發(fā)揮著非常重要的生理功能，已在醫(yī)療領(lǐng)域得到廣泛應用[5-6]。血漿白蛋白臨床用量的不斷增加以及血源短缺，血漿白蛋白供不應求，需大量進口以彌補市場需求。據(jù)統(tǒng)計，2013、2014、2015、2016、2017年我國進口人血白蛋白分別占白蛋白簽發(fā)總量的46.39%、57.79%、55.59%、58.76%和 59.83%。因豬與人類之間的基因相似度達83%，且飼養(yǎng)管理與疾病預防控制水平日趨成熟，使得從豬血漿中提取白蛋白并加改造修飾以替代人血漿白蛋白具有較大的可能[7]。學者對人血漿白蛋白提取研究與應用一直沒有停步[8-9]，鹽析法、利凡諾法、熱乙醇法等多種提取方法先后建立并被應用，但產(chǎn)品品質(zhì)不高、操作復雜、成本過高、耗時過長、對環(huán)境及設備要求嚴苛以及有害物殘留等不足也逐漸呈現(xiàn)，這些問題阻礙了血漿白蛋白產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[10]。

為開發(fā)豬血漿白蛋白資源，筆者對低溫乙醇法的適用性進行了研究，并確定了離心速度、反應時間、pH、適用溫度等豬血漿白蛋白提取關(guān)鍵參數(shù)，旨在為豬血漿白蛋白的規(guī)?；苽涮峁﹨⒖?。

1 材料與方法

1.1 原料血漿

豬血漿由南岳山區(qū)生物資源保護與利用湖南省重點實驗室制備，具體方法為：采集新鮮豬血，按照9∶1的比例添加3.8%（M/V）的檸檬酸三鈉，攪拌均勻，進行抗凝處理?？鼓河? ℃、1 000 r/min離心30 min，獲取上清液，再于4 ℃、3 000 r/min離心30 min，再次獲取上清液。反復數(shù)次，直至得到清亮的血漿。離心所得血漿分裝后，-20 ℃儲藏備用。

1.2 主要試劑

無水乙醇購自湖南匯虹試劑有限公司，檸檬酸三鈉、丙烯酰胺、過硫酸銨、異丙醇、甘油、TEMED、2-ME等購自上海易恩公司，標準酪蛋白購自Sigma公司，甲雙叉丙烯酰胺、蛋白Mark、SDS購自北京Slarbio公司，溴麝香草酚藍購自上海瑞永公司。

1.3 主要儀器

低溫離心機，Eppendorf;低溫恒溫槽，江蘇恒諾儀器制造有限公司;可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司;pH計，優(yōu)特儀器有限公司;凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司;蛋白超濾系統(tǒng)，美國PALL公司;全自動電泳儀，美國海倫娜公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 豬血漿蛋白含量的測定。采用雙縮脲法測定豬血漿蛋白濃度，各成分配比見表1。具體操作為：將血漿與試劑按表1配比混勻，37 ℃水浴20 min后冷卻至室溫，在紫外分光光度計波長540 nm處進行吸光度值檢測，換算得濃度數(shù)據(jù)。

1.4.2

豬血漿白蛋白的初步分離。①用0.9% 的NaCl溶液稀釋血漿至蛋白含量5%左右，用1 mol/L的檸檬酸調(diào)pH至6.5～6.8，降溫至（1.0±0.5）℃，緩慢加入-15 ℃、95%的乙醇（按每1 000 mL血漿制品加267 mL 95%乙醇計算，并控制乙醇終濃度為20%），邊加入邊攪拌，加完后復調(diào)pH至6.5～6.8。待溫度至-4.5～-5.0 ℃時開始離心，離心溫度控制在-3.0～-5.0 ℃，離心至上清液澄清，去沉淀，取上清液備用。②取上清液，用1 mol/L的醋酸緩沖液調(diào)pH至6.5～6.8，緩慢加入95%的冰乙醇，邊加入邊攪拌，控制最終乙醇濃度為40%左右，加完后復調(diào)pH至6.5～6.8，整個反應溫度控制在-4.2～-5.0 ℃，離心至上清液澄清，棄沉淀，收集上清液。③取上清液，用2 mol/L的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.7～4.8，在低溫條件下（-5.0～-7.0 ℃）離心至上清液澄清，取沉淀，沉淀即為血漿白蛋白。

1.4.3 豬血漿白蛋白純化及過濾。配制沉淀量5倍的8.5%乙醇溶液作為溶解液，溫度控制為3.0～5.0 ℃。白蛋白沉淀稱重后放入溶解液中，攪拌至沉淀完全溶解，此時反應溫度控制在-3.0～-3.5 ℃。待沉淀完全溶解后，用除菌濾膜過濾至濾液澄清，壓濾不超過0.2 MPa。

用1 mol/L碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至6.8～7.1，中空纖維超濾脫醇，濃縮蛋白濃度至10%～13%，采用9倍純水連續(xù)等體積透析，使蛋白終濃度為20%，按1 g蛋白質(zhì)加入0.165 mmol 辛酸鈉，并用1 mol/L碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至6.8～7.2后進行過濾除菌，將成品進行分裝、低溫凍存。

1.4.4

豬血漿白蛋白的定性定量鑒定。采用SDS-PAGE法測定豬血漿白蛋白分子量，具體操作如下：采用5%濃縮膠、10%分離膠，依次上樣后，上層80 V電泳30 min，下層120 V電泳60 min，用凝膠成像系統(tǒng)對SDS-PAGE 電泳結(jié)果進行圖譜分析。

取0.1 g凍干后的粗蛋白沉淀，充分溶于100 mL的純凈水中，利用全自動電泳分析儀完成蛋白定量檢測，直接獲取蛋白純度和含量數(shù)據(jù)。

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法。采用SPSS 15.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白蛋白的定性定量檢測

SDS-PAGE電泳圖譜分析結(jié)果見圖1。由圖1可見，提取產(chǎn)物在6.64 kD處出現(xiàn)標志性條帶，與豬血白蛋白標準品條帶大小一致。全自動電泳分析儀獲得掃描圖像（圖2），結(jié)果顯示，豬血漿白蛋白峰單一且集中，說明提取的蛋白純度較高。

2.2 離心速度對豬血漿白蛋白提取結(jié)果的影響

由檢測結(jié)果可知，離心速度對豬血漿白蛋白得率和純度存在顯著影響，具體見表2。

由表2可知，離心速度在8 000 r/min時，目標蛋白的得率和純度顯著高于6 000和10 000 r/min，說明8 000 r/min的離心速度適合豬血漿白蛋白的提取。

2.3 反應時間對豬血漿白蛋白提取結(jié)果的影響

檢測結(jié)果表明，反應時間對豬血漿白蛋白的提取純度存在顯著影響（表3）。

由表3可知，乙醇與血漿蛋白作用時間為120 min時，蛋白得率和蛋白純度最高，但與作用90 min時沒有顯著差異，為節(jié)約時間、提高提取效率，反應時間采用90 min。

2.4 pH對豬血漿白蛋白提取結(jié)果的影響

由表4可知，當環(huán)境pH為4.7時，目標蛋白的得率和純度最高，且顯著高于pH為4.0和5.4時的得率和純度。

2.5 反應溫度對豬血漿白蛋白提取結(jié)果的影響

結(jié)果見表5。由表5可知，溫度為-8 ℃時，目標蛋白的得率和純度顯著高于-4和-12 ℃，說明提取豬血漿白蛋白的適宜溫度為-8 ℃。

3 結(jié)論與討論

由于豬的遺傳背景、器官大小、形態(tài)和功能與人有著高度的相似性，故豬血液制品在醫(yī)療領(lǐng)域的應用越來越受到廣泛關(guān)注，特別是現(xiàn)在白蛋白在醫(yī)療方面的廣泛應用以及人血的供應不足，導致對豬血白蛋白替代人血白蛋白的研究越來越引起學者的關(guān)注[11]。豬血白蛋白替代人血白蛋白的首要問題是從豬血漿中獲得高質(zhì)量的白蛋白。

低溫乙醇法是人血漿白蛋白提取的常規(guī)方法[9]，其基本原理是低濃度血漿在低溫下加入乙醇，通過降低血漿中水分子的活度來降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白分子間通過極性基團的相互作用，在范德華力的作用下發(fā)生凝聚而沉淀[12]。白蛋白作為血漿主要成分中分子量最小的一種，往往在最后一步的沉淀反應中才能分離出來，因此開展低溫乙醇法在豬血漿白蛋白提取中的適用性研究，探索并確定離心速度、反應時間、pH、適用溫度4個關(guān)鍵參數(shù)對于獲得高純度豬血漿白蛋白具有十分重要的意義。

①基于低溫乙醇法，試驗對豬血漿白蛋白的提取關(guān)鍵要素進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，離心速度在8 000 r/min時，白蛋白得率和純度分別為29.1%和97.0%，顯著高于6 000和10 000 r/min時的得率和純度，說明8 000 r/min的離心速度適合豬血漿白蛋白的分離。離心速度的選擇取決于血漿內(nèi)的蛋白成分和目的蛋白的分子量大小，由于豬血漿內(nèi)充斥著大量脂蛋白，如果離心速度過慢，高密度脂蛋白就不能完全與上清分離，導致蛋白得率和純度下降;如果離心速度過快，溶液中的小分子白蛋白分離不出來，導致白蛋白含量降低，影響下一步提取操作。②保障乙醇與血漿的反應時間（作用時間），主要是為了保障乙醇與血漿中的蛋白成分充分接觸，以充分滲透并影響蛋白分子排列。在實際操作中，如果反應時間太長，提取效率則會降低;如果反應時間太短，則產(chǎn)品純度和得率難以得到保障。該研究結(jié)果表明，作用時間在90 min時，即可達到乙醇充分滲透的效果，且與作用時間為120 min時的得率和純度無顯著差異。③不同的蛋白有不同的等電點，pH主要是通過影響蛋白分子的微環(huán)境，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的溶解狀態(tài)，從而達到促進蛋白沉淀的目的。由于蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，因此蛋白提取過程中的pH控制非常重要。白蛋白含有19個負電荷，等電點在pH 4.0～5.5，該研究結(jié)果表明，pH為4.7較好地促進了白蛋白沉淀，達到了預期效果。④沉淀反應在低溫下進行，主要是降低蛋白溶液中的各分子運動，防止蛋白因乙醇作用而變性。溫度過低，蛋白得率則顯著下降[10];溫度過高，則會使蛋白變性，失去提取意義。該試驗結(jié)果表明，豬血漿白蛋白提取的適宜溫度是-8 ℃。

此外，蛋白初始濃度對豬血漿白蛋白提取也有重要影響[13]。蛋白初始濃度過高，加入乙醇后大量蛋白發(fā)生沉淀，隨著提取過程的深入，目的蛋白得率和純度也會有所降低;蛋白初始濃度過低，蛋白跟水分子析出的時間延長，提取效率也會降低。因此，每一階段的反應都必須嚴格控制蛋白的濃度，當離心速度、反應時間、pH、反應溫度和乙醇添加量都一致的情況下，低溫乙醇法提取效果的高低取決于蛋白分子的濃度。在參考同行的基礎上，該研究采用5%的蛋白初始濃度，取得了較好的試驗效果。

筆者對低溫乙醇法在豬血漿白蛋白提取中的適用性進行了研究，探索并確立了低溫乙醇法提取豬血漿白蛋白的4個關(guān)鍵參數(shù)，可為豬血漿白蛋白的規(guī)?；苽浜拖嚓P(guān)研究提供參考。

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