日本乙型腦炎病毒感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究進展

韓超逸，湯德元，曾智勇，黃 濤，王 彬，郭倩妤，廖少山，張 森，楊志剛，晏仁潭

(貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025)

日本乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)簡稱乙腦，是由日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一種人畜共患的蚊媒傳染病。JEV為黃病毒科，黃病毒屬，單股正鏈RNA病毒。JEV可感染人、馬、豬、水禽等多種動物，其中豬是其擴大宿主，人為其終末宿主[1]。JEV感染人可引起病毒性腦炎，死亡率達25%～30%，50%的存活者會留下永久性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后遺癥，如認知障礙、行為紊亂、失憶[2]。JEV感染豬可引起懷孕母豬流產(chǎn)，產(chǎn)木乃伊及死胎，公豬發(fā)生睪丸炎精液品質下降，對豬業(yè)養(yǎng)殖造成巨大經(jīng)濟損失[3]。目前，JE并無特效治療藥物，控制JEV最有效的手段是接種疫苗。

1 JEV致病機制

JEV感染宿主后，可在淋巴結和外周組織中擴增造成一定的損傷[4-5]，并且JEV可損傷DCs功能，從而抑制CD4+T和CD8+T細胞發(fā)生免疫應答，促進JEV在體內擴散[6]，JEV在體內擴散后可通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，感染神經(jīng)元細胞，被感染的神經(jīng)元細胞釋放促炎因子和趨化因子，這些促炎因子和趨化因子可活化小膠質細胞產(chǎn)生更多的炎癥因子，并且JEV也可直接感染小膠質細胞促進炎癥因子的釋放[7]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎癥因子和趨化因子的增加，可募集外周免疫細胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，再次分泌大量細胞因子和趨化因子，如此循環(huán)反復導致了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中“炎癥風暴”的發(fā)生，這也是導致神經(jīng)元死亡的主要原因[8]。

2 JEV進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)途徑

血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)是由腦微血管內皮細胞、周細胞、星形膠質細胞、神經(jīng)元細胞構成的一道位于外周循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的屏障[9]。BBB是一種選擇透過性屏障，其既可以阻擋病原體和有害物質，又嚴格控制著血液和腦內的物質交換，保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)不受侵害，維持腦內微環(huán)境平衡[10]。

病原體進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)有4種途徑：跨神經(jīng)途徑，一些皰疹病毒可通過鼻腔感染嗅神經(jīng)元，病毒粒子進入嗅球之后感染膠質細胞可引發(fā)病毒性腦炎[11]；跨細胞途徑，肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)可通過血管內皮細胞間隙進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，整個過程并不破壞BBB[12]；細胞旁路途徑，西尼羅病毒(WNV)可感染血管內皮細胞破壞BBB，進入腦內引起腦部病毒性炎癥[13]；特洛伊木馬途徑，人免疫缺陷病毒(HIV)可感染T細胞，當攜帶HIV的T細胞通過BBB時可將HIV帶入大腦[14]。

崔寧一[15]通過足墊注射使小鼠感染JEV，7 d后分離小鼠的腦、嗅球和脊髓檢測JEV含量，發(fā)現(xiàn)在小鼠腦中檢測到JEV，但脊髓和嗅球均未檢測到JEV，表明在小鼠模型中JEV并未通過跨神經(jīng)途徑進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，JEV可感染CD3+T細胞、CD19+B細胞和Ly6c+單核細胞，分離感染JEV小鼠的脾臟細胞與內皮細胞互作，發(fā)現(xiàn)內皮細胞上黏附了大量單核細胞，原因是JEV感染上調了單核細胞LFA-1、VLA-4黏附分子，以及內皮細胞上相應配體ICAM-1、VCAM-1的表達，增強了內皮細胞與單核細胞的黏附作用。JEV對單核細胞及內皮細胞黏附因子及配體的上調，增強了單核細胞與內皮細胞的黏附作用，為JEV以特洛伊木馬途徑通過BBB進入大腦提供了理論支持。

3 JEV感染引起B(yǎng)BB受損

在腦部受到重創(chuàng)或病原體侵入時，BBB完整性和功能會遭到破壞，除此之外花生四烯酸、組胺等化學物質也可破壞BBB。BBB受損會導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)失去保護，引起多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在阿茲海默癥、中風、帕金森等多種疾病中都發(fā)現(xiàn)BBB完整性被破壞。緊密連接是BBB細胞之間的一種連接方式，對于維持BBB完整性有重要意義。緊密連接蛋白包括：咬合蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudins)、連接黏附分子(junction adhesion molecules,JAMs)，閉合小環(huán)蛋白(zona occludin,ZO)可以將咬合蛋白和閉合蛋白連接在內皮細胞骨架上[16]。當緊密連接蛋白occludin、claudin-5、ZO-1表達量及分布發(fā)生變化時，就意味著BBB的通透性和功能發(fā)生了變化[17]。

LI等[18]發(fā)現(xiàn)JEV進入大腦發(fā)生在BBB通透性增加之前，在JEV感染的小鼠大腦中，occludin、claudin-5、ZO-1表達量下降79.63%，56.65%和65.35%，表明JEV感染小鼠增加了BBB通透性。但使用JEV直接感染內皮細胞發(fā)現(xiàn)occludin、ZO-1表達并無變化，而使用感染JEV小鼠的腦提取物處理內皮細胞，發(fā)現(xiàn)2種蛋白表達顯著降低，表明JEV并非增加BBB通透性的直接原因，而是JEV感染所產(chǎn)生的炎性因子通過破壞BBB緊密連接，增加了BBB通透性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，JEV感染注射抗IFN-γ抗體的小鼠與JEV感染小鼠相比，BBB受損程度減輕，表明抑制IFN-γ在JEV感染過程中對BBB有保護作用，IFN-γ可能是治療乙腦的潛在靶點。

婁文娟[19]發(fā)現(xiàn)JEV P3株可活化內皮細胞，降低內皮細胞的早期和晚期凋亡，上調黏附分子配體ICAM-1的表達。為探究JEV-P3株活化內皮細胞是否破壞其細胞屏障功能，使用ECIS檢測JEV P3株感染內皮細胞后，內皮細胞的細胞電阻值及Rb值是否發(fā)生變化，發(fā)現(xiàn)JEV P3株感染內皮細胞后，電阻值及Rb值并未發(fā)生變化，證明JEV P3株感染內皮細胞并未破壞細胞屏障功能以及細胞間連接，而使用發(fā)病小鼠腦上清處理內皮細胞，其電阻值及Rb值顯著下降，證明小鼠腦上清中含有的炎癥因子破壞了內皮細胞的屏障功能和細胞間連接。內皮細胞活化可黏附免疫細胞，使用ECIS檢測與JEV P3株處理脾臟細胞互作的內皮細胞電阻值及Rb值，發(fā)現(xiàn)內皮細胞黏附免疫細胞并不改變內皮細胞的屏障功能和細胞間連接，該研究證明JEV P3株可活化內皮細胞但其并不影響其屏障功能及細胞間連接，進一步探究了JEV的致病機制。

WANG等[20]研究發(fā)現(xiàn)JEV感染小鼠過程中趨化因子IP-10一直維持高表達，是JEV感染中變化最早最顯著的趨化因子。中和IP-10可緩解JEV感染小鼠引起的BBB緊密蛋白變化，對BBB產(chǎn)生保護作用。但使用IP-10直接作用于內皮細胞并不會破壞其完整性，表明趨化因子IP-10不能直接破壞BBB，進一步研究發(fā)現(xiàn)IP-10與其受體CXCR3結合后，可激活星形膠狀細胞MAPK信號通路，磷酸化的c-Jun N-末端激酶(JNK)可誘導下游早期轉錄因子c-Jun磷酸化，上調TNF-α的表達。TNF-α可下調occludin、claudin-5和ZO-1 3種蛋白的表達，并引起ZO-1向胞質轉位，破壞BBB的完整性。該研究闡明了在JEV感染過程中高表達的趨化因子IP-10誘導下游TNF-α產(chǎn)生破壞BBB的機制，揭示了JEV感染引起B(yǎng)BB受損的新途徑。

4 JEV感染引起細胞凋亡

細胞凋亡是細胞在遇到外界刺激后為維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)而發(fā)生的一種由基因控制的程序性死亡[21]。細胞凋亡途徑包括：死亡受體介導凋亡、細胞線粒體介導凋亡以及內質網(wǎng)應激介導凋亡。很多病毒感染細胞都可以引起細胞凋亡，如與JEV同屬黃病毒科的2型登革熱病毒(DENV2)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)均可誘導細胞凋亡[22-23]。對于宿主細胞而言凋亡可以限制病毒在體內的擴散，對于病毒而言凋亡的發(fā)生有利于病毒的釋放，而凋亡的抑制可增加病毒在細胞內的感染時間，利用宿主細胞產(chǎn)生更多的病毒粒子[24]。

內質網(wǎng)是真核生物中重要的細胞器，具有蛋白加工、維持鈣離子平衡、脂類代謝的功能[25]。當內環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化或病原體感染時會引起內質網(wǎng)功能紊亂，導致內質網(wǎng)應激。內質網(wǎng)應激可觸發(fā)由跨膜蛋白激酶1(IRE1)、活化轉錄因子6(ATF6)、雙鏈RNA活化蛋白激酶樣ER激酶(PERK)共同調控的非蛋白折疊反應[26]。非蛋白折疊反應可緩解一定程度的內質網(wǎng)應激，恢復內質網(wǎng)正常功能，但持續(xù)性的內質網(wǎng)應激時，IRE1、ATF6、PERK會激活下游的C/EBP同源蛋白(CHOP)、JNK、Caspase-12觸發(fā)細胞凋亡[27]。

HUANG等[28]發(fā)現(xiàn)JEV感染BHK-21細胞可上調GRP48、ATF6、ATF4的轉錄水平，引起內質網(wǎng)應激。內質網(wǎng)應激可激活IRE1切割XBP1 mRNA，產(chǎn)生XBP1-s mRNA編碼具有轉錄活性的XBP1-s蛋白。XBP1和ATF6可促進下游CHOP蛋白表達引起細胞凋亡，使用Western blot檢測JEV感染BHK-21細胞GRP78、CHOP、ATF6蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)JEV感染可上調3種蛋白表達。使用IRE1抑制劑和JNK抑制劑處理細胞后能顯著的減少CHOP、Caspase-3、IRE1蛋白表達，抑制JEV引起的細胞凋亡，并且2種抑制劑不影響JEV復制，證實JEV可通過IRE1/JNK信號通路誘導BHK-21細胞凋亡；表明JEV引起的內質網(wǎng)應激是JEV致病過程中引起神經(jīng)元死亡的重要原因，為乙腦的治療和藥物的研發(fā)提供了新的思路和靶點。WANG等[29]發(fā)現(xiàn)JEV感染Neuro-2a細胞和小鼠后，體內外磷酸化PERK和eIF2α的表達均升高及ATF4、CHOP蛋白上調，引起細胞凋亡。使用PERK抑制劑處理細胞，可抑制PERK和eIF2α的磷酸化及ATF4、CHOP蛋白表達，顯著減少JEV引起的細胞病變和凋亡，表明JEV可通過激活PERK-ATF4-CHOP途徑引起細胞凋亡。并且JEV非結構蛋白NS4B 可通過其LIG-FHA和LIG-WD40域與PERK相互作用，可促進PERK發(fā)生二聚化激活PERK，向小鼠顱內注射表達NS4B的質粒，可激活PERK促進腦細胞凋亡及誘發(fā)腦炎。WANG等[29]揭示了JEV非結構蛋白NS4B與宿主細胞互作誘導細胞凋亡的機制，為JEV的治療提供了新的方向和理論支持。

p53是一種轉錄因子，磷酸化的p53進入細胞核可啟動與細胞生長和凋亡有關的基因轉錄。p53可通過死亡受體途徑、線粒體途徑，誘導細胞凋亡。鄧緒芳[30]研究發(fā)現(xiàn)，p53可抑制JEV復制，JEV感染細胞可引起p53轉錄水平下降，降低細胞內p53蛋白水平。JEV感染轉染p53 siRNA的細胞，細胞凋亡率相對于轉染NC siRNA組要高出3.4%，表明JEV引起的細胞凋亡不依賴p53。進一步研究發(fā)現(xiàn)細胞缺失p53可上調Xaf1表達，p53基因敲除小鼠腦組織Xaf1表達水平是野生型小鼠的89倍，Xaf1可通過抑制Xiap增加Caspases的活性促進細胞凋亡。以上結果表明，JEV感染p53基因缺失細胞增加細胞凋亡比例，其原因可能為p53基因缺失，可促進JEV復制感染更多的細胞，增加細胞凋亡；p53基因缺失可上調Xaf1表達促進細胞凋亡。鄧緒芳[30]發(fā)現(xiàn)了p53在JEV感染過程中的生物學功能，JEV通過抑制p53增加病毒增殖，促進細胞凋亡增強其致病力。

叉頭框轉錄因子家族O亞族(FOXO)是一類在生物活性中具有重要功能的轉錄因子，參與細胞生長代謝、分化、氧化應激、DNA損傷修復、腫瘤發(fā)生、細胞凋亡等。GUO等[31]發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)OXO可促進JEV引起的細胞凋亡，而過表達FOXO可抑制JEV引起的細胞凋亡，但FOXO含量變化對JEV復制并無影響。JEV感染Neuro-2a細胞可下調細胞內FOXO以及FOXO信號通路下游的抗凋亡蛋白Bcl-6、p21的mRNA含量，細胞過表達FOXO后，Bcl-6、p21表達升高，JEV感染過表達FOXO的細胞，細胞凋亡比率降低。以上結果表明，JEV感染Neuro-2a細胞后，可通過下調FOXO信號通路中的Bcl-6和p21的表達，誘導細胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO啟動子區(qū)域可與STAT3結合，JEV感染細胞可降低STAT3蛋白表達，抑制STAT3與FOXO啟動子結合，降低FOXO表達。表明JEV感染Neuro-2a細胞可通過抑制STAT3蛋白表達降低STAT3與FOXO啟動子結合，下調FOXO表達導致FOXO信號通路下游抗凋亡蛋白p21和Bcl-6表達減少，誘導Neuro-2a細胞凋亡。該研究發(fā)現(xiàn)JEV可通過抑制STAT3-FOXO-Bcl-6/p21信號通路誘導細胞凋亡，不僅揭示了新的JEV致病分子機制，也為JE藥物的研發(fā)提供了新的思路和靶點。

5 小結

JEV是一類危害人類健康和豬業(yè)養(yǎng)殖業(yè)的重要病原體，可通過蚊蟲為媒介傳播。JEV感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起病毒性腦炎以及神經(jīng)細胞的大量死亡，是JEV最重要的致病機制。感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)第一步就是要跨過BBB，以目前的研究結果來看在小鼠模型中跨神經(jīng)途徑并不是JEV進入中樞系統(tǒng)的途徑，而JEV可感染免疫細胞以及上調免疫細胞黏附分子，內皮細胞相應配體的表達，為以特洛伊木馬途徑進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供了依據(jù)。JEV感染可引起B(yǎng)BB受損，但很多研究表明[18-20]JEV并不是破壞BBB的直接原因，JEV感染內皮細胞并未破壞細胞屏障功能以及細胞間連接，而JEV感染所產(chǎn)生炎性因子和趨化因子如：IFN-γ、TNF-α，可破壞BBB的完整性和功能。對于JEV感染引起的細胞凋亡，一些研究表明[28-29]JEV感染可引起內質網(wǎng)應激，激活IER1/JNK、PERK-ATF4-CHOP信號通路誘導細胞凋亡。除此之外，F(xiàn)OXO、p53轉錄因子在JEV誘導細胞凋亡中有著重要作用，2種轉錄因子的沉默均可增加JEV引起的細胞凋亡，而JEV感染可引起2種轉錄因子的下調誘導細胞凋亡[30-31]。對JEV感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)過程中，跨越BBB的途徑，引起B(yǎng)BB損傷，誘導細胞凋亡的研究進行總結論述，為JEV的致病機制研究提供參考，以及為JEV藥物的研發(fā)提供新的思路。