豬瘟病毒感染過(guò)程中非結(jié)構(gòu)蛋白作用的研究進(jìn)展

楊志剛，湯德元，廖少山，張森，韓超逸，晏仁潭

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

CSFV屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivurts)，其完整的病毒粒子呈球型，直徑為38～50 nm，核衣殼呈立體對(duì)稱的二十面體結(jié)構(gòu)，直徑約為29 nm，病毒囊膜表面延伸出許多長(zhǎng)為6～8 nm含糖蛋白的纖突結(jié)構(gòu)。CSFV為單鏈正鏈RNA病毒，基因組約為12.3 kb，含有一個(gè)開放閱讀框編碼大約3 898個(gè)氨基酸的多聚蛋白，該多聚蛋白經(jīng)病毒蛋白酶和宿主蛋白酶裂解為12種成熟蛋白，包括4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、Erns、E1和E2)和8種非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[1]。相關(guān)研究證明，CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白在其感染致病過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，CSFV各主要蛋白協(xié)同促進(jìn)了疾病的發(fā)展進(jìn)程。因此，本文對(duì)CSFV感染過(guò)程中各非結(jié)構(gòu)蛋白的相關(guān)調(diào)控作用機(jī)制進(jìn)行了綜述。

1 Npro蛋白

Npro蛋白是 CSFV編碼的第一個(gè)蛋白，分子量大小約為23 kDa，由168個(gè)氨基酸殘基組成。Npro在抑制I型和III型干擾素、促進(jìn)CSFV復(fù)制、提高病毒毒力以及抗細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著重要的作用。

在逃避宿主先天免疫方面，Npro能抑制宿主中I型和III型干擾素的產(chǎn)生。有研究表明，Npro可以通過(guò)蛋白酶體途徑降解IRF3以及與IRF7相互作用，從而降低I型干擾素的產(chǎn)生，進(jìn)而來(lái)逃避先天免疫[2]，并協(xié)同病毒復(fù)制，從而增強(qiáng)了CSFV的致病性[3]。隨后，Gottipati等[4]將IRF3和重組純化的CSFV Npro置于緩沖液中直接進(jìn)行反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)Npro能夠直接結(jié)合IRF3單體和二聚體，并且不依賴其活性狀態(tài)。Cao等[5]研究發(fā)現(xiàn)Npro通過(guò)抑制IRF1表達(dá)及其核易位進(jìn)而抑制III型干擾素的產(chǎn)生。

Npro與病毒毒力有關(guān)，且在抗細(xì)胞凋亡和促進(jìn)CSFV生長(zhǎng)方面發(fā)揮作用。Mayer等在2004年發(fā)現(xiàn)缺乏Npro的CSFV突變體在體外和體內(nèi)都被減毒，證明Npro與CSFV的毒力有關(guān)。之后，Li等[6]表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)中的IRF3-Npro融合蛋白的突變體vSM-IRF3，并發(fā)現(xiàn)由于Npro核定位的破壞，vSM-IRF3在體外和體內(nèi)毒力明顯減弱，證明了上述觀點(diǎn)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Npro的核定位對(duì)于細(xì)胞中的有效復(fù)制至關(guān)重要。Johns等[7]為了闡明Npro的功能機(jī)制，進(jìn)行了酵母雙雜交篩選，其中鑒定了抗凋亡蛋白HAX-1，通過(guò)共沉淀試驗(yàn)證實(shí)Npro-HAX-1相互作用，在共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及用野生型CSFV感染的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中觀察到HAX-1，而在Npro缺失的CSFV感染細(xì)胞中未觀察到HAX-1，結(jié)果證明Npro通過(guò)與HAX-1相互作用，在抑制RNA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Li等[8]發(fā)現(xiàn)poly(C)結(jié)合蛋白1(PCBP1)為CSFV Npro的新型相互作用蛋白，敲除PCBP1抑制了CSFV生長(zhǎng)，而PCBP1的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)了CSFV生長(zhǎng)，此外，I型干擾素被PCBP1和Npro下調(diào)，結(jié)果表明PCBP1正向調(diào)節(jié)CSFV的生長(zhǎng)。

2 p7蛋白

P7蛋白是一種病毒孔蛋白，分子量大小約為7 kDa，由64個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。研究表明，P7蛋白在病毒復(fù)制、孔形成、病毒毒力、改變細(xì)胞膜通透性等方面起著重要作用。Gladue等[9]研究發(fā)現(xiàn)p7的同框刪除對(duì)病毒生長(zhǎng)有害，這表明p7對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒復(fù)制至關(guān)重要；相對(duì)于高毒力的CSFV Brescia株，p7突變病毒在豬中部分或完全減毒，表明p7在CSFV毒力中具有重要作用；模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脂質(zhì)組成的模型膜中的結(jié)構(gòu)功能分析證實(shí)，p7是一種成孔蛋白，并且成孔活性駐留在C端跨膜螺旋中。之后，Guo等[10]研究發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)p7，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加，在早期主要定位在ER上，而后期轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，缺失分析表明41～63氨基酸對(duì)于其孔蛋白的活性是必需的，以及Largo等[11]發(fā)現(xiàn)p7可以在ER的雙層膜結(jié)構(gòu)模仿物上形成離子通道，并且該通道可以通過(guò)分子量為427.33的ANTS分子，這都證明了上述p7是一種成孔蛋白這一觀點(diǎn)。Zhao等[12]研究表明單獨(dú)的P7蛋白及其前體 E2-P7 蛋白復(fù)合體在調(diào)節(jié)蛋白相互作用和促進(jìn)CSFV增殖的過(guò)程中起到重要作用，而不會(huì)影響病毒復(fù)制，這對(duì)上述p7對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒復(fù)制至關(guān)重要這一觀點(diǎn)進(jìn)行了進(jìn)一步證明。

3 NS2蛋白

NS2 蛋白由457個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成, 具有蛋白酶活性，能將NS2-3蛋白復(fù)合體切割形成NS2和NS3 2個(gè)單體蛋白，還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡，為病毒復(fù)制提供有利的環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，含有完整NS2-NS3基因的RNA復(fù)制子在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中持續(xù)存在并繼續(xù)復(fù)制，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成任何明顯的形態(tài)或功能損害，而缺少NS2基因的基因組則能夠更有效地復(fù)制并引起細(xì)胞病變作用，這些發(fā)現(xiàn)表明NS2盡管對(duì)于RNA復(fù)制不是必需的，但是在其中具有一定的調(diào)節(jié)功能。之后，Li等[13]突變了CSFV NS2 N末端的幾個(gè)代表性保守殘基，并研究了這些突變?nèi)绾斡绊懖《綬NA復(fù)制和感染性病毒的產(chǎn)生，結(jié)果表明在NS2的N端2個(gè)天冬氨酸NS2/D60A或NS2/D60K和NS2/D78K的突變消除了感染性病毒的產(chǎn)生，并且在100位(NS2/R100A)用精氨酸代替丙氨酸導(dǎo)致病毒滴度顯著降低，含有病毒基因組RNA分子的細(xì)胞的連續(xù)傳代產(chǎn)生了回復(fù)株NS2/A60D、NS2/K60D和NS2/K78D，感染性病毒得到恢復(fù)，這些結(jié)果揭示了CSFV NS2 N末端能調(diào)節(jié)病毒復(fù)制，證明了上述觀點(diǎn)。Tang等[14]建立了穩(wěn)定的表達(dá)CSFV NS2的豬臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(SUVEC)，并發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，細(xì)胞分析顯示，由于S期細(xì)胞周期停滯，表達(dá)NS2的細(xì)胞系的復(fù)制被抑制20%～30%，NS2還誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和激活NF-κB，這些結(jié)果證明了NS2誘導(dǎo)S期阻滯來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程，從而為病毒復(fù)制提供有利的細(xì)胞環(huán)境，又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NS2的表達(dá)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和激活NF-κB之后，從而上調(diào)IL-8和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并抑制MG132誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，數(shù)據(jù)表明CSFV NS2在炎癥反應(yīng)和持續(xù)感染中起重要作用[15]。此外，Kang等[16]利用酵母雙雜交分析出MOAP1、DNAJA1、GOPC、FANCL、TMED4和CSDE1可以與NS2相互作用，這些蛋白質(zhì)主要與凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、氧化還原、代謝有關(guān)，但具體作用有待進(jìn)一步研究。

4 NS3蛋白

NS3蛋白分子量大小約為80 kDa，由683個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，具有核苷三磷酸酶活性、絲氨酸蛋白酶活性和核糖核酸解旋酶活性，它們是轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的。研究表明，NS3具有解旋酶活性，在CSFV基因組復(fù)制發(fā)揮重要作用，并且NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域和NS5B能夠調(diào)節(jié)NS3的核苷三磷酸酶活性和解旋酶活性。此外，NS3與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)相互作用，降解了TRAF6，通過(guò)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)CSFV復(fù)制[17]；NS3與TRAF5相互作用促進(jìn)了TRAF5的表達(dá)，而TRAF5的表達(dá)又激活p38 MAPK，從而促進(jìn)了CSFV復(fù)制[18]。近期的研究還發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞蛋白PSMB10通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解NS3蛋白，從而抑制經(jīng)典豬瘟病毒的生長(zhǎng)，這可能為豬瘟的治療提供一定的思路[19]。

5 NS4A蛋白

NS4A蛋白分子量大小約為6 kDa，由64個(gè)氨基酸殘基組成，是NS2-3蛋白的輔助因子，在病毒的復(fù)制和病毒顆粒組裝中發(fā)揮重要作用。最近，Wang等[20]發(fā)現(xiàn)CSFV感染通過(guò)MAVS途徑誘導(dǎo)豬臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-8，還證明了NS4A定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，且通過(guò)增強(qiáng)MAVS途徑誘導(dǎo)IL-8的產(chǎn)生，并促進(jìn)CSFV復(fù)制。

6 NS4B蛋白

NS4B蛋白分子量大小約為38 kDa，由347個(gè)氨基酸殘基組成，有2個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，分別是WalkerA(209～216 aa)和WalkerB(335～342 aa)，具有NTPase活性，能與非結(jié)構(gòu)蛋白(即NS3、NS4A、NS5A和NS5B)一起形成RNA復(fù)制復(fù)合物，在病毒復(fù)制、毒力、抗細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，WalkerA對(duì)NTPase活性至關(guān)重要。Tamura等[21]研究表明NS4B對(duì)病毒的毒力有影響，可以與E2通過(guò)協(xié)同作用提高病毒的致病性，之后又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NS4B N末端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合可以決定細(xì)胞培養(yǎng)中的CSFV基因組復(fù)制和豬的病毒致病性[22]。

研究發(fā)現(xiàn)，NS4B可以與多種蛋白相互作用并發(fā)揮作用。Lin等[23]證明Rab5與NS4B相互作用以促進(jìn)NS4B相關(guān)復(fù)合物的形成并增強(qiáng)CSFV增殖；Qian等[24]發(fā)現(xiàn)鐵蛋白重鏈(FHC)(一種著名的抗凋亡蛋白)是一種與NS4B相互作用的蛋白，可增強(qiáng)CSFV復(fù)制，并通過(guò)調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)細(xì)胞活性氧(ROS)來(lái)抵消細(xì)胞凋亡；研究人員[25]通過(guò)酵母雙雜交(Y2H)系統(tǒng)篩選、亞細(xì)胞共定位、共免疫沉淀和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶下拉分析證明了坦克結(jié)合激酶1(TBK1)是NS4B相互作用的細(xì)胞蛋白，但具體作用有待進(jìn)一步研究。最近，Zhang等[26]研究發(fā)現(xiàn)豬RING指蛋白114(pRNF114)(一種RING域E3泛素連接酶)是潛在的抗CSFV因子，pRNF114通過(guò)靶向并催化NS4B蛋白的K27連接的多聚泛素化，然后促進(jìn)蛋白酶體依賴性的NS4B降解，從而抑制CSFV的復(fù)制，這為開發(fā)豬瘟的治療方法提供新的思路。

7 NS5A蛋白

NS5A蛋白分子量大小約為55 kDa，由496個(gè)氨基酸殘基組成，是一種磷酸化的多功能蛋白，能抑制NF-κB信號(hào)通路和誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的自噬，在調(diào)節(jié)病毒復(fù)制方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，NS5A蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過(guò)N和C端結(jié)構(gòu)域刺激病毒復(fù)制和抑制病毒翻譯。之后，Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)NS5A可以通過(guò)與NS5B和3'UTR結(jié)合而調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制，當(dāng)無(wú)法與NS5B結(jié)合時(shí)，NS5A仍可以通過(guò)與3'UTR結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)病毒的合成，同時(shí)，Sheng等[28]發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞中NS5A的水平較低時(shí)，NS5A與NS5B一起結(jié)合3′UTRSL-1，促進(jìn)病毒復(fù)制；而當(dāng)NS5A水平較高時(shí)，NS5A蛋白除了結(jié)合3′UTRSL-1之外，還結(jié)合3′UTRSL-2，正是NS5A與3′UTRSL-2的結(jié)合可能抑制了NS5B以相同的3′UTR為模板的病毒合成，這對(duì)上述觀點(diǎn)進(jìn)行了進(jìn)一步解釋。此外，Xie等[29]研究表明NS5A可以切割形成兩科個(gè)截?cái)嘈问降腷和c，通過(guò)蛋白酶抑制劑和shRNA干擾的實(shí)驗(yàn)表明，caspase6蛋白酶介導(dǎo)形式c的切割，另一種未知蛋白酶介導(dǎo)形式b的切割，下調(diào)或抑制該蛋白酶的活性顯著的降低了基因組復(fù)制和病毒產(chǎn)生，證明NS5A的切割有利于病毒的復(fù)制。

研究表明，NS5A通過(guò)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的自噬和抑制NF-κB信號(hào)通路，從而促進(jìn)病毒的復(fù)制和成熟。Pei等[30]研究發(fā)現(xiàn)CSFV通過(guò)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的自噬途徑從而促進(jìn)病毒的復(fù)制和成熟，免疫電子顯微鏡檢查進(jìn)一步證實(shí)了E2和NS5A蛋白與自噬小體樣囊泡的共定位，所以NS5A可能對(duì)CSFV誘導(dǎo)自噬具有重要意義，但其機(jī)制尚待闡明。Dong等[31]發(fā)現(xiàn)在豬肺泡巨噬細(xì)胞中，CSFV NS5A通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路抑制poly(I：C)誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子分泌，這可能有助于尋找新的方法來(lái)預(yù)防CSFV感染。

NS5A能與宿主細(xì)胞中多種蛋白發(fā)生相互作用，從而增強(qiáng)病毒復(fù)制，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)一些蛋白能與NS5A相互作用，從而抑制病毒復(fù)制，這可能有助于開發(fā)新的方法來(lái)治療CSFV感染。Zhang等[32]研究發(fā)現(xiàn)熱激蛋白70與CSFV NS5A的N末端氨基酸(29240)蛋白相互作用，并增強(qiáng)病毒復(fù)制；Li等[33]研究發(fā)現(xiàn)FKBP8和CSFV NS5A相互作用，并促進(jìn)病毒復(fù)制；Liu等[34]研究表明真核生物翻譯起始因子3亞基E(eIF3E)與CSFV NS5A相互作用，并促進(jìn)病毒復(fù)制。Li等[35]發(fā)現(xiàn)真核延長(zhǎng)因子1A(eEF1A)與CSFV NS5A蛋白相互作用，并抑制病毒的生長(zhǎng)；Ling等[36]研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白27(Hsp27)與CSFV NS5A相互作用，并通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制病毒復(fù)制；毒蛇毒蛋白通過(guò)與CSFV NS5A相互作用，并抑制病毒復(fù)制[37]。

8 NS5B蛋白

NS5B分子量大小約為82 kDa，由718個(gè)氨基酸殘基組成，是一種RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)，負(fù)責(zé)病毒基因組的復(fù)制。Xiao等[38]研究發(fā)現(xiàn)NS5B蛋白通過(guò)3′UTR與正鏈結(jié)合形成復(fù)合物，從而促進(jìn)CSFV復(fù)制，且發(fā)現(xiàn)CSFV正鏈RNA的3′UTR“CCCGG”序列和負(fù)鏈RNA 3′UTR“CATTGCTC”序列是正鏈RNA和負(fù)鏈RNA合成必需的。Li等[39]研究結(jié)果進(jìn)一步表明CSFV核心蛋白通過(guò)CSFV NS5B調(diào)節(jié)RNA的合成。此外，其他非結(jié)構(gòu)蛋白與NS5B之間的相互作用在病毒的生命周期中發(fā)揮了重要作用。例如，Wang等[40]研究發(fā)現(xiàn)CSFV NS3通過(guò)與NS5B結(jié)合增強(qiáng)RdRp活性，也調(diào)節(jié)NS3的 NTP酶活性和解旋酶活性，之后，又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NS5B包含2個(gè)NS3結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)為NS5B N端的63～99 aa和另一個(gè)為C端的611～642 aa[41]。最近，Li等[42]通過(guò)對(duì)CSFV NS5B的晶體結(jié)構(gòu)的研究，發(fā)現(xiàn)CSFV NS5B的N末端結(jié)構(gòu)域(NTD)對(duì)于RdRp活性非常重要；Zhou等[43]研究發(fā)現(xiàn)豬poMx1與CSFV NS5B相互作用，抑制CSFV復(fù)制。這可能對(duì)開發(fā)抗CSFV藥物提供一定的思路。

9 展望

CSFV對(duì)我國(guó)乃至世界養(yǎng)豬業(yè)都造成了巨大的損失，研究人員近些年對(duì)于CSFV的研究已取得了顯著進(jìn)展，但對(duì)在CSFV復(fù)制中發(fā)揮重要作用的如p7、NS2、NS3等非結(jié)構(gòu)蛋白的研究還不透徹，非結(jié)構(gòu)蛋白之間相互作用的調(diào)控機(jī)制、病毒復(fù)制的調(diào)控機(jī)制及致病機(jī)理等方面都需要不斷進(jìn)行探索。對(duì)CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白的了解，有助于深入理解病毒的復(fù)制過(guò)程及病毒持續(xù)感染的分子機(jī)制。本文對(duì)在CSFV復(fù)制過(guò)程中起關(guān)鍵作用的非結(jié)構(gòu)蛋白近年來(lái)的研究進(jìn)展進(jìn)行了匯總，以期為今后繼續(xù)研究CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白的科研人員提供參考，并對(duì)CSFV的鑒定、診斷及預(yù)防研究提供參考。