左乙拉西坦對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

王海濱，門慶玲，蔡艷麗，周文龍，郭海志，陳瑞祥

(資陽市第一人民醫(yī)院 1.神經(jīng)內(nèi)科； 2.心血管內(nèi)科，四川 資陽 641300；3.云南省第三人民醫(yī)院 藥劑科，云南 昆明 650011)

缺血缺氧性腦損傷(hypoxia ischemia brain-damage，HIBD)是機(jī)體腦部因缺乏或限制氧氣和葡萄糖供應(yīng)而造成結(jié)構(gòu)損傷和功能紊亂，長時(shí)間的局部缺血可導(dǎo)致大腦嚴(yán)重或致命的損害[1]。在新生兒中，HIBD是導(dǎo)致其死亡和感覺運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知功能嚴(yán)重受損的主要因素[2]。目前，雖然大量學(xué)者對(duì)新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)進(jìn)行研究，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，臨床治療缺乏特異性藥物。因此，從分子水平對(duì)HIE發(fā)病機(jī)制的研究對(duì)其臨床診治具有重要意義。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)不僅是機(jī)體抗氧化的主要調(diào)節(jié)因子，也是抗感染、解毒蛋白基因表達(dá)的細(xì)胞保護(hù)因子[3]，抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)是其主要靶點(diǎn)，血紅素加氧酶(heme oxyge-nase, HO-1)是ARE主要作用因子，Nrf2-ARE在腦損傷性疾病、帕金森等認(rèn)知功能障礙性疾病中發(fā)揮重要作用[4-5]。左乙拉西坦(levetiracetam，LEV)是常見的抗癲癇藥，可以有效治療熱性驚厥所引起腦損傷[6]，但關(guān)于LEV對(duì)HIE的作用研究報(bào)道較少，本研究通過觀察LEV對(duì)HIBD新生大鼠的影響，探究其可能作用機(jī)制，為HIE的臨床診治提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，7日齡，體質(zhì)量15g左右[北京維通利華公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006，合格證號(hào)：0015675]。

1.1.2 試劑: LEV(上海邁瑞爾化學(xué)科技有限公司)白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子α (TNF-α)ELISA試劑盒(Abcam公司)；丙二醛(MDA)ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；鼠單克隆抗Caspase-3抗體、鼠單克隆抗Bcl-2抗體(Santa Cruz公司)；兔源多克隆抗Nrf2抗體、兔源多克隆抗HO-1抗體、兔源單克隆抗GAPDH抗體(CST公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠免疫球蛋白(IgG)二抗(Abbkine公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理: 隨機(jī)挑選40只新生大鼠，參考文獻(xiàn)[7]構(gòu)建HIBD新生大鼠模型，另選10只為sham組。將造模成功的40只新生大鼠隨機(jī)分成：model組(灌胃等量0.9%氯化鈉溶液)、L、M、H LEV組[灌胃10、30、50 mg/(kg·d)]，每組各10只，連續(xù)8 d，末次給藥24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 采集組織標(biāo)本: 取小鼠眼球靜脈叢血，1 800 r/min離心10 min取血清，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱保存。取其腦部組織，剪取約0.5 g用于提取組織蛋白，儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中備用。剩余腦組織，用4%多聚甲醛溶液固定，做常規(guī)石蠟切片，備用。

1.2.3 HE染色觀察腦組織病理變化: 腦組織切片，脫蠟至水化，蘇木精染色、伊紅染液復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡下觀察腦組織病理變化。

1.2.4 TUNEL檢測(cè)腦組織神經(jīng)元凋亡: 脫蠟至水化，TUNEL染色、脫水、透明、封片，鏡下觀察腦組織神經(jīng)元凋亡情況。TUNEL陽性胞核內(nèi)可見棕黃色顆粒，鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野凋亡率，凋亡率(%)=TUNEL陽性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%，取平均數(shù)。

1.2.5 ELISA檢測(cè)血清中炎性因子IL-10、IL-6、TNF-α及氧化應(yīng)激因子MDA含量、SOD活性: 取血清，用ELISA試劑盒分別檢測(cè)IL-10、IL-6、TNF-α、MDA的含量以及SOD活性表達(dá)，具體操作步驟參考其說明書。

1.2.6 Western blot檢測(cè)腦組織caspase-3、Bcl-2、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá): 提取腦組織蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，調(diào)整上樣蛋白至50 μg，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜、加一抗(caspase-3、Bcl-2、Nrf2、HO-1、GAPDH，1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，次日，加二抗室溫孵育2 h，洗膜，加ECL發(fā)光液，用Bio-Rad成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白吸光度信號(hào)，Image J軟件定量分析蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織病理學(xué)變化結(jié)果

model組大鼠腦組織細(xì)胞排列紊亂呈彌漫性分布，空泡化增加，出現(xiàn)炎性浸潤現(xiàn)象；與model組相比，L、M、H LEV組大鼠腦組織細(xì)胞排列較整齊，組織病理改變明顯減少(圖1)。

2.2 LEV對(duì)各組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡的影響

與sham組相比，model組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.05)；與model組相比，L、M、H LEV組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率顯著降低(P<0.05)；與L、M LEV組相比，H LEV組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖2, 3)。

2.3 LEV對(duì)各組大鼠血清中炎性因子IL-6、TNF-α的影響

與sham組相比，model組血清中IL-6、TNF-α表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與model組相比，L、M、H LEV組大鼠血清中IL-6、TNF-α表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與L、M LEV組相比，H LEV組大鼠血清中IL-6、TNF-α表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖4)。

圖1 各組大鼠腦組織HE染色圖

圖2 各組大鼠腦組織TUNEL染色圖Fig 2 TUNEL staining of brain tissue of rats in each group(scale bar=50 μm)

*P<0.05 compared with the sham group; #P<0.05 compared with the model group; ▲P<0.05 compared with the LEV low concentration group; ■P<0.05 compared with the LEV medium concentration group圖3 LEV對(duì)各組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率的影響Fig 3 Effects of LEV on the apoptosis rate of neurons in brain tissue of rats in each

*P<0.05 compared with the sham group; #P<0.05 compared with the model group; ▲P<0.05 compared with the LEV low concentration group; ■P<0.05 compared with the LEV medium concentration group圖4 LEV對(duì)各組大鼠血清中炎性因子IL-6、 TNF-α的影響Fig 4 Effects of LEV on inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α in serum of rats in each group

2.4 LEV對(duì)各組大鼠血清中氧化應(yīng)激因子MDA含量、SOD活性的影響

與sham組相比，model組大鼠血清中MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與model組相比，L、M、H LEV組血清中MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)；與L、M LEV組相比，H LEV組大鼠血清中MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with the sham group; #P<0.05 compared with the model group; ▲P<0.05 compared with the LEV low concentration group; ■P<0.05 compared with the LEV medium concentration group圖5 LEV對(duì)各組大鼠血清中氧化應(yīng)激因子MDA含量、 SOD活性的影響Fig 5 Effects of LEV on MDA and SOD expression in serum of rats in each n=10)

2.5 LEV對(duì)各組大鼠腦組織Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

與sham組相比，model組大鼠腦組織caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與model組相比，L、M、H LEV組大鼠腦組織caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與L、M LEV組相比，H LEV組大鼠腦組織caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖6)。

2.6 LEV對(duì)各組大鼠腦組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的影響

與sham組相比，model組大鼠腦組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與model組相比，LEV低、中、高濃度組大鼠腦組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與LEV低、中濃度組相比，高濃度組大鼠腦組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖7)。

3 討論

HIE是引起新生兒腦損傷，導(dǎo)致其死亡的重要原因之一，腦部缺氧缺血性發(fā)作與胎齡、 代謝、 腦部感染、持續(xù)性腦損傷等多種因素有關(guān)[8]，臨床HIE患者出現(xiàn)不同程度腦水腫，神經(jīng)細(xì)胞病變、腦組織壞死等病理變化[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與sham組相比，model組大鼠腦組織細(xì)胞排列紊亂呈彌漫性分布，細(xì)胞空泡增加，出現(xiàn)炎性浸潤，與報(bào)道一致[7]，提示HIBD新生大鼠model構(gòu)建成功。HIE存活者常出現(xiàn)智力障礙、癱瘓、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)性疾病后遺癥，嚴(yán)重危害患者的生命健康和生活質(zhì)量。LEV對(duì)新生兒缺氧缺血性腦病引起的癲癇發(fā)作有治療作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LEV治療后，HIBD新生大鼠的病理癥狀明顯減輕，提示LEV對(duì)HIBD癥狀有一定緩解作用。

*P<0.05 compared with the sham group; #P<0.05 compared with the model group; ▲P<0.05 compared with the LEV low concentration group; ■P<0.05 ompared with the LEV medium concentration group

*P<0.05 compared with the sham group; #P<0.05 compared with the model group; ▲P<0.05 compared with the LEV low concentration group; ■P<0.05 compared with the LEV medium concentration group

腦部局部缺血引起原發(fā)性損傷，由于細(xì)胞凋亡、炎性因子紊亂導(dǎo)致腦損傷，加劇腦病，IL-6、TNF-α是炎性反應(yīng)中重要調(diào)控因子。LEV可以減輕HIBD新生大鼠體內(nèi)炎性反應(yīng)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LEV治療后，大鼠血清IL-6、TNF-α水平顯著降低，提示LEV可以抑制炎性反應(yīng)因子IL-6、TNF-α分泌，減輕機(jī)體炎性反應(yīng)。Caspase-3是促凋亡因子，Bcl-2是抑凋亡因子，共同調(diào)控細(xì)胞凋亡機(jī)制。LEV可以抑制腦缺血再灌注損傷后促凋亡蛋白表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LEV治療后，大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率、caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，提示LEV可以抑制Caspase-3蛋白表達(dá)、促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制HIBD腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激是引起新生兒腦損傷的重要因素，細(xì)胞中促氧化劑和抗氧化劑之間比例不平衡造成氧化應(yīng)激發(fā)生，MDA和SOD是評(píng)估氧化應(yīng)激的生化標(biāo)志物。在小兒癲癇痰火擾神證中LEV可抑制MDA含量，促進(jìn)SOD活性[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LEV治療后，大鼠血清MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高，提示LEV可以調(diào)控MDA、SOD蛋白表達(dá)，減輕HIBD新生大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。Nrf2是機(jī)體抗氧化保護(hù)機(jī)制中重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以編碼抗氧化劑酶HO-1，不僅可以防止氧化損傷，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，還調(diào)節(jié)炎性以及促進(jìn)血管生成[14]。研究顯示，LEV可以通過調(diào)控Nrf2-ARE通路，使HO-1蛋白表達(dá)增多，起到抗癲癇的作用[15]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LEV治療后，大鼠腦組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)顯著升高，提示LEV可通過降低MDA含量，升高SOD活性，發(fā)揮抗氧化作用可能與Nrf2-ARE通路激活有關(guān)。

綜上所述，LEV可抑制腦細(xì)胞凋亡，減輕HIBD新生大鼠體內(nèi)炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，可能與Nrf2-ARE通路激活有關(guān)，但其具體作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。