高氯酸非水滴定法測(cè)定醬油中氨基酸態(tài)氮含量可行性研究

汪靜靜，周小清

(泰州市藥品檢驗(yàn)院，江蘇 泰州 225300)

醬油是中國(guó)傳統(tǒng)的調(diào)味品。氨基酸態(tài)氮是醬油發(fā)酵程度的特性指標(biāo)，也是影響醬油風(fēng)味的重要因素。因此一定程度上，醬油中氨基酸態(tài)氮含量決定該醬油的質(zhì)量等級(jí)[1]。國(guó)家強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)[2]規(guī)定最低等級(jí)醬油中氨基酸態(tài)氮含量不得低于0.40 g/mL。因此，企業(yè)也在不斷改善醬油中發(fā)酵工藝以獲取高含量的氨基酸態(tài)氮，從而提高其商業(yè)價(jià)值。由于釀造工藝直接影響醬油中氨基酸的含量[3-7]，方便快捷、精確的氨基酸態(tài)氮測(cè)定方法對(duì)生產(chǎn)企業(yè)過程控制尤其重要。

目前醬油中氨基酸態(tài)氮的檢測(cè)方法主要是依據(jù)國(guó)標(biāo)GB 5009.235-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》[8]中酸度計(jì)法和分光光度計(jì)法兩種方法，其中酸度計(jì)法為仲裁法且最常用[9-10]，具體操作步驟：樣品溶液先用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH 8.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)，再加入甲醛以固定氨基酸中氨基的堿性，使羧基表現(xiàn)出酸性，再繼續(xù)用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以酸度計(jì)指示pH 9.2確定終點(diǎn)。整個(gè)過程操作相對(duì)繁瑣，影響測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的因素較多[11-12]，且甲醛對(duì)皮膚黏膜有刺激作用[13-15]。

考慮到高氯酸作為含氧酸中最強(qiáng)酸，通常用于有機(jī)堿類物質(zhì)含量的滴定[16-19]，而氨基酸本身亦屬于有機(jī)堿類物質(zhì)，理論上可以用高氯酸滴定。另外，現(xiàn)行GB 5009.43-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 味精中麩氨酸鈉(谷氨酸鈉)的測(cè)定》中新增加了高氯酸非水溶液滴定法測(cè)定味精中的谷氨酸鈉，更是給了我們建立高氯酸非水溶液滴定法測(cè)定醬油中氨基酸態(tài)氮含量的信心。

本文利用氨基酸的兩性作用，采用乙酸酐-乙酸體系溶解醬油，使醬油中氨基酸在乙酸酐-乙酸體系中酸性減弱而堿性大大提高，考察高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定其氨基的可行性并建立初步方法?？疾炝嗽摲椒ǖ闹貜?fù)性及加標(biāo)回收率，并將該方法和酸度計(jì)法進(jìn)行對(duì)比研究，以期為醬油生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供更多的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醬油：購(gòu)于本地超市；醬油標(biāo)準(zhǔn)品：大連中實(shí)國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司，含量為1.15 g/100 g；氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液[C(NaOH)=0.0501 mol/L]；高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液[C(HClO4)=0.1044 mol/L]。甲醛36%、醋酸、醋酸酐：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

XS204電子分析天平、梅特勒托利多儀器公司；FE20酸度計(jì) 梅特勒-托利多儀器公司；C-MAG-HS7磁力加熱攪拌器 IKA儀器公司；888全自動(dòng)電位滴定儀+復(fù)合玻璃pH智能電極 瑞士萬(wàn)通公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 儀器方法

空白測(cè)定采用等量滴定模式，最小加液體積為0.01 mL。樣品測(cè)定采用等量滴定模式；加液速度為5 mL/min，攪拌速度為8 r/s，預(yù)攪拌時(shí)間為30 s，可接受信號(hào)漂移為50.0 mV/min。

1.2.2 樣品測(cè)定

準(zhǔn)確稱取約0.5 g樣品于滴定杯中，加2 mL醋酐和60 mL冰醋酸，放置自動(dòng)電位滴定儀上，插入電極和滴定管，使電極隔膜完全浸沒到被滴定的溶液中，打開電極上部的密封塞，啟動(dòng)滴定方法，用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液進(jìn)行滴定，以電位值為縱坐標(biāo)，滴定時(shí)消耗高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積為橫坐標(biāo)，儀器自動(dòng)繪制電位值-滴定體積實(shí)時(shí)變化曲線，曲線明顯突躍點(diǎn)為其滴定終點(diǎn)，記錄該點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的消耗高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積(V1)。試劑空白實(shí)驗(yàn)取2 mL醋酐和60 mL乙酸，記錄消耗高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積(V0)。結(jié)果計(jì)算見下式：

式中：X為樣品中氨基酸態(tài)氮的含量(g/100 g)；V1為測(cè)定用試樣消耗高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積(mL)；V2為試劑空白試驗(yàn)消耗高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積(mL)；C為溫度校準(zhǔn)后高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度(mol/L)；0.007為與1.00 mL高氯酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[C(HClO4)=1.000 mol/L]相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量(g)；m為稱取試樣的質(zhì)量(g)；100為單位換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品水分去除

水溶液體系通過影響有機(jī)堿的堿性從而影響非水滴定的靈敏度，醬油中水分含量在50%左右，因此選擇合適的水分去除方法是本次可行性研究的關(guān)鍵之一。本文首先考察了物理烘干和在溶解過程中加入醋酐兩種方式，結(jié)果表明，醬油樣品經(jīng)過烘干后呈現(xiàn)粘稠膠質(zhì)狀態(tài)，在醋酸中溶解困難，滴定曲線雜亂無(wú)規(guī)律，因此放棄物理烘干。醋酐常用于非水滴定實(shí)驗(yàn)以除去樣品和醋酸中水分，醋酐的加入量也會(huì)對(duì)滴定突躍產(chǎn)生一定的影響，因此對(duì)醋酐的加入體積進(jìn)行了考察。醬油配方中水分約為52%～53%[20]，每1 g水能與5.22 mL醋酐定量反應(yīng)，本方法中醬油取樣量為0.5 g，約需要1.305～1.383 mL醋酐，所用醋酸試劑含水量約為0.2%，用量為60 mL，比重為1.05 g/mL，需消耗0.117 mL比重1.08 g/mL含量97.0%的醋酐，綜上可知，待滴定試液理論上需要約1.5 mL醋酐去除水分。依據(jù)該理論值進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，各取0.5 g醬油，分別加入醋酐0，1，1.5，2，2.5，3，5，10 mL，均加入60 mL冰醋酸進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示：隨著酸酐加入量增大，滴定終點(diǎn)會(huì)稍微提前，經(jīng)過與酸度計(jì)法結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，加入酸酐1 mL時(shí)氨基酸態(tài)氮含量與酸度計(jì)法結(jié)果無(wú)顯著差異。加入1 mL酸酐的典型滴定曲線圖見圖1。

圖1 全自動(dòng)電位滴定圖Fig.1 The diagram of automatic potentiometric titration

2.2 考察方法重復(fù)性

按1.2實(shí)驗(yàn)方法對(duì)樣品平行測(cè)定6次，考察了方法重復(fù)性，并將結(jié)果與國(guó)標(biāo)中酸度計(jì)法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表1。電位滴定法和酸度計(jì)法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.16%和0.15%，表明電位滴定法與酸度計(jì)法都具有良好的重復(fù)性，測(cè)定含量與酸度計(jì)法進(jìn)行比較結(jié)果無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表1 方法重復(fù)性Table 1 The precision of the method

2.3 考察方法回收率

準(zhǔn)確稱取約0.5 g醬油標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙酸定容，搖勻。對(duì)于一固定的醬油樣品，分別加入2.5，5.0，7.5 mL醬油標(biāo)準(zhǔn)品，乙酸溶液總體積保持60 mL，按照1.2的方法操作，測(cè)定回收率，每個(gè)濃度平行3次，結(jié)果見表2，回收率在94.87%～97.92%之間。

表2 電位滴定法測(cè)定醬油中氨基酸態(tài)氮的回收率(n=3)Table 2 The recovery rates of amino acid nitrogen in soy sauce determined by potentiometric titration method (n=3)

2.4 樣品檢測(cè)

分別用本文所建立的非水滴定法和國(guó)標(biāo)酸度計(jì)法對(duì)6種不同氨基酸態(tài)氮含量水平的醬油進(jìn)行檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，見表3，結(jié)果顯示無(wú)顯著差異。

表3 兩種方法測(cè)定不同樣品氨基酸態(tài)氮含量Table 3 The amino acid nitrogen content in different samples by two methods

3 討論與結(jié)論

醬油成分復(fù)雜，其中氨基酸種類繁多，每種氨基酸是否能充分被滴定以及醬油發(fā)酵過程中是否產(chǎn)生其他有機(jī)堿參與滴定仍待進(jìn)一步研究確證。由目前結(jié)論可知，本文考察的高氯酸非水滴定法測(cè)定醬油中氨基酸態(tài)氮含量具有一定可行性，初步建立的高氯酸非水滴定法具有操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，為醬油中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定提供了更多可能性，具有廣闊的研究及應(yīng)用前景。