艾灸對脾胃虛寒型腸易激綜合征大鼠腸粘膜機(jī)械屏障的影響及機(jī)制研究*

李 丹，李 佳，吳 松

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430061)

腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是常見的以腹痛、腹脹和腹瀉為主癥的功能性腸病。臨床IBS患者占消化門診量的30%～50%,且發(fā)病率逐年上升[1]，IBS臨床證型復(fù)雜，但多與脾虛相關(guān)。脾胃虛寒型IBS多由外感或內(nèi)生寒邪傷及脾陽，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下，臨床常反復(fù)發(fā)作,其發(fā)病機(jī)制未完全明確。研究表明[2-4]，當(dāng)病邪侵襲機(jī)體時(shí)，腸道粘膜啟動保護(hù)機(jī)制的同時(shí)腸粘膜的緊密結(jié)構(gòu)也會遭到破壞，腸粘膜上的緊密連接蛋白(ZO-1)、閉合蛋白(Claudin-1)和閉鎖蛋白(Occludin)等相關(guān)蛋白也會減少，腸道通透性改變可引起高敏感性。另外炎癥激活的肥大細(xì)胞釋放的大量5-羥色胺(5-HT)和5-羥吲哚乙酸(5-HAII)會引起內(nèi)臟的高敏感性及腸道動力障礙。IBS目前缺乏確定的治療方案和特異性藥物。研究表明[5]中醫(yī)治療IBS效果顯著，但針灸治療IBS機(jī)制尚不清楚，多從緩解腸道炎癥和增強(qiáng)免疫功能等方面論述。中醫(yī)辨證施治可緩解IBS大多癥狀，減少復(fù)發(fā)。實(shí)驗(yàn)證明[6-7]對機(jī)體熱敏感的穴位進(jìn)行施灸可有效治療IBS。本次研究選擇對足三里、神闕等穴進(jìn)行艾灸干預(yù)，以AWR、5-HT、5-HAII、occludin、claudin-1和腸道的超微結(jié)構(gòu)為觀察指標(biāo)，探討中醫(yī)外治法艾灸對IBS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

購SPF 級10周齡體質(zhì)量相近的 Wistar大鼠 30只。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)平均分為 3組，空白對照組、模型組和艾灸組。動物飼養(yǎng)在湖北中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)動物房中進(jìn)行，生產(chǎn)合格證號：SCXK(鄂)2018-0026，環(huán)境安靜，溫度和濕度適宜。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 儀器 10F雙腔導(dǎo)尿管(康樂保醫(yī)療用品有限公司)；壓力換能器(成都泰盟軟件有限公司)；冷凍離心機(jī)(Kendro Labrotary公司，德國)；組織脫水機(jī)、組織包埋機(jī)(Thermo Scientific公司，美國)；切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司)；恒溫?cái)偪酒瑱C(jī)(湖北安立信醫(yī)療有限公司有限責(zé)任公司)；BX53型生物顯微鏡(Olympus公司，日本)；T-100型PCR儀(Bio-Rad 公司，美國)。

1.2.2 試劑 艾條(10 mm×12 mm)、PBS緩沖、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜液、ECL顯影液、染色劑、occludin抗體、claudin-1抗體、細(xì)胞分離液和裂解液、ELISA試劑盒。

1.3 模型制備

D-IBS多由多種致病因素共同刺激下發(fā)生，故選用單一刺激方式制備IBS大鼠模型存在局限，本研究用束縛應(yīng)激聯(lián)合冰水游泳和番瀉葉灌胃制備脾胃虛寒型IBS大鼠模型。參照文獻(xiàn)方法[8]：具體操作:將模型組、艾灸組大鼠用繩每天將其四肢束縛1 h，限制其活動，然后將大鼠放入4 ℃冰水池中游泳15 min，1次/d，連續(xù)14 d，冰水刺激及束縛刺激同時(shí)每天下午番瀉葉水煎液10 mL/kg灌胃，連續(xù)14 d。空白對照組大鼠用生理鹽水灌胃(10 mL/kg/d)，不進(jìn)行冰水刺激和束縛刺激。結(jié)果顯示模型組、艾灸造模成功，造模過程中無大鼠死亡。

1.4 干預(yù)方法

參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]以及Chang Shik Yin等制定的“大鼠針灸穴位圖譜”[10]對足三里和神闕穴定位。定位后在穴區(qū)剃毛。將大鼠置于艾灸固定架上后用艾條一端對準(zhǔn)相應(yīng)穴區(qū)上2 cm，將點(diǎn)燃艾條施灸，每穴15 min，1次/d，共14 d，記錄艾灸前和艾灸后大鼠尾部溫度情況[7]?？瞻讓φ战M：飼喂普通飼料，不做任何處理,用KD表示；模型組：建立D-IBS模型并每日進(jìn)行抓取訓(xùn)練和鼠衣穿脫訓(xùn)練，共14 d，用MX表示；艾灸組：建立D-IBS模型后每日艾灸足三里、神闕穴，共14 d，用AJ表示。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 AWR評分 將小兒導(dǎo)尿管制成的擴(kuò)張球囊與注射器、壓力換能器和三通閥連接，將大鼠固定在桌面上，用石蠟油潤滑球囊導(dǎo)管后插入大鼠直腸6 cm，然后將導(dǎo)管束在大鼠尾端，防止滑出。待大鼠適應(yīng)后用注射器向球囊內(nèi)注入生理鹽水，觀察壓力換能器連接的信號采集系統(tǒng)，記錄大鼠出現(xiàn)評分為4分表現(xiàn)時(shí)的壓力值。每只大鼠刺激 3次, 取平均值[11-12]。AWR評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 AWR評分標(biāo)準(zhǔn)

1.5.2 5-HT、5-HAII濃度 電針干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠禁食不禁水24 h，麻醉后從腹主動脈中采集動脈血5 mL，離心分離血清，ELISA法檢測血清中5-HT、5-HIAA濃度[13]。

1.5.3 腸黏膜超微結(jié)構(gòu)取結(jié) 腸組織3塊于2.5%戊二醛和鋨酸固定，PBS漂洗，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，烤箱烤48 h后修塊定位，切片染色，透射電鏡觀察結(jié)腸組織腸黏膜超微結(jié)構(gòu)[14]。

1.5.4 occludin和claudin-1蛋白表達(dá)水平 取結(jié)腸組織置EP管中，加入LysisBuffer，冰浴半小時(shí)，析出蛋白后4 ℃離心，12 000 rpm，10 min，取其上清液，BCA法測蛋白濃度。配置凝膠、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗二抗的孵育、顯影、定影和剪取PVDF膜上的目的條帶，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,ImageJ軟件分析數(shù)據(jù)[15-16]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對于正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用方差分析和t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示。非正態(tài)分布且方差不齊,用Kruskal-Wallis H檢分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠AWR評分4分時(shí)結(jié)腸球囊擴(kuò)張(CRD)壓力比較

與KD比較，MX和AJ當(dāng)AWR評分為4分時(shí)CRD壓力值減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與MX比較，AJ的CRD壓力值顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠AWR評分為4分時(shí)結(jié)腸球囊擴(kuò)張(CRD)壓力比較

2.2 各組大鼠血清中5-HT、5-HIAA濃度比較

與KD比較，MX、AJ大鼠血清中5-HT、5-HIAA含量顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與MX比較，AJ大鼠血清中5-HT、5-HIAA含量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中5-HT、5-HIAA濃度比較

2.3 電鏡各組大鼠腸粘膜結(jié)構(gòu)比較

如圖1所示，KD大鼠腸粘膜微絨毛長度均勻一致，排列整齊且緊密，連接完整，清晰可見，上皮細(xì)胞排列整齊且形態(tài)結(jié)構(gòu)完好；MX腸粘膜微絨毛稀疏，長短不一，排列欠整齊，有少許斷裂，上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，間質(zhì)內(nèi)充滿高密度顆粒；AJ腸粘膜微絨毛排列較整齊，緊密連接完整，較清晰,上皮細(xì)胞形態(tài)正常，胞膜完整，間質(zhì)內(nèi)無高密度顆粒。

圖1 各組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)圖(1 700×)

2.4 各組大鼠claudin-1、occludin蛋白表達(dá)比較

與KD比較，MX和AJ大鼠結(jié)腸組織中claudin-1、occludin蛋白表達(dá)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與MX比較，AJ大鼠結(jié)腸中claudin-1、occludin蛋白表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 各組大鼠claudin-1、occludin蛋白表達(dá)比較

圖2 各組大鼠Claudin-1、Occludin蛋白表達(dá)

3 討論

近年來IBS是消化科門診的常見病,《中國臨床診療術(shù)語》確定IBS病名為“腸郁”[17]。IBS無明確的器質(zhì)性病變，西醫(yī)尚無明確治療方案。研究表明[18]針灸對治療功能性胃腸疾病有良好的療效。中醫(yī)認(rèn)為其病機(jī)為心脾兩虛，病理因素主要為氣虛、陽虛兼有內(nèi)寒、內(nèi)濕和內(nèi)熱等[19]。情志失調(diào)多為誘因，病機(jī)為脾失健運(yùn)兼心神失調(diào)。臨床常見的IBS癥型有：脾胃虛寒、肝氣脾虛、肝郁氣滯、脾胃濕熱和寒熱錯雜等。其中脾胃虛寒證較為多見，多由貪涼飲冷所致。治療上宜健脾胃為主，調(diào)心神為輔。臨床上中醫(yī)外治法治療IBS方法眾多,而辨證論治是針灸治療疾病的基礎(chǔ)[20]，故本次實(shí)驗(yàn)選用足三里、神闕穴施灸，可改善患者脾胃虛寒引起的癥狀，恢復(fù)脾胃的運(yùn)化功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，對治療脾胃虛寒型IBS有顯著療效。足三里乃胃之下合穴，“肚腹三里留”，足三里固護(hù)脾胃化生的后天之氣。神闕穴可培元固本、和胃理腸。灸之可顯著改善患者陽虛癥狀，研究表明[21-22]艾灸治療IBS療效確切,對改善機(jī)體免疫力、增強(qiáng)機(jī)體抗病能力有一定作用。

腸粘膜的機(jī)械屏障是由腸上皮細(xì)胞和細(xì)胞之間的黏連蛋白構(gòu)成[23]。腸粘膜上有大量的黏連蛋白。其中Occludin、Claudin-1是非常重要的緊密連接蛋白[24]。Occludin能調(diào)節(jié)和維持腸道通透性，參與細(xì)胞內(nèi)信號傳遞。當(dāng)Claudin-1表達(dá)異常時(shí)會導(dǎo)致組織滲透性改變而引起水鈉代謝失衡，從而引起腹瀉。當(dāng)致病因素侵襲時(shí)，腸粘膜的緊密連接蛋白會遭到破壞，腸道通透性增加，而腸道通透性改變又是內(nèi)臟高敏感性的重要原因之一，腸道高敏感性和腸道動力障礙可引起腹痛、腹脹。當(dāng)致病因素侵襲機(jī)體時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)啟動應(yīng)激機(jī)制，肥大細(xì)胞會釋放大量5-HT，5-HT參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)與胃腸道系統(tǒng)之間的信號傳遞[25]，釋放后的5-HT會與腸粘膜上的5-HT受體結(jié)合，使胃腸動力發(fā)生異常改變，從而加重腹痛、腹瀉。5-HIAA是5-HT被肥大細(xì)胞內(nèi)的單胺氧化酶(MAO)降解的產(chǎn)物，5-HIAA的濃度可以反映5-HT在肥大細(xì)胞內(nèi)的代謝情況[26]。故5-HT、5-HIAA濃度的變化可以反應(yīng)腸粘膜上免疫系統(tǒng)的活性。而機(jī)體的免疫功能是由機(jī)械屏障和免疫屏障共同構(gòu)成，二者之間相互影響。

此次研究發(fā)現(xiàn)IBS患者腸粘膜處于旺盛分泌和高度活躍的狀態(tài)，其腸粘膜超微結(jié)構(gòu)發(fā)生很大的改變，艾灸可促進(jìn)IBS患者腸粘膜的修復(fù)，維持神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，減輕臨床癥狀。