擬穴青蟹新型抗菌肽的發(fā)現(xiàn)、研究與應用進展

王克堅，陳芳奕，彭 會

(廈門大學海洋與地球?qū)W院，近海海洋環(huán)境科學國家重點實驗室，海洋生物制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建省海洋生物抗菌肽產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，福建 廈門 361102)

我國是世界上最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖國家，養(yǎng)殖量占世界總量的60%以上.水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)長期過量使用抗生素導致的細菌耐藥性增加、水產(chǎn)品中抗生素殘留和養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素污染等問題，已成為嚴重影響我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重大科學問題.國際上瑞典、丹麥等國家于20世紀80—90年代就開始禁止飼料中添加抗生素，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2019年發(fā)布194號公告[1]：自2020年起，我國飼料中全面禁止添加抗生素，減少濫用抗生素造成的危害，維護動物源食品安全和公共衛(wèi)生安全.自1928年青霉素問世以來，抗生素的種類不斷增加，至今已逾百種.除了臨床使用外，1950年美國食品與藥品管理局(FDA)首次批準抗生素可以作為飼料添加劑使用，此后抗生素被全面應用于動物養(yǎng)殖業(yè)，在預防和治療動物傳染性疾病、促進動物生長等方面發(fā)揮了重要作用.但由于抗生素在醫(yī)療衛(wèi)生和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域的濫用，大量抗生素迅速失去效力，原本對抗生素敏感的微生物對抗生素出現(xiàn)高度耐受，這種現(xiàn)象稱為抗生素耐藥性.抗生素耐藥性給人類帶來了新的風險，甚至成為威脅人類健康的一個公共健康問題.畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中長期濫用抗生素也是導致細菌耐藥性的重要原因.我國是抗生素生產(chǎn)和消費大國，僅在2013年我國就使用抗生素16.2萬t，約占全球用量的一半，其中48%為人用，52%為獸用，據(jù)報道最終超過5萬t抗生素被排放進入水土環(huán)境中[2].2018年我國抗生素原料藥產(chǎn)量19.6萬t，約占全球用量的一半，且超50%用于養(yǎng)殖業(yè)[3].此外，每年有數(shù)萬噸抗生素被排放進入水土環(huán)境中.由于長時間不合理的使用以及缺乏嚴格的監(jiān)管機制，抗生素耐藥性問題十分嚴峻.我國現(xiàn)已成為世界上細菌耐藥最嚴重的國家之一，同時也是世界上細菌耐藥率增長最快的國家之一.

然而，近30多年來新型抗生素的開發(fā)很少，因此開發(fā)新型抗耐藥性細菌感染、可替代抗生素的治療藥物已迫在眉睫.尋找抗生素的有效替代品，亦成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的迫切需求，而抗菌肽的研發(fā)與利用可為解決這一重要問題提供關(guān)鍵技術(shù)支撐.抗菌肽是一類廣泛存在于自然界生物體中的小分子多肽，作為生物體先天性免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，在機體對抗外界病原微生物感染和自身免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用.天然抗菌肽通常由12～100個氨基酸組成，具有較好的熱穩(wěn)定性和水溶性，抗菌譜廣，對革蘭氏陽性(G+)和陰性(G-)細菌都有抗菌活性，對耐藥性細菌也有較好的活性.

海洋擁有地球上約80%的生物資源，海洋無脊椎動物居多，面對海洋環(huán)境中多種病原微生物或有害物質(zhì)等，無脊椎動物需要建立比脊椎動物更多樣性的先天性免疫系統(tǒng).海洋無脊椎動物擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)因其自身是開放系統(tǒng)且有多次蛻皮的脆弱發(fā)育階段，易受微生物侵染，是開發(fā)高效且抗多種病原微生物的新型抗菌肽的重要來源，值得深入研究.

自1981年瑞典科學家從昆蟲中分離獲得首個抗菌肽天蠶素[4]以來，迄今人們在各種生物體中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了3 000多個抗菌肽或其類似物(APD數(shù)據(jù)庫，http:∥aps.unmc.edu/AP/main.php).相對于陸地生物的抗菌肽，海洋動物的抗菌肽研究開始較晚，第一個蟹類抗菌肽是1996年Schnapp等[5]從岸蟹(Carcinusmaenas)中分離得到的富含脯氨酸的甲殼動物抗菌肽.隨后陸續(xù)從蝦蟹類等中獲得了一些抗菌肽，如鱟素(tachyplesins)[6]、抗脂多糖因子(ALFs)[6]、對蝦素(penaeidins)[7]、甲殼素(crustins)[8]等.但迄今APD數(shù)據(jù)庫顯示的甲殼動物抗菌肽僅有60多種，與同是節(jié)肢動物的昆蟲(300余種)相比，數(shù)量相對較少.大多數(shù)已報道的海洋甲殼動物來源抗菌肽具有良好的抗細菌(G+菌和G-菌)、抗病毒活性；而具有抗真菌活性的海洋甲殼動物抗菌肽相對較少[9].目前，海洋甲殼類動物抗菌肽大多來源于十足目動物(表1).

表1 海洋甲殼類動物來源的部分抗菌肽及其基本活性概覽Tab.1 Overview of antimicrobial peptides (AMPs) from marine crustaceans and their basic activities

由表1可見，目前海洋甲殼動物來源的抗菌肽大多鑒定自血淋巴系統(tǒng)，多具有廣譜抗菌活性.近10年來，海洋甲殼動物的血淋巴系統(tǒng)被視為挖掘新型高效抗菌物質(zhì)的良好資源.其中來源于擬穴青蟹的抗菌肽主要包括crustins和ALFs等.crustins是一類帶信號肽的陽離子抗菌肽，N端有多結(jié)構(gòu)域，C端有乳清酸性蛋白(WAP)結(jié)構(gòu)域，分子質(zhì)量為7.0 ～ 14.0 ku，具有抗菌、抗病毒、蛋白酶抑制活性和體液免疫調(diào)節(jié)等多種功能.在擬穴青蟹中有6個crustins已被報道[36-39]：根據(jù)不同的N端區(qū)域，CrusSp、SpCrus3、SpCrus4和SpCrus6被劃分為Ⅰ型crustins(富含半胱氨酸)，而SpCrus2和SpCrus5為Ⅱ型crustins(富含甘氨酸).這些crustins主要在鰓中表達，重組SpCrustins對G+菌有很強的抗菌活性，而對G-菌的抗菌活性較弱，且大多數(shù)可被細菌誘導上調(diào)表達；所有SpCrustins都能特定結(jié)合G+菌、G-菌、真菌和微生物表面的碳水化合物成分，如脂多糖(LPS)、脂磷壁酸、肽聚糖和β-葡聚糖.ALFs是抗菌肽家族的另一主要類型，能夠結(jié)合并中和G-菌的成分LPS，在擬穴青蟹中共發(fā)現(xiàn)7種ALFs：ALFSp[40]、ALFSp2[41]、Sp-ALF1和Sp-ALF2[42]、SpALF4[43]、SpALF5[44]和SpALF6[45].大部分SpALFs主要分布在血細胞中，哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)或LPS刺激均能顯著誘導其上調(diào)表達；重組SpALFs或含有LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域的SpALFs衍生肽對G+菌和G-菌，甚至對釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和白色念珠菌(Camdidaalbicans)都有很強的抗菌活性；其中Sp-ALF1和Sp-ALF2重組蛋白可有效抑制白斑綜合征病毒(WSSV)的復制，并對所選擇的微生物和細菌碳水化合物組分表現(xiàn)出不同的結(jié)合活性[42].

從擬穴青蟹中還分離到其他一些在血細胞中高表達的陽離子抗菌肽，包括SpHyastatin[28,46]、富含脯氨酸的SpPR-AMP1[47]、arasin-likeSp和GRPSp[46].其中SpPR-AMP1是一個富含脯氨酸的分子質(zhì)量為6.5 ku的小分子抗菌肽，可被肽聚糖(PGN)誘導表達[22]，重組或合成的SpPR-AMP1均能抑制G+菌Micrococcusluteus和G-菌V.harveyi的生長.arasin-likeSp和GRPSp的成熟肽分子質(zhì)量分別為4.4 和3.0 ku，且都含有一個富含甘氨酸的區(qū)域和幾個半胱氨酸殘基；它們也可以在細菌感染時被上調(diào)表達，且兩種合成的肽都顯示出對不同細菌的抗菌活性[46].此外，擬穴青蟹的一些免疫因子也具有抗菌活性，如：一種新型Ⅰ型溶菌酶Splys-Ⅰ在擬穴青蟹的腸道中高表達，雖然它缺乏典型的溶菌酶活性，但是能被細菌誘導上調(diào)，并能通過結(jié)合和黏附抑制細菌生長[48].另一種溶菌酶是最近從擬穴青蟹中分離得到的C型溶菌酶(SpLyzC)，主要分布在肝胰臟和鰓中；與Splys-Ⅰ類似，SpLyzC對細菌，特別是蟹類病原體副溶血性弧菌具有抗菌活性[49].

本課題組自2002年起一直聚焦我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)抗生素污染的重大科學問題，以研發(fā)抗生素的有效替代品為目標，致力于海洋動物新型抗菌肽的研發(fā)與利用研究，先后從海洋魚類、青蟹等分離鑒定出一系列新型抗菌肽.下文重點介紹幾種擬穴青蟹(后文簡稱青蟹)新型抗菌肽的發(fā)現(xiàn)、研究及其應用，總結(jié)自2006年首次報道一種源于青蟹精漿的新型抗菌肽scygonadin后的系列研究成果及其進展.

1 源于青蟹精漿的新型抗菌肽scygonadin和SCY2的發(fā)現(xiàn)及其功能

1.1 新型抗菌肽scygonadin及其同源抗菌肽SCY2

利用離子交換和反相層析技術(shù)，從我國重要海水養(yǎng)殖青蟹精漿中分離純化得一個分子質(zhì)量為10.8 ku的多肽，其具有顯著抗菌活性；通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)鑒定該多肽指紋圖譜，Edman降解法測定其N端部分氨基酸序列，并經(jīng)GenBank和Swiss-Prot等數(shù)據(jù)庫檢索分析證明為一種新的抗菌肽，命名為scygonadin[50-51].該新型抗菌肽scygonadin主要在成熟的雄性青蟹射精管中高表達，是迄今在甲殼動物中發(fā)現(xiàn)的首個陰離子抗菌肽，豐富了甲殼動物抗菌肽的理論；后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)scygonadin具有廣譜抗菌活性，且能抑制WSSV感染青蟹[50-51].

隨后克隆獲得與scygonadin有65%序列相似度、分子質(zhì)量10.0 ku、等電點4.84的另一個同源多肽，是一種主要抗G+菌的陰離子抗菌肽，命名為SCY2[34].兩種抗菌肽都具有較強的抗微生物活性：scygonadin抗G+菌和G-菌，而SCY2主要抗G+菌.SCY2也能抑制WSSV感染青蟹，且在水產(chǎn)致病菌副溶血弧菌感染青蟹的情況下，能夠提高青蟹的存活率，說明SCY2在青蟹抗病原微生物感染中可發(fā)揮重要的免疫作用[31].該發(fā)現(xiàn)豐富了甲殼動物抗菌肽在保證青蟹授精、精子輸送和納精囊中長期保存等生殖免疫方面的理論.

1.2 Scygonadin和SCY2基因的交配誘導表達特性及其受激素孕酮調(diào)控的機制

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Scygonadin和SCY2基因均在成熟雄性青蟹的射精管中高表達，且不受LPS、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和白色念珠菌等直接刺激誘導表達[50-51].Scygonadin和SCY2基因均在青蟹繁殖季節(jié)表達量最高，且在雄性青蟹中交配前的表達量高于交配后，推測其可能在交配時受到體內(nèi)激素水平或其他物質(zhì)的調(diào)節(jié)；深入研究不同激素對兩基因表達模式的影響發(fā)現(xiàn)，Scygonadin和SCY2基因的表達模式與青蟹性腺成熟規(guī)律一致，而性類固醇激素的周年變化也與青蟹性腺成熟時期相吻合，說明性類固醇激素可能參與青蟹性成熟的調(diào)節(jié)過程[50-51].進一步在細胞培養(yǎng)中用多種激素驗證發(fā)現(xiàn)，激素孕酮可顯著誘導SCY2基因的表達，且加入孕酮受體抑制劑后，SCY2基因的表達被顯著抑制；而以LPS刺激的細胞中SCY2的表達與對照類似，都無顯著變化，說明SCY2是由激素孕酮而非LPS刺激誘導，推測SCY2的表達可能受孕酮信號調(diào)控[34].此外，交配后雄性射精管中高表達的兩種抗菌肽的轉(zhuǎn)錄本減少，而雌性納精囊中兩種抗菌肽的轉(zhuǎn)錄本顯著增多，表明兩種抗菌肽可能隨交配后的雄性精液共同轉(zhuǎn)移至雌蟹體內(nèi)[34]，表明新發(fā)現(xiàn)的scygonadin和SCY2兩種抗菌肽功能與青蟹生殖免疫相關(guān).上述兩種抗菌肽在青蟹性成熟時經(jīng)交配誘導高表達，且其表達受激素孕酮調(diào)控，在精子轉(zhuǎn)運、納精囊儲存和授精過程中發(fā)揮保護作用，具有生殖免疫功能，為進一步探究激素在青蟹體內(nèi)生殖免疫中的調(diào)控機制奠定了基礎.

1.3 SCY2互作蛋白scyreprocin的顯著抗細菌和抗真菌活性

在研究擬穴青蟹抗菌肽SCY2的過程中，通過酵母雙雜交技術(shù)，從雄性擬穴青蟹性腺中鑒定得一個與SCY2存在相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)其核酸序列、氨基酸序列與現(xiàn)有的開放數(shù)據(jù)庫中序列無任何相似性，命名為scyreprocin[35].通過基因工程表達技術(shù)獲得抗菌肽scyreprocin的原核表達產(chǎn)物(rScyreprocin)，該表達產(chǎn)物具有廣譜抗菌活性，能夠以較低的效應濃度(<10 μmol/L)有效抑制及殺滅病原細菌(包括G+菌和G-菌)和真菌、顯著抑制霉菌孢子的萌發(fā)、抑制并清除真菌生物膜的形成，且rScyreprocin對多株分離自臨床樣本的多重耐藥性菌亦表現(xiàn)出較強的抑殺活性；rScyreprocin針對不同的微生物具有不同的抑殺菌作用機制，能夠直接作用于細菌及真菌表面，使微生物細胞膜通透性發(fā)生改變，膜結(jié)構(gòu)破損，細胞內(nèi)容物泄露而導致微生物死亡，還能夠誘導真菌細胞發(fā)生凋亡效應，通過誘導凋亡及破壞細胞膜結(jié)構(gòu)雙重方式殺傷真菌；rScyreprocin與SCY2無協(xié)同抗菌活性，然而rScyreprocin與SCY2聯(lián)合使用時對真菌生物膜表現(xiàn)出一定的聯(lián)合抑制效應[35].

rScyreprocin具有良好的體內(nèi)抗菌活性.在海水青鳉(Oryziasmelastigma)注射半致死劑量的哈維氏弧菌2 h后，再注射不同濃度的rScyreprocin、SCY2及rScyreprocin+SCY2，結(jié)果顯示[35]：僅注射哈維氏弧菌的海水青鳉24 h內(nèi)存活率僅有40%；而在rScyreprocin注射組中，隨著劑量上升，海水青鳉存活率可達60%～80%，且1 μg/尾的注射劑量可達到與8 μg/尾注射劑量相同的保護效果，均能將海水青鳉的存活率提升至80%，表明高濃度rScyreprocin注射對海水青鳉存活無影響，且可在病原菌哈維氏弧菌感染下提高其存活率.此外，SCY2本身雖然不能顯著提高哈維氏弧菌感染下海水青鳉的存活率，但是將其與rScyreprocin共同使用時，可在減少rScyreprocin用量的情況下達到更好的保護效果，說明該抗菌肽在受試靶動物抵御病原微生物過程中可發(fā)揮重要的免疫作用.因此，該抗菌肽在抗菌藥物及抑菌防霉劑方面具有應用潛力.

2 源于血淋巴系統(tǒng)的兩種新型抗菌肽sphistin和SpHyastatin的發(fā)現(xiàn)及其功能

2.1 sphistin的體內(nèi)外抗菌活性

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)了幾種源于血淋巴系統(tǒng)的新型抗菌肽，如SpHyastatin[28]和sphistin[31]等.sphistin源于青蟹血液中組蛋白2A的N-端38個氨基酸，研究發(fā)現(xiàn)[31]：其具有很強的抗G+菌、G-菌及酵母菌等活性；通過掃描電鏡觀察到用sphistin處理的大腸桿菌(Escherichiacoli)表面有細胞內(nèi)容物滲出，證明sphistin處理能夠提高大腸桿菌的細胞膜通透性；用雙光子共聚焦顯微鏡進一步觀察到sphistin能夠結(jié)合到金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和畢赤酵母(Pichiapastoris)的細胞膜上，但不能進入細胞質(zhì)，可見其抗菌機制很可能是通過吸附到細菌細胞膜表面，導致細胞膜通透性增加而產(chǎn)生抗菌作用.sphistin對多種細菌具有很強的抑殺活性，最小抑制濃度(MIC)為1.5～3 μmol/L，對金黃色葡萄球菌的MIC<1.5 μmol/L，對水產(chǎn)致病菌嗜水氣單胞菌的MIC<1.5 μmol/L；此外，sphistin還具有較強的抗真菌作用，對腫瘤細胞亦表現(xiàn)出顯著抑制作用.

對sphistin的結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，其截短肽Sph12-38同樣具有廣譜的抗菌活性[32]:對金黃色葡萄球菌、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌(Aeromonessobria)等均具有很強的抑殺作用，MIC<3 μmol/L；殺菌動力學曲線表明，Sph12-38對溫和氣單胞菌的殺滅率可在6 h內(nèi)達到100%.體內(nèi)抗菌試驗研究發(fā)現(xiàn)Sph12-38對感染了溫和氣單胞菌的海水青鳉具有良好的免疫保護作用[32]：將Sph12-38與溫和氣單胞菌混合后共注射海水青鳉，與單獨注射溫和氣單胞菌的海水青鳉相比，在注射后7 d內(nèi)，海水青鳉存活率有明顯提高，證明Sph12-38可以在溫和氣單胞菌感染時提高海水青鳉的存活率；此外，在注射后48 h內(nèi)，共注射的海水青鳉肝臟內(nèi)免疫基因表達量相對于健康的海水青鳉顯著上調(diào)，而相對于單獨注射溫和氣單胞菌的海水青鳉則顯著下調(diào)，表明Sph12-38對溫和氣單胞菌感染海水青鳉引起的炎癥反應具有緩解作用.

2.2 SpHyastatin的體內(nèi)外抗菌活性及其調(diào)控機制

從本課題組前期建立的血細胞cDNA文庫篩選獲得抗菌肽SpHyastatin[28]：其具有較強的抗微生物活性，其真核表達產(chǎn)物對嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌以及真菌等均顯示較強的抑殺作用；SpHyastatin在血淋巴細胞中表達量最高，在青蟹的大眼幼體、仔蟹(10～20 mg)、仔蟹(40 g)和成蟹(300 g)4個階段發(fā)育過程中始終保持高水平表達，暗示該抗菌肽可能在青蟹整個發(fā)育過程中發(fā)揮免疫作用.

體內(nèi)試驗研究結(jié)果顯示[28]：青蟹感染副溶血弧菌后，注射SpHyastatin可較顯著地提高青蟹的存活率；用SpHyastatin表達產(chǎn)物單獨注射青蟹1 h后再經(jīng)副溶血弧菌感染192 h，亦可顯著提高青蟹的存活率；此外，SpHyastatin表達產(chǎn)物與副溶血弧菌共注射青蟹120 h，可延遲青蟹的死亡，青蟹的半數(shù)致死時間可從10 h延遲到30 h，表明SpHyastatin具有免疫保護作用.在細菌感染下SpHyastatin的存在會影響其他免疫基因的表達水平.青蟹注射副溶血弧菌后，其Toll通路相關(guān)基因(Spaetzle、SpToll、Cactus、Dorsal和Relish)、抗氧化酶相關(guān)基因(SOD、CAT和GPx)及溶菌酶基因的表達水平均顯著升高；而SpHyastatin與副溶血弧菌共注射后，青蟹中上述基因的表達會顯著降低.

通過基因步移技術(shù)擴增獲得576 bp的SpHyastatin基因上游調(diào)控序列，分析發(fā)現(xiàn)核因子κB(NF-κB)結(jié)合位點是SpHyastatin基因啟動子區(qū)域的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件；進而利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)及鯉魚上皮瘤細胞EPC和人宮頸癌細胞Hela研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)SpHyastatin基因5’ 側(cè)翼-107～-69 bp區(qū)域存在假定NF-κB結(jié)合位點，而NF-κB結(jié)合位點的三堿基突變和缺失突變重組子的轉(zhuǎn)錄活性顯著下降，表明該元件對SpHyastatin基因的轉(zhuǎn)錄起正調(diào)控作用；此外，LPS可顯著增強SpHyastatin基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，但對NF-κB結(jié)合位點突變的重組子無明顯誘導作用，提示LPS可能通過NF-κB結(jié)合位點調(diào)控SpHyastatin基因的轉(zhuǎn)錄[52].上述研究結(jié)果有助于深入研究LPS或病原微生物刺激引起抗菌肽基因的表達變化機制.

上述6種新型抗菌肽的特性及其抗菌機制總結(jié)于表2.

表2 本文介紹的新型抗菌肽Tab.2 New AMPs introduced in this article

3 新型抗菌肽與抗生素的協(xié)同抗菌作用

多年來人們一直在探索減少抗生素用量的方法或?qū)ふ倚碌目咕噭?抗菌肽是理想的候選藥物，其可以單獨使用，也可以與傳統(tǒng)抗生素聯(lián)合使用殺滅病原體和多重耐藥性細菌.本課題組利用臨床病原菌銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)評價了擬穴青蟹抗菌肽sphistin和Sph12-38聯(lián)合8種臨床常用抗生素的抗菌效果[53].

體外抗菌實驗顯示：利福平和阿奇霉素對銅綠假單胞菌的MIC分別為2.5和180 μg/mL；而抗菌肽sphistin和Sph12-38對銅綠假單胞菌的MIC分別為24和12 μmol/L.當抗生素利福平和阿奇霉素聯(lián)合sphistin和Sph12-38使用時，1/4×MIC的sphistin+1/10×MIC的阿奇霉素(分級抑制濃度指數(shù)(FICI)=0.350)和1/16×MIC的sphistin+1/4×MIC的利福平(FICI=0.313)均能有效殺滅銅綠假單胞菌；1/8×MIC的Sph12-38+1/10×MIC的阿奇霉素(FICI=0.225)和1/8×MIC的Sph12-38+1/4×MIC的利福平(FICI=0.375)同樣能有效殺滅銅綠假單胞菌.可見抗生素利福平和阿奇霉素與抗菌肽sphistin和Sph12-38聯(lián)合使用對銅綠假單胞菌均具有協(xié)同抗菌作用，其機制可能是sphistin和Sph12-38與銅綠假單胞菌外膜的LPS結(jié)合，使得細菌細胞膜的通透性增加，促進細胞對利福平和阿奇霉素的攝取，從而殺滅細菌.

體內(nèi)抗菌試驗結(jié)果顯示：在小鼠背部人為制造的2 cm×2 cm傷口(深及真皮層)使用銅綠假單胞菌涂抹2 h后，分別將利福平、阿奇霉素、Sph12-38、Sph12-38+利福平以及Sph12-38+阿奇霉素經(jīng)皮下注射到小鼠背部感染傷口中，與傷口只注射生理鹽水的小鼠(對照組)相比，注射了Sph12-38+利福平和Sph12-38+阿奇霉素的小鼠傷口愈合時間顯著縮短，由對照組的7～8 d縮短至4～5 d，表明兩種抗生素與抗菌肽Sph12-38協(xié)同使用時，能夠顯著促進感染了銅綠假單胞菌的小鼠傷口愈合，并且使愈合時間明顯縮短3 d.

綜上所述，抗菌肽sphistin和Sph12-38與抗生素利福平和阿奇霉素聯(lián)合使用對銅綠假單胞菌具有顯著的協(xié)同抗菌作用，與單獨使用抗生素進行治療相比，抗生素與抗菌肽的聯(lián)合使用能夠顯著降低抗生素的用量.由于阿奇霉素和利福平都不是臨床上治療銅綠假單胞菌感染時優(yōu)先使用的藥物，所以將抗菌肽與這兩種抗生素聯(lián)合使用在一定程度上擴展了它們的應用范圍.

4 新型抗菌肽的基因工程表達及應用

4.1 抗菌肽的原核與真核基因工程表達

抗菌肽在生物體內(nèi)含量較低，直接從動物組織分離純化成本高，難以滿足功能研究或規(guī)模化生產(chǎn)應用的需求；其結(jié)構(gòu)特殊(如含有多個二硫鍵等)，利用化學方法合成抗菌肽也受到一定局限.為此，本課題組利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了含有不同新型青蟹抗菌肽基因的多個原核或真核高效表達載體，獲得了scygonadin、SCY2和scyreprocin等多個抗菌肽的表達產(chǎn)物，且抗菌實驗結(jié)果表明所表達的抗菌肽具有廣譜抗菌活性[34-35,50-51,54-55].在此基礎上，與企業(yè)合作建立了海洋動物抗菌肽的畢赤酵母規(guī)?；l(fā)酵工藝，使抗菌肽實現(xiàn)了穩(wěn)定高表達，可滿足產(chǎn)業(yè)化要求.

此外，本課題組利用基因工程表達技術(shù)獲得了穩(wěn)定表達抗菌肽Scy-hepc融合基因的轉(zhuǎn)基因小球藻(Chlorella)[56]:用嗜水氣單胞菌分別感染黑鯛(Sparusmacrocephalus)和龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus(♀)×E.lanceolatus(♂))后，以灌胃方式分別喂食轉(zhuǎn)抗菌肽Scy-hepc融合基因的小球藻和野生型小球藻，發(fā)現(xiàn)喂食轉(zhuǎn)抗菌肽基因小球藻的黑鯛和龍膽石斑魚的存活率均顯著高于喂食野生型小球藻的對照組，其中嗜水氣單胞菌感染的龍膽石斑魚36 h后存活率比對照組高30%，嗜水氣單胞菌感染的黑鯛72 h后存活率比對照組高50%，說明轉(zhuǎn)抗菌肽Scy-hepc基因的小球藻對受試靶動物具有較強的免疫保護作用.

4.2 新型抗菌肽基因工程產(chǎn)品的示范應用

目前，兩種海洋動物抗菌肽產(chǎn)品分別在國家資質(zhì)檢測機構(gòu)完成了產(chǎn)品的小鼠經(jīng)口急性毒性試驗、三致試驗和大鼠慢性毒性試驗等，證明其安全、無毒副作用；進一步按照國家農(nóng)業(yè)部相關(guān)要求，在海水養(yǎng)殖魚類完成了抗菌肽的中間試驗和環(huán)境釋放試驗.基于此，大黃魚抗菌肽和青蟹抗菌肽的基因工程產(chǎn)品分別于2015和2016年獲得國家農(nóng)業(yè)部批準的生產(chǎn)應用安全證書(農(nóng)基安辦證書(2015)第036號和農(nóng)基安證字(2016)第018號)，其中大黃魚抗菌肽是我國迄今獲批的首個海洋動物抗菌肽生產(chǎn)應用的安全證書，表明新型海洋動物抗菌肽正式獲準進入示范應用階段.

獲得生產(chǎn)應用安全證書的海洋動物抗菌肽產(chǎn)品具有抗菌效果好、不易產(chǎn)生耐藥性、無殘留等特點，2017年3月起已先后在福建省和浙江省等7個養(yǎng)殖場的石斑魚、大黃魚、鱸魚和對蝦等養(yǎng)殖品種上進行示范應用，并取得了顯著效果，不僅能顯著促進養(yǎng)殖動物的生長，還能顯著提高機體免疫力和抗病能力.

5 總結(jié)與展望

本文闡述了目前抗生素耐藥性的現(xiàn)狀以及海洋甲殼類抗菌肽的研究進展，并重點介紹了擬穴青蟹中新型抗菌肽的發(fā)現(xiàn)及其應用，總結(jié)了本課題組自2006年首次報道了一種源于青蟹精漿的新型抗菌肽scygonadin后的系列研究成果及其進展.

海洋孕育著地球上超過半數(shù)的物種，其物種豐度、多樣性大大超過陸地.盡管目前已知的抗菌肽中來源于海洋動物的相比于陸地生物的尚少，但科學家們已經(jīng)逐漸注意到海洋這個潛在的天然活性物質(zhì)寶庫.海洋生物為抵御病原感染、逃避獵食者及捕食獵物而進化產(chǎn)生不同的活性分子，為我們提供了數(shù)目龐大的具有分子結(jié)構(gòu)多樣性的活性物質(zhì).然而，海洋甲殼類動物的基因注釋存在一定困難，成為限制挖掘其活性蛋白(如抗菌肽等)的主要因素.隨著越來越多海洋甲殼類動物基因組的測序及發(fā)表，將會有更多包括抗菌肽在內(nèi)的活性蛋白(如抗氧化蛋白、凝集素、模式識別受體和蛋白酶等)被逐步挖掘并應用于實際生產(chǎn)中.

此外，隨著抗生素在我國養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)飼料中的禁用，抗生素有效替代品的研發(fā)已成為保障我國養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重大需求；隨著全球性抗生素耐藥性問題的出現(xiàn)，人們的健康安全受到極大的威脅，研發(fā)可有效抗耐藥性細菌、真菌的藥物或活性物質(zhì)也勢在必行，這是當代和未來的挑戰(zhàn)也是機遇.源于海洋生物的抗菌肽的發(fā)現(xiàn)與利用，在未來的養(yǎng)殖業(yè)、食品、飼料和人類健康等方面將發(fā)揮不可替代的重要作用，也具有重大的開發(fā)和利用價值.