病毒樣顆粒在腫瘤治療中的研究進(jìn)展

任 磊，程科滿，張 強(qiáng)，王楚凡，杜 濤

(廈門大學(xué)材料學(xué)院，福建省高校生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005)

20世紀(jì)60年代中期，病理學(xué)家在被病毒感染的人類和動(dòng)物組織樣本中首次觀察到類病毒納米顆粒[1-3]，這些納米顆粒與病毒形態(tài)相似但沒有傳染性，將其稱為病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs).進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，VLPs是一種由病毒蛋白重復(fù)排列而成的規(guī)則的中空蛋白顆粒結(jié)構(gòu)，能夠展示病毒表位，但不包含病毒遺傳物質(zhì)，不具有復(fù)制和感染特性，多數(shù)呈球狀或管狀[4].相比于其他納米載體，VLPs具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢：1) 通過重組蛋白表達(dá)即可實(shí)現(xiàn)簡單、經(jīng)濟(jì)、可控的大規(guī)模生產(chǎn)；2) 組成和結(jié)構(gòu)均一，易于在特定位置進(jìn)行功能化改造；3) 在體內(nèi)外均具有生物相容性和生物可降解性；4) 解聚重組能力和空腔結(jié)構(gòu)易于進(jìn)行藥物包載[5-6].這些特性引起了人們對開發(fā)VLPs作為疫苗和藥物遞送載體的濃厚興趣.大量研究證實(shí)VLPs具有較高的免疫原性，能夠充分激活機(jī)體免疫反應(yīng)，促進(jìn)B細(xì)胞活化并釋放抗體[4,7-13]，并且納米尺度的VLPs可以被抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cells,APCs)大量攝取并降解，從而活化T細(xì)胞[14-16].VLPs除了作為疫苗應(yīng)用外，利用VLPs的空腔結(jié)構(gòu)和可修飾性可以包裹或展示一些小分子藥物，從而實(shí)現(xiàn)靶向遞送，極大改善了藥物的體內(nèi)分布和療效[6,17-20].在過去的50多年里，VLPs已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究中的重要工具(圖1)[21-26].本文綜述了VLPs在腫瘤治療中的研究進(jìn)展，著重介紹了VLPs作為腫瘤藥物遞送載體和疫苗的設(shè)計(jì).

1 VLPs的免疫原性

圖1 VLPs發(fā)展的各個(gè)階段概覽Fig.1 An overview of various stages in the development of VLPs

T細(xì)胞在抗癌免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用.APCs通過免疫組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex,MHC)可以將抗原遞呈給T細(xì)胞識(shí)別，其中由MHC Ⅰ遞呈的抗原可以刺激并活化CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)直接殺傷腫瘤細(xì)胞，此外，CTL產(chǎn)生的細(xì)胞因子能夠形成促炎癥環(huán)境進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞[27].由MHC Ⅱ遞呈的抗原可以刺激并活化CD4+T細(xì)胞，該細(xì)胞的不同亞型在抗腫瘤反應(yīng)中的作用不同：Th1(CD3+CD4+干擾素γ(IFNγ)+)細(xì)胞通過分泌促炎癥細(xì)胞因子，輔助CD8+CTL裂解腫瘤細(xì)胞[28];而另一種免疫抑制細(xì)胞Tregs(CD3+CD4+Foxp3+)則通過分泌白介素10(IL-10)和腫瘤生長因子β(TGF-β)等細(xì)胞因子，抑制CTL增殖并降低炎癥反應(yīng)[29-30].因此，加強(qiáng)Th1細(xì)胞和CTL的激活是抗腫瘤疫苗研制的關(guān)鍵.VLPs能夠引起一定固有免疫，且易于進(jìn)行基因工程改造[31-36]，已被證實(shí)可以有效誘導(dǎo)Th1細(xì)胞和CTL的增殖和分化[37-39]，因此通過基因工程改造VLPs或用VLPs包裹免疫刺激類藥物即可實(shí)現(xiàn)多種免疫反應(yīng)協(xié)同抗腫瘤的療效.已有研究表明，展示T細(xì)胞表位的VLPs或?qū)LPs與APC刺激劑聯(lián)合使用可刺激有效的Th1細(xì)胞和CTL應(yīng)答.例如：當(dāng)噬菌體衍生的Qβ-VLP攜帶Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)的配體(如RNA或富含未甲基化CG基序的寡核苷酸(oligonucleotides rich in unmethylated CG motifs,CpGs)等)時(shí)，它們可以刺激CTL和Th1細(xì)胞應(yīng)答；但當(dāng)它們攜帶多聚谷氨酸(polyGLU)時(shí)，則無法檢測到有效的應(yīng)答[40-41].由于VLPs的特性，一些內(nèi)核富含精氨酸的VLPs(如HBcAg VLPs)在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)會(huì)聚集在核酸周圍[41]，這也為VLPs作為核酸遞送載體奠定了一定基礎(chǔ).目前，VLPs可以用于遞送不同的TLR配體，如CpGs(TLR-9配體)、polyGLU、單鏈核糖核酸(single-stranded ribonucleic acid，ssRNA)(TLR 7/8配體)或雙鏈核糖核酸(double-stranded ribonucleic acid，dsRNA)(TLR-3配體)，并且VLPs可以在這些TLR配體存在的情況下實(shí)現(xiàn)解聚和重組，解聚時(shí)大量配體被正電性的精氨酸富集末端吸引，重組后包裹進(jìn)VLPs內(nèi)部[42-46].

VLPs除了能夠引起T細(xì)胞相關(guān)的反應(yīng)外，也能夠引起B(yǎng)細(xì)胞相關(guān)的免疫反應(yīng).VLPs被認(rèn)為是一種功能強(qiáng)大的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，它能被B細(xì)胞的受體識(shí)別，并使B細(xì)胞足以獨(dú)立激活CD4+T細(xì)胞并長時(shí)間維持其功能[7,47].夏寧邵教授團(tuán)隊(duì)[48-49]應(yīng)用大腸桿菌(Escherichiacoli)原核表達(dá)系統(tǒng)研制出多種VLPs疫苗，如2012年上市的全球首個(gè)戊肝疫苗和2020年上市的人乳頭瘤病毒(HPV)疫苗(即宮頸癌疫苗)，在真核表達(dá)系統(tǒng)之外開辟了疫苗研究的新途徑.VLPs高度重復(fù)的結(jié)構(gòu)可以被多個(gè)B細(xì)胞受體(B-cell receptor，BCR)識(shí)別并向B細(xì)胞傳遞刺激信號(hào)，在引起B(yǎng)細(xì)胞免疫反應(yīng)中有很大優(yōu)勢[50-51].此外，VLPs表面可用于展示多達(dá)300～400個(gè)肽段，誘導(dǎo)抗體反應(yīng)[52].VLPs還能展示腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)蛋白，以誘導(dǎo)B細(xì)胞反應(yīng)，刺激特異性抗體的產(chǎn)生，最終提高腫瘤組織的炎癥水平，增強(qiáng)CD4+和CD8+T細(xì)胞的活性[53-54].

VLPs類似于天然病毒，通常比亞單位或重組蛋白免疫原更具免疫原性[55-56].研究發(fā)現(xiàn)VLPs可以被巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)等細(xì)胞攝取，激活固有免疫，之后大量細(xì)胞因子的釋放和抗原的交叉遞呈可以進(jìn)一步激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)[37].VLPs的球狀粗糙多凸起的表面，兼具流動(dòng)性和柔韌性，利于抗原受體結(jié)合，是被APCs有效攝取的關(guān)鍵[57].VLPs被APCs攝取加工后可以被MHC Ⅱ或MHCⅠ分子呈遞于細(xì)胞表面，同時(shí)還能刺激DCs成熟并遷移到淋巴結(jié)遞呈抗原，從而激活T細(xì)胞.此外，外來抗原一般只能由MHC Ⅱ分子遞呈[58-59]，而VLPs與其他外源抗原不同，它可在APCs內(nèi)經(jīng)歷交叉提呈，在沒有感染細(xì)胞的情況下也能有效地被MHC Ⅰ分子遞呈[60-61].因此，VLPs能有效刺激CD4+T淋巴細(xì)胞和CTL增殖.綜上，VLPs作為腫瘤疫苗具有先天優(yōu)勢，其免疫原性可以有效激活機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但是作為藥物遞送載體時(shí)往往需要通過一些手段去降低VLPs的免疫原性，使其在體內(nèi)能有效遞送藥物.

2 VLPs作為藥物遞送載體在腫瘤治療中的應(yīng)用

VLPs的粒徑有利于細(xì)胞胞吞，還兼具生物可降解性和安全性，通過基因工程或化學(xué)修飾即可對其3個(gè)不同界面(蛋白顆粒的外部、內(nèi)部和亞基之間)進(jìn)行功能化改造[39]，這使其成為理想的藥物遞送載體(圖 2).Ao等[62]利用人類免疫缺陷病毒群體特異性抗原(HIV-Gag)可自組裝成VLPs這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了融合半胱氨酸蛋白酶8(caspase 8)的Gag-CASP8融合蛋白，并與水泡性口炎病毒G糖蛋白(VSV-G)形成偽病毒Gag-CASP8-VLPs.VSV-G可介導(dǎo)顆粒有效進(jìn)入細(xì)胞，增強(qiáng)其在胞漿內(nèi)傳遞，有效地將caspase 8遞送到細(xì)胞內(nèi)部，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制乳腺腫瘤的生長.

圖2 VLPs作為藥物遞送載體在腫瘤治療中的應(yīng)用Fig.2 The application of VLPs as drug delivery carriers in tumor therapy

病毒結(jié)構(gòu)蛋白內(nèi)部常帶有對核酸具有親和性的氨基酸殘基，以實(shí)現(xiàn)更穩(wěn)定地包裹病毒遺傳物質(zhì)的作用.因此，以病毒結(jié)構(gòu)蛋白為主體的VLPs可作為基因藥物的良好載體[63].Lin等[64]使用人JC多瘤病毒(JCPyV)來源的VLPs作為基因遞送載體，將攜帶肺癌特異性自殺基因啟動(dòng)子(SP-B)和CD59特異性短發(fā)夾RNA(shRNA)的表達(dá)質(zhì)粒(pSPB-shCD59)有效地遞送到肺癌細(xì)胞內(nèi)，增強(qiáng)了補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性，并有效地抑制了肺部腫瘤的生長.本課題組已實(shí)現(xiàn)了VLPs表面氨基酸序列的靶向改造，如在VLPs表面融合表達(dá)腦靶向肽(TGN)[65]或整合素受體靶向肽(RGD)[66]，同時(shí)通過共價(jià)或非共價(jià)作用裝載治療分子，從而更有效和精準(zhǔn)地將小分子化療藥物遞送至腫瘤部位，實(shí)現(xiàn)良好的抗腫瘤療效.

VLPs作為腫瘤影像探針平臺(tái)具有一定的臨床應(yīng)用前景，多種病毒來源的VLPs診療平臺(tái)也已有多方面深入研究[67-68].如有研究者將多種光敏劑、熒光染料等裝載到酸漿斑駁病毒(PhMV)來源的VLPs內(nèi)部或修飾在VLPs表面，VLPs不僅能有效地提高熒光藥物的化學(xué)穩(wěn)定性，還能增加腫瘤細(xì)胞對藥物的攝取[69].Kines等[70]將酞菁光敏劑(IRDye 700DX)偶聯(lián)的HPV VLPs應(yīng)用于腫瘤的治療，在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)功能化VLPs(AU-011) 能夠有效抑制人源腫瘤細(xì)胞的生長，在小鼠和兔黑色素瘤皮下模型中均展示出優(yōu)異的抗腫瘤療效.Ji等[71]利用鐵蛋白納米顆粒的組裝特性，將6-羧基熒光素(FAM)標(biāo)記的FAP-α(fibroblast activation protein-α)底物肽及其對應(yīng)的猝滅劑(BHQ)分別偶聯(lián)至鐵蛋白納米顆粒，成功制備了體內(nèi)響應(yīng)納米熒光探針，用于FAP-α酶高表達(dá)的腫瘤檢測.本課題組[72]將光敏劑吲哚菁綠(ICG)包載到表面融合了RGD的乙肝病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)VLPs內(nèi)部，不但可作為熒光和光聲成像的影像探針，還利用ICG的光動(dòng)力和光熱作用實(shí)現(xiàn)了腫瘤的有效治療.

在VLPs表面用長鏈高分子進(jìn)行修飾可以起到有效延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間、降低免疫原性、增加穩(wěn)定性、增強(qiáng)滲透性和滯留(enhanced permeability and retention，EPR)效應(yīng)等作用[73].Shukla等[74]使用PEG修飾馬鈴薯X病毒(PVX)和豇豆花葉病毒(CPMV)的VLPs，以降低其免疫原性，結(jié)果表明，修飾后的VLPs在小鼠異位腫瘤部位有更高的滲透和積聚，PEG的修飾增強(qiáng)了VLPs的腫瘤歸巢和EPR效應(yīng)，使其成為有潛力的癌癥藥物遞送和成像應(yīng)用平臺(tái).

圖3 VLPs作為疫苗在腫瘤治療中的應(yīng)用Fig.3 The application of VLPs as vaccine in tumor therapy

綜上所述，由于VLPs內(nèi)部可以包裹和保護(hù)敏感化合物，外部可以進(jìn)行修飾，具有容易被修飾的優(yōu)點(diǎn)，所以VLPs作為藥物載體可以實(shí)現(xiàn)精確陣列展示大分子或負(fù)載小分子藥物.良好生物相容性和易于改造修飾的特性使VLPs發(fā)展成為一種良好的靶向藥物遞送系統(tǒng)，有助于進(jìn)一步擴(kuò)展和改進(jìn)現(xiàn)有的藥物遞送載體體系.

3 VLPs作為疫苗在腫瘤治療中的應(yīng)用

VLPs具有天然的免疫原性，以其作為腫瘤疫苗被廣泛開發(fā)和設(shè)計(jì)(圖 3).在其表面展示外源抗原的技術(shù)已被用于生產(chǎn)針對病原體的疫苗，并可有效地打破自身免疫耐受狀態(tài)，從而啟動(dòng)對功能失調(diào)蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)[75-76].疫苗接種和其他形式的免疫治療對于癌癥和慢性病的預(yù)防和臨床治療上已經(jīng)有很多應(yīng)用[75-78].通過基因工程技術(shù)，在VLPs多肽結(jié)構(gòu)單元的基因中嵌入一些功能蛋白基因片段，如將VLPs多肽結(jié)構(gòu)單元與抗原融合表達(dá)，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的腫瘤免疫治療.Zheng等[79]通過將CD274的siRNA整合到HPV16-L1蛋白中，構(gòu)建了一種基于具有免疫檢查點(diǎn)阻斷功能的納米疫苗.HPV16-L1蛋白可以激活Ⅰ型IFN介導(dǎo)的先天免疫，siRNA可有效降低免疫檢查點(diǎn)CD274的表達(dá)，從而保護(hù)T細(xì)胞的活化和增殖，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)協(xié)同治療效果.Hoopes等[80]將來源于CPMV的VLPs(CMV)與放射治療相結(jié)合用于黑色素瘤模型的治療，在放療方案中加入CMV不僅可增加腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤，而且還可以顯著提高腫瘤局部的炎癥環(huán)境，進(jìn)而放大腫瘤釋放抗原所產(chǎn)生的免疫效果，顯著抑制腫瘤生長，并且能有效抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移.

同樣地，VLPs的表面還可以與腫瘤抗原進(jìn)行融合表達(dá)，作為腫瘤疫苗進(jìn)行免疫治療.Kurg等[81]將3種不同的黑色素瘤抗原MAGEA4、MAGE10和MCAM蛋白融合在逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag蛋白中，自組裝形成VLPs，該重組抗原在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能夠被遞呈，表明攜帶重組抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag VLPs有望激活腫瘤抗原特異性免疫反應(yīng).Simons等[82]用前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP-1和PAP-2)這2種前列腺癌相關(guān)腫瘤抗原，以及前列腺癌特異性T細(xì)胞刺激物(SPAS-1) 的多肽修飾牛乳頭瘤病毒L1蛋白，與病毒上的半胱氨酸殘基形成二硫鍵，組成新型VLPs疫苗；該疫苗單獨(dú)或聯(lián)合PD1抗體治療可顯著抑制腫瘤生長，提高腫瘤組織中CD3+和CD8+T細(xì)胞浸潤，表明牛乳頭瘤VLPs是一種在轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中具有應(yīng)用潛力的疫苗載體.Palladini等[54]通過共價(jià)修飾，將完整的HER2的胞外結(jié)構(gòu)域與來源于化膿性鏈球菌(Streptococcus)的纖維連接蛋白SpyCatcher制備成融合抗原，并將融合抗原(SpyCatcher-HER2)附著到AP205噬菌體來源的VLPs表面(表面融合有SpyCatcher對應(yīng)的標(biāo)簽SpyTag)；該疫苗有效地克服了B細(xì)胞的免疫耐受，產(chǎn)生高滴度且具有治療效力的HER2抗體，有效防止HER2呈陽性的乳腺腫瘤生長，在預(yù)防和治療自發(fā)型HER2陽性腫瘤中具有重要意義.該研究結(jié)果也證實(shí)了利用VLPs平臺(tái)來開發(fā)非傳染性疾病疫苗的優(yōu)越性.

鐵蛋白納米顆粒作為藥物遞送體系被廣泛研究[83].Wang等[84]將分子膠水技術(shù)結(jié)合到鐵蛋白納米顆粒的設(shè)計(jì)中，成功制備出能夠快速展示病毒或腫瘤抗原的鐵蛋白納米疫苗平臺(tái)；該納米疫苗能夠引流至淋巴結(jié)并被DCs大量攝取，增強(qiáng)了抗原特異性免疫反應(yīng)，最終有效抑制HPV16和MC38腫瘤的生長.本課題組[85]將模式抗原雞卵白蛋白片段(OVA275-264)通過基因工程技術(shù)展示在HBc VLPs表面；OVA-HBc VLPs免疫小鼠后，其體內(nèi)能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的CTL反應(yīng).OVA-HBc VLPs作為腫瘤預(yù)防性疫苗，可顯著延緩腫瘤生長；作為治療性疫苗，在聯(lián)合低劑量紫杉醇(paclitaxel，PTX)后，展現(xiàn)出有效的抗腫瘤作用.

VLPs疫苗已在人群中廣泛接種，并經(jīng)受了時(shí)間的考驗(yàn)，具有生物安全性高、轉(zhuǎn)化潛力大的優(yōu)點(diǎn).與減毒疫苗相比，VLPs的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可進(jìn)行多功能化修飾，包括化學(xué)結(jié)合、基因重組等方法，通過與其他疾病的免疫原性分子結(jié)合即可獲得具有高免疫原性的疫苗.由于VLPs不通過感染進(jìn)入宿主細(xì)胞，并且抗載體的免疫對VLPs疫苗影響很小[86]，使其在腫瘤治療中具有樂觀的應(yīng)用前景.

4 總結(jié)與展望

基于VLPs的可修飾性、穩(wěn)定性、生產(chǎn)簡單和獨(dú)特的免疫原性，VLPs在腫瘤疫苗開發(fā)和藥物遞送領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景.一方面，VLPs的可修飾性和空腔結(jié)構(gòu)可用于抗腫瘤藥物的體內(nèi)遞送，對VLPs進(jìn)行靶向修飾可實(shí)現(xiàn)藥物的靶向富集；也可用PEG等免疫惰性物質(zhì)修飾VLPs來降低免疫原性，從而促進(jìn)藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間；VLPs通過一定的工程化改造(如插入酶響應(yīng)多肽)即可實(shí)現(xiàn)藥物在靶位置的控制釋放.另一方面，VLPs本身就具有較高的免疫原性，可引起機(jī)體的先天免疫，偶聯(lián)或包載免疫刺激物(免疫佐劑)可進(jìn)一步提高機(jī)體的炎癥水平，增強(qiáng)T細(xì)胞活化；VLPs融合腫瘤抗原后還能引發(fā)腫瘤抗原特異性免疫反應(yīng)，進(jìn)一步提高抗腫瘤療效.總而言之，嵌合型VLPs的設(shè)計(jì)在很大程度上解決了腫瘤抗原和抗癌藥物的遞送問題.VLPs是一種極其強(qiáng)大的“分子工具箱”，已經(jīng)在腫瘤治療中取得可喜的進(jìn)展，在未來的設(shè)計(jì)中應(yīng)該充分發(fā)揮VLPs目前已有的優(yōu)勢，融合更多的學(xué)科技術(shù)豐富其功能，從而加快基于VLPs的腫瘤治療的智能化、個(gè)性化發(fā)展.