效應(yīng)蛋白OhEF 2 正調(diào)控?cái)M南芥對橡膠樹白粉菌的感病性

程 度，戎 偉，梅雙雙

（1.海南大學(xué) 生命科學(xué)與藥學(xué)院，?？?570228; 2.海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228）

白粉菌（Powdery mildew）是一種專性活體寄生真菌，可以侵染多種植物，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1?2]。白粉菌與寄主相互作用的過程中，首先刺入寄主細(xì)胞壁形成吸器（haustorium），從寄主細(xì)胞內(nèi)獲取水分和營養(yǎng)物質(zhì)。同時，白粉菌通過在吸器轉(zhuǎn)錄，翻譯形成大量的效應(yīng)蛋白（Effector proteins），分泌到寄主細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)在寄主體內(nèi)的增殖和侵染[3?4]。目前，利用基因組、轉(zhuǎn)錄組測序及蛋白質(zhì)組分析，通過對大麥白粉菌（Bgh，Blumeria graminisf.sp.Hordei）、小麥白粉菌（Bgt，Blumeria graminisf.sp.tritici）、擬南芥白粉菌（Gor，Golovinomyces orontii）、葡萄白粉菌（En，Erysiphe necator）和葫蘆白粉菌（Pxa，Podosphaera xanthii）等進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)了一些潛在的效應(yīng)蛋白[5]。大麥和小麥白粉菌編碼的效應(yīng)蛋白數(shù)量最多，通常是一些小的蛋白質(zhì)，并且與已知蛋白同源性很低[6]。另外，大麥白粉菌形成的效應(yīng)蛋白N 端通常含有一個保守的結(jié)構(gòu)域：第一個氨基酸是芳香族氨基酸（酪氨酸，苯丙氨酸或色氨酸），最后一個氨基酸是半胱氨酸（Y/F/WXC）[7]。然而，雙子葉植物白粉菌編碼的效應(yīng)蛋白并不是都含有該保守結(jié)構(gòu)域[8?9]。白粉菌是專性活體寄生，無法進(jìn)行遺傳操作，因此，目前對白粉菌效應(yīng)蛋白功能的了解還非常少。最近，通過寄主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（HIGS，host-induced gene silencing），發(fā)現(xiàn)大麥白粉菌的一些效應(yīng)蛋白在刺入寄主植物和形成吸器的過程中發(fā)揮毒性功能[10]。橡膠樹白粉病是由橡膠樹白粉菌（Oidium heveae)引發(fā)的一種真菌病害，對天然橡膠的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病于1918 年在印尼爪哇首次發(fā)現(xiàn)[11?13]，迄今已遍布全球各橡膠種植區(qū)。由于橡膠樹白粉菌與橡膠樹很難進(jìn)行遺傳操作，因此嚴(yán)重阻礙了二者相互作用機(jī)理的研究。最近研究發(fā)現(xiàn)，橡膠樹白粉菌在野生型擬南芥Col-0 激發(fā)依賴于EDS1（enhanced disease susceptibility 1)和PAD4（Phytoalexin Deficient 4)的抗病反應(yīng)，推測擬南芥TIR-NB-LRR（Toll-Interleukin1 Receptor-nucleotide binding-leucine-rich repeat)類抗性基因參與了對橡膠樹白粉菌的識別過程[14]。

通過基因組和轉(zhuǎn)錄組測序分析，預(yù)測出橡膠樹白粉菌含有133 個潛在的效應(yīng)蛋白[8]，然而，這些效應(yīng)蛋白的功能還是未知的。筆者克隆了橡膠樹白粉菌潛在的效應(yīng)蛋白基因OhEF 2(Oidium heveaeeffector protein 2)，并對該效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，構(gòu)建在Col-0 背景下的OhEF 2基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果表明，過表達(dá)植株對橡膠樹白粉菌敏感性增加，并且有效降低了橡膠樹白粉菌在擬南芥上誘導(dǎo)的胼胝體沉積和致病相關(guān)基因的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和菌株植物材料：擬南芥野生型Col-0，Hevea brasiliensis73397；菌株：O.HeveaeHN1106[14]，假單胞菌DC 3000。

1.2 效應(yīng)蛋白OhEF 2 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建橡膠樹葉片古銅期接種白粉菌，8 d 后剪取葉片，利用快速通用植物RNA 提取試劑盒3.0（北京華越洋公司，產(chǎn)品編號：0416-50）提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京華越洋公司，產(chǎn)品編號：HYY871）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增OhEF 2基因的引物OhEF 2-F 和OhEF 2-R，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列：OhEF 2-F，5′-AAACTCGAGCATCCTGGTCAGAAAC GAGA-3′；OhEF 2-R，5′-AAATTCGAAGTTTCCAATAGTTTGAGCAAT-3′（Gene_id:OH_02339）[8]。利用限制性內(nèi)切酶Xho I和BstB I（NEB 公司）分別對PCR 擴(kuò)增片段和pER8[15]載體進(jìn)行酶切。T4（NEB 公司）連接酶進(jìn)行連接，測序正確后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。利用花粉管侵染方法，侵染擬南芥野生型Col-0。收取擬南芥種子，在含有潮霉素的MS 培養(yǎng)基中篩選，挑取長根的擬南芥植株，移栽土中。

1.3 植物葉片蛋白提取和蛋白質(zhì)免疫印跡生長4 周后，噴灑雌激素，剪取1 個葉片，放入1.5 mL 離心管中，加入100 μL 蛋白提取液（0.15 mol·L?1KCl，50 mmol·L?1HEPES-KOH，pH 7.5，1 mmol·L?1EDTA，1 mmol·L?1DTT，0.2% Triton-X 100，cocktail 蛋白酶抑制劑），研碎后，12 000 r·min?1，4 ℃，離心10 min，取上清，加入loading buffer，進(jìn)行SDA-PAGE 電泳[15]。

利用濕轉(zhuǎn)法在轉(zhuǎn)膜電泳槽（伯樂）中，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜液(7.58 g Tris，36 g Glycine，800 mL 甲醇，加水至4 L),電壓100 伏，電泳1 h。5%的脫脂奶粉，室溫封閉2 h，加入FLAG 抗體（sigma），室溫孵育2 h，加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠2 抗，室溫作用0.5 h，在黑暗條件下顯影、定影。

1.4 白粉菌細(xì)胞進(jìn)入率計(jì)算方法將長40 cm，寬40 cm，孔徑為50 μm 的尼龍膜接種箱置于生長5 周的擬南芥植株上方，用毛筆刷將橡膠樹白粉菌從橡膠樹葉片刷到接種箱上，白粉菌透過接種箱，均勻?yàn)⒙湓跀M南芥葉片上。橡膠樹白粉菌為橡膠樹古銅期葉片接種10 d 后的白粉菌孢子。接種1 d 后，剪取葉片，置于脫色液：體積比(乙醇︰苯酚︰水︰乳酸= 2︰1︰1︰1)中，脫色過夜。次日，于考馬斯亮藍(lán)染色液（G250，濃度為6 g·L?1乙醇溶液)中染色30 s。脫色后，顯微鏡下進(jìn)行觀察。計(jì)數(shù)橡膠樹白粉菌產(chǎn)生1 根芽管和2 根芽管的白粉菌孢子數(shù)目。利用計(jì)算公式：2 根芽管孢子數(shù)目/(1 根芽管孢子數(shù)目+2 根芽管孢子數(shù)目)，計(jì)算細(xì)胞進(jìn)入率[14]。

1.5 菌絲生長長度分析利用接種箱在擬南芥葉片接種橡膠樹白粉菌，接種2 d 后，剪取葉片，于脫色液中脫色過夜?？捡R斯亮藍(lán)染色30 s，顯微鏡觀察，利用MIE3.1 軟件測量菌絲長度[14]。

1.6 葉片發(fā)病表型觀察及分生孢子計(jì)數(shù)利用接種箱在擬南芥葉片接種橡膠樹白粉菌，接種10 d 后，觀察葉片發(fā)病癥狀并進(jìn)行拍照。剪取葉片置于脫色液中脫色過夜，考馬斯亮藍(lán)染色液中染色30 s，計(jì)數(shù)單個孢子產(chǎn)生的分生孢子數(shù)[14]。

1.7 擬南芥總RNA 提取和致病相關(guān)基因PR1 (Pathogenesis-Related Gene1)表達(dá)檢測利用接種箱在擬南芥葉片接種橡膠樹白粉菌，接種6 d 后。剪取葉片，置于遇冷的研缽中，加入液氮，研磨3 次。最后加入1 mL Invitrogen Trizol (Lot No.66223)，提取總RNA。經(jīng)DNA 酶消化后，加水溶解。利用Invitrogen RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅲ (Lot No.696045)對總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR 檢測采用SYBR Premix ExTaq Ⅱ(Lot No.AK2702)試劑，7500 ABI Real-time PCR Detection System，20 μL 反應(yīng)體系。檢測程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 5 s、退火延伸62 ℃ 40 s，40 個循環(huán)。內(nèi)參基因ACTIN 引物序列為：5′-TGGTGGAAGCACAGAAGTTG-3′；5′-GATCCATGTTTGGCTCCTTC-3′；PR1：5′-TACGCAGAACAAC TAAGAGG-3′；5′-TCGTTCACATAATTCCCACG-3′[14]。

1.8 胼胝體計(jì)數(shù)分析利用接種箱在擬南芥葉片接種橡膠樹白粉菌，接種6 d 后。將葉片置于脫色液，V水︰V甘油︰V乳酸︰V水飽和酚︰V乙醇=1︰1︰1︰1︰8，抽真空30 min，65 ℃放置60 min，10 min 搖1 次。50%酒精和水漂洗各漂洗1 次。將葉片置于染色液(0.1 g·L?1苯胺藍(lán)，150 mmol·L?1K2HPO4，pH9.5)中染色60 min。于熒光顯微鏡紫外激發(fā)光下照相。采用Image J 軟件(http://www.uhnresearch.ca/wcif)對0.1 mm2葉片面積內(nèi)的胼胝體進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個樣品共計(jì)數(shù)6 片葉片，通過Student’s t test 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,差異極顯著P<0.01,差異顯著P<0.05[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹白粉菌效應(yīng)蛋白OhEF 2 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建白粉菌通過分泌效應(yīng)蛋白到植物體內(nèi)，從而完成白粉菌的侵染過程。筆者克隆了其中的1 個效應(yīng)蛋白基因OhEF 2（Gene_id:OH_02339）[8]，該蛋白編碼543 個氨基酸，信號肽分析發(fā)現(xiàn)1～21 個氨基酸為其信號肽序列（圖1）。為了研究該效應(yīng)蛋白在植物體內(nèi)的作用機(jī)理，設(shè)計(jì)引物，去除信號肽序列，經(jīng)過PCR 擴(kuò)增、酶切后連入雌激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因載體pER8。利用潮霉素篩選，通過雌激素誘導(dǎo)和蛋白質(zhì)印跡分析后，獲得了3 個在擬南芥Col-0 背景下獨(dú)立的OhEF 2轉(zhuǎn)基因植株，分別命名為OhEF 2-1，OhEF 2-2 和OhEF 2-3（圖2A，B）。雌激素誘導(dǎo)6 d 后，與野生型植物Col-0 和空載體轉(zhuǎn)基因植株對比，并未發(fā)現(xiàn)效應(yīng)蛋白OhEF 2 可以激發(fā)擬南芥細(xì)胞壞死和發(fā)黃的表型（圖2B）。

圖1 效應(yīng)蛋白OhEF 2 信號肽序列分析Fig.1 Signal peptide analysis of effector protein OhEF 2

圖2 橡膠樹白粉菌效應(yīng)蛋白OhEF 2 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建A.效應(yīng)蛋白OhEF 2 轉(zhuǎn)基因植株表型觀察；B.效應(yīng)蛋白OhEF 2 轉(zhuǎn)基因植株蛋白表達(dá)分析。Bar=1 cm。Fig.2 The construction of Oidium heveae effector OhEF 2 transgenic plants in Arabidopsis Col-0 backgroundA.The phenotype observation of effector OhEF-2 transgenic plants; B.Protein detection of effector OhEF-2 transgenic plants.Bar=1 cm.

圖3 效應(yīng)蛋白OhEF 2 正調(diào)控?cái)M南芥對橡膠樹白粉菌的感病性A.橡膠樹白粉菌細(xì)胞進(jìn)入率測定結(jié)果；B.橡膠樹白粉菌菌絲生長測定結(jié)果；C.分生孢子計(jì)數(shù)結(jié)果。**：P<0.01。Fig.3 Effector protein OhEF 2 positively regulates the susceptibility of Arabidopsis to Oidium heveaeA.Quantitative assessment of host cell entry rates; B.Quantitative analysis of hyphal growth of O.heveae; C.The numbers of conidiospores per colony were counted at 10 dpi.**: P<0.01.

2.2 效應(yīng)蛋白OhEF 2 正調(diào)控?cái)M南芥對橡膠樹白粉菌的感病性為了進(jìn)一步研究效應(yīng)蛋白OhEF 2 在植物體內(nèi)的作用機(jī)理，在野生型Col-0，空載體轉(zhuǎn)基因植株和OhEF 2轉(zhuǎn)基因植株OhEF 2-1，OhEF 2-2 和OhEF 2-3 上分別接種橡膠樹白粉菌O.HeveaeHN1106。接種1 d 后，白粉菌細(xì)胞進(jìn)入率統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，3 個轉(zhuǎn)基因植株顯著高于野生型Col-0 和空載體轉(zhuǎn)基因植株(圖3A)，Col-0 和空載體轉(zhuǎn)基因植株白粉菌細(xì)胞進(jìn)入率約為35%,無明顯差異，3 個OhEF 2轉(zhuǎn)基因植株白粉菌細(xì)胞進(jìn)入率約為75%，與野生型植物相比，差異極顯著(P<0.01)。接種2 d 后的菌絲生長長度計(jì)算結(jié)果表明，3 個OhEF 2轉(zhuǎn)基因植株同樣顯著高于野生型Col-0 和空載體轉(zhuǎn)基因植株(圖3B)，Col-0 和空載體轉(zhuǎn)基因植株菌絲長度約為30 μm，無明顯差異，3 個OhEF 2轉(zhuǎn)基因植株菌絲長度約為90 μm，與野生型植物相比，差異極顯著(P<0.01)。接種10 d 后，3 個OhEF 2轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)典型的白粉病病斑（圖4A），野生型Col-0 和空載體轉(zhuǎn)基因植株并未出現(xiàn)白粉病病斑（圖4A），而是表現(xiàn)出葉片發(fā)黃的癥狀（圖4A）。分生孢子計(jì)數(shù)分析結(jié)果表明，橡膠樹白粉菌不能在野生型Col-0 和空載體轉(zhuǎn)基因植株上產(chǎn)生分生孢子，而在3 個OhEF 2轉(zhuǎn)基因植株上形成了大量的分生孢子（圖3C，4B）。綜上所述，效應(yīng)蛋白OhEF 2 可以明顯增強(qiáng)擬南芥對橡膠樹白粉菌感病的表型。

2.3 效應(yīng)蛋白OhEF 2 不能促進(jìn)假單胞菌DC 3000 在擬南芥上的毒性效應(yīng)蛋白OhEF 2 可以明顯提高橡膠樹白粉菌在擬南芥上的毒性，為了驗(yàn)證OhEF 2 是否也可以促進(jìn)其他病原菌的毒性，筆者在野生型擬南芥Col-0、空載體轉(zhuǎn)基因植株和OhEF 2轉(zhuǎn)基因植株OhEF 2-1，OhEF 2-2，OhEF 2-3 上接種了假單胞菌DC 3000。假單胞菌作為活體寄生病原微生物，其與寄主植物的互作機(jī)制已有比較深入的了解。分別在接種后0 d 和3 d 取樣、研磨、涂板，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，假單胞菌DC 3000 在野生型植物和空載體轉(zhuǎn)基因植株以及OhEF 2轉(zhuǎn)基因植株上并未表現(xiàn)出明顯的生長差異（圖5），結(jié)果表明，效應(yīng)蛋白OhEF 2 不能促進(jìn)假單胞菌DC 3000 的毒性。

圖4 OhEF 2 轉(zhuǎn)基因植株葉片發(fā)病癥狀及顯微觀察結(jié)果A.葉片癥狀觀察結(jié)果，Bar=5 mm；B.顯微觀察結(jié)果，Bar=200 μm。Fig.4 Symptoms and light microscopy of leaves of OhEF2 transgenic plants inoculated with Oidium heveaeA.Symptoms of WT Col-0/ Empty vector and OhEF 2 transgenic plants at 10 dpi, Bar=5 mm; B.Light microscopy images,Bar=200 μm.

2.4 蛋白OhEF 2 抑制橡膠樹白粉菌在擬南芥上激發(fā)的胼胝體沉積和PR1 基因表達(dá)效應(yīng)蛋白OhEF 2 顯著增強(qiáng)了擬南芥對橡膠樹白粉菌的感病性，推測OhEF 2 可能抑制了橡膠樹白粉菌在擬南芥上激活的抗病反應(yīng)。為了確定這一可能性，筆者在野生型Col-0、空載體轉(zhuǎn)基因植株和OhEF 2轉(zhuǎn)基因植株OhEF 2-1、OhEF 2-2、OhEF 2-3 上分別接種橡膠樹白粉菌O.HeveaeHN1106。接種6 d 后，剪取接種葉片，進(jìn)行了胼胝體沉積分析和PR1基因表達(dá)分析。結(jié)果表明，與野生型相比，橡膠樹白粉菌在3 個轉(zhuǎn)基因植株上誘導(dǎo)的胼胝體沉積(圖6A，B)和PR1基因表達(dá)(圖7)都顯著降低，表明效應(yīng)蛋白OhEF 2 有效地抑制了橡膠樹白粉菌在擬南芥上激發(fā)的抗病反應(yīng)。

圖5 假單胞菌DC 3000 細(xì)菌生長結(jié)果Fig.5 Bacterial growth of Pseudomonas syringae DC 3000

圖6 效應(yīng)蛋白OhEF 2 抑制橡膠樹白粉菌在擬南芥上激發(fā)的胼胝體沉積A.胼胝體計(jì)數(shù)結(jié)果；B.葉片顯微觀察結(jié)果。**：P<0.01。Fig.6 Effector protein OhEF 2 inhibits the callose deposition triggered by Oidium heveae in ArabidopsisA.Average number of callose deposits per microscope field of 0.1 mm2 on Col-0 and OhEF 2 transgenic plants; B.Light microscopy images.Bar=200 μm.**: P<0.01.

3 討 論

與擬南芥的相互作用過程中，橡膠樹白粉菌對擬南芥野生型Col-0 激發(fā)抗病反應(yīng)，并且這種抗病反應(yīng)依賴于EDS1 和PAD4，但并不依賴于NDR1，推測擬南芥TIR-NB-LRR 類抗性蛋白可以識別橡膠樹白粉菌的效應(yīng)蛋白，從而激活了下游的抗病信號通路[14]。筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，克隆了橡膠樹白粉菌的1 個潛在效應(yīng)蛋白基因OhEF 2，并構(gòu)建了該基因在野生型Col-0 背景下雌激素誘導(dǎo)的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。通過雌激素誘導(dǎo)后，與野生型Col-0 和空載體轉(zhuǎn)基因植株相比，OhEF 2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物并未出現(xiàn)明顯的植物葉片發(fā)黃表型，暗示著效應(yīng)蛋白OhEF 2 在植物體內(nèi)并不是發(fā)揮無毒蛋白的功能。

白粉菌作為專性活體寄生真菌，通過分泌大量的效應(yīng)蛋白到寄主細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮毒性功能，幫助白粉菌在寄主體內(nèi)的侵染和繁殖[16?17]。大麥白粉菌效應(yīng)蛋白CSEP0064 可以與植物細(xì)胞內(nèi)PR10 蛋白發(fā)生相互作用，干擾宿主細(xì)胞內(nèi)核糖體RNA 的降解，抑制植物的免疫反應(yīng)[18]。通過寄主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，發(fā)現(xiàn)白粉菌Podosphaera xanthii效應(yīng)蛋白PEC 可以抑制植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生[10]，從而促進(jìn)白粉菌的繁殖。筆者通過在野生型Col-0過表達(dá)效應(yīng)蛋白OhEF 2，發(fā)現(xiàn)效應(yīng)蛋白OhEF 2 顯著增強(qiáng)了橡膠樹白粉菌的毒性功能，并有效降低了橡膠樹白粉菌在擬南芥上激發(fā)的胼胝體沉積和PR1基因表達(dá)。胼胝體沉積在白粉菌的侵染過程中發(fā)揮非常重要的作用，在白粉菌侵染早期形成的刺入釘位置，植物細(xì)胞產(chǎn)生大量的胼胝體，從而抑制白粉菌的侵染。胼胝體合成酶基因PMR4突變后，植物對白粉菌的感病性大大增強(qiáng)[19]，表明效應(yīng)蛋白OhEF 2 可能參與了白粉菌侵染的早期階段，與胼胝體形成的相關(guān)基因發(fā)生相互作用，從而抑制了胼胝體沉積。另外，PR1基因作為效應(yīng)蛋白激發(fā)免疫信號通路ETI（Effector triggered immunity）的標(biāo)志基因[20]，暗示著效應(yīng)蛋白OhEF 2 抑制了植物抗性蛋白識別橡膠樹白粉菌后激發(fā)的免疫反應(yīng)。然而，OhEF 2 并不能促進(jìn)活體寄生假單胞菌DC 3 000 在擬南芥上的毒性，表明橡膠樹白粉菌與假單胞菌在植物體內(nèi)的毒性作用機(jī)理可能是不相同的。OhEF 2 能否促進(jìn)其他白粉菌的毒性功能，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖7 效應(yīng)蛋白OhEF 2 抑制橡膠樹白粉菌在擬南芥上激發(fā)的PR1 基因表達(dá)**：P<0.01。Fig.7 Effector protein OhEF 2 inhibits the PR1 gene expression triggered by Oidium heveae in Arabidopsis**: P<0.01.