GeneXpert MTB/RIF技術(shù)在MDR-TB及RIF耐藥性診斷中的應(yīng)用價(jià)值 ①

張 園，朱惠慧，鐘云芳

(惠州市職業(yè)病防治院醫(yī)務(wù)科，廣東 惠州 516002)

耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)是指結(jié)合病患者感染結(jié)核分枝桿菌經(jīng)體外藥物敏感性試驗(yàn)證實(shí)至少同時(shí)對(duì)異煙肼、利福平耐藥[1]。目前我國(guó)在進(jìn)行結(jié)核病防治時(shí)，所面臨的重要威脅即耐多藥肺結(jié)核的流行，相較于普通結(jié)核病，其治療難度更大，且更容易出現(xiàn)廣泛傳播。涂片與培養(yǎng)為MTB的常規(guī)檢測(cè)方法，但涂片檢測(cè)不具備較高的敏感度，而培養(yǎng)檢測(cè)需要耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間，且對(duì)于標(biāo)本內(nèi)的活菌數(shù)量有要求，可能是MTB的診治時(shí)機(jī)被延誤[2]。隨著分子生物診斷技術(shù)不斷優(yōu)化與成熟，利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(GeneXpert MTB/RIF技術(shù))在MTB診斷以及RIF耐藥性診斷中的應(yīng)用率不斷提升[3]。本次研究就選取2019-01～12我院收治的120例疑似肺結(jié)核患者，探討GeneXpert MTB/RIF技術(shù)在MDR-TB及RIF耐藥性診斷中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019-01～12我院收治的120例疑似肺結(jié)核患者，留取患者的早、中、晚痰樣本各1份，均實(shí)萋?tīng)?尼爾遜染色法(Ziehl-Neelson)處理后待玻片干燥后鏡檢，并進(jìn)行分枝桿菌分離培養(yǎng)(羅氏培養(yǎng))，培養(yǎng)出抗酸菌群再進(jìn)一步藥敏試驗(yàn)。然后再留取晨痰2份，分別用PCR法檢測(cè)結(jié)核桿菌以及開(kāi)展GeneXpert檢查。

1.2 研究方法

痰涂片鏡檢:制備痰涂片，涂片自然干燥后，放置在染色架上火焰固定，萋?tīng)?尼爾遜染色法(Ziehl-Neelson)處理后待玻片干燥后鏡檢。萋尼氏染色鏡檢結(jié)果分級(jí)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)。抗酸桿菌陰性、抗酸桿菌陽(yáng)性(1+)、抗酸桿菌陽(yáng)性(2+)、抗酸桿菌陽(yáng)性(3+)、抗酸桿菌陽(yáng)性(4+)。報(bào)告1+時(shí)至少觀察300個(gè)視野，報(bào)告2+時(shí)至少觀察100個(gè)視野，報(bào)告3+、4+時(shí)至少觀察50個(gè)視野。

分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法(羅氏培養(yǎng))與藥敏試驗(yàn)：羅氏培養(yǎng)方法為：向痰液標(biāo)本內(nèi)加入4%NaOH溶液，加入量為痰液標(biāo)本的1～2倍，震蕩均勻后靜置15min左右，采用無(wú)菌吸管向羅氏培養(yǎng)基上加入100μL混合溶液，放置在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制為37℃。比例法藥敏試驗(yàn)：對(duì)1mg/mL菌懸液進(jìn)行制備，對(duì)其進(jìn)行稀釋，使其得到有效稀釋，劑量為10～2mg/mL以及10～4mg/mL，再分別取1滿環(huán)稀釋后菌液，向含藥培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基進(jìn)行接種，放置在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制為37℃。培養(yǎng)時(shí)間為4周。培養(yǎng)完成后若耐藥百分率達(dá)到1%及以上，則為耐藥。

PCR法檢測(cè)結(jié)核桿菌：取痰標(biāo)本置于無(wú)菌密封瓶,采用胰酶消化液+NaOH處理法。加入等量胰酶消化液,置37℃水浴消化,直至痰液被完全消化為止,再加入等量1mol/L NaOH處理3～5min,混勻,取0.5mL標(biāo)本14000r/min離心10min;去上清留沉淀,以1.5mL生理鹽水洗滌,14000r/min離心10min,去上清留沉淀待檢。熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)本加入PCR反應(yīng)混合液中,離心30s后行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)：采集痰液標(biāo)本1mL放入到處理管內(nèi)，向管內(nèi)加入處理液，劑量為痰液標(biāo)本的2倍，震蕩均勻后靜置15min左右，對(duì)處理后樣液進(jìn)行吸取，吸取量為2mL，通過(guò)加樣孔將其加入到反應(yīng)盒內(nèi)，將GeneXpert 檢測(cè)儀與電腦開(kāi)啟，完成自檢后，向模塊中放入Cartridge，系統(tǒng)自行開(kāi)展檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間為2h左右。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 本組患者的診斷結(jié)果

120例患者在接受臨床影像學(xué)與實(shí)驗(yàn)室檢查后，本組患者中確診肺結(jié)核93例，診斷率為77.50%；27例患者中包括2例肺結(jié)核分枝桿菌感染患者，25例患者未檢測(cè)出MTB。

2.2 GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果

痰涂片鏡檢、分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法(羅氏培養(yǎng))與藥敏試驗(yàn)、PCR法檢測(cè)結(jié)核桿菌以及GeneXpert檢查的檢測(cè)特異度均超過(guò)90%；相較于痰涂片鏡檢，Xpert檢測(cè)具備更高的檢測(cè)敏感性(P<0.05)；分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法(羅氏培養(yǎng))與藥敏試驗(yàn)、Xpert法檢測(cè)敏感性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同檢測(cè)方法對(duì)MTB檢測(cè)的效果

2.3 3種檢測(cè)方法肺結(jié)核分枝桿菌對(duì)RIF耐藥性情況

RIF耐藥性顯示肺結(jié)核分枝桿菌的耐藥性不超過(guò)10.00%。見(jiàn)表2。將羅氏培養(yǎng)與藥敏作為金標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)出MDR-TB共8株，GeneXpert MTB/RIF技術(shù)對(duì)MDR-TB的檢出率為87.50%(7/8)。

表2 3種檢測(cè)方法肺結(jié)核分枝桿菌對(duì)RIF耐藥性情況

3 討論

肺結(jié)核為常見(jiàn)傳染性慢性疾病，致病病毒為結(jié)核分枝桿菌，肺結(jié)核患者需堅(jiān)持連續(xù)應(yīng)用抗結(jié)核藥物6～8個(gè)月，才可能使病情得到有效控制[4]。特別是對(duì)于初治涂陽(yáng)患者，若服藥不規(guī)范，則可能引發(fā)耐藥性出現(xiàn)，使疾病治療效果受影響。肺結(jié)核的致病病毒為MTB，其屬于常見(jiàn)的傳染性疾病，疾病發(fā)生后若無(wú)法得到及時(shí)診治，不僅會(huì)嚴(yán)重影響患者的身心健康，同時(shí)易造成疾病的傳播[5]。目前臨床上主要應(yīng)用涂片鏡檢與MTB培養(yǎng)對(duì)肺結(jié)核進(jìn)行診斷，涂片鏡檢操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，但不具備較高的檢出率，容易出現(xiàn)漏檢的情況，而MTB培養(yǎng)被認(rèn)為是對(duì)MTB進(jìn)行檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但其耗時(shí)長(zhǎng)，通常需8周左右[6]。MGIT液體培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)雖可使檢測(cè)時(shí)間縮短，但仍需要4周左右的檢測(cè)時(shí)間，因此可能導(dǎo)致患者的疾病治療被延誤，而GeneXpert MTB/RIF僅需2h便可獲取檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)可對(duì)RIF耐藥情況進(jìn)行判斷。GeneXpert MTB/RIF是基于半巢式實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，將rpoB基因作為靶基因，對(duì)DNA后擴(kuò)增rpoB基因的192bp片段進(jìn)行提取檢測(cè)，并且可應(yīng)用6種分子信標(biāo)對(duì)6種探針進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，其中5個(gè)重疊的分子探診可對(duì)rpoB基因的81個(gè)bp核心區(qū)進(jìn)行選擇性覆蓋，由此可用以MTB與RIF耐藥檢測(cè)[7]。

本次研究結(jié)果顯示，本組患者中確診肺結(jié)核93例，痰涂片鏡檢、分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法(羅氏培養(yǎng))與藥敏試驗(yàn)、PCR法檢測(cè)結(jié)核桿菌以及GeneXpert檢查的檢測(cè)特異度均超過(guò)90%；相較于痰涂片鏡檢，Xpert檢測(cè)具備更高的檢測(cè)敏感性(P<0.05)；分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法(羅氏培養(yǎng))與藥敏試驗(yàn)、Xpert法檢測(cè)敏感性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；RIF耐藥性顯示肺結(jié)核分枝桿菌的耐藥性不超過(guò)10.00%；將分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法(羅氏培養(yǎng))與藥敏試驗(yàn)作為金標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)出MDR-TB共8株，GeneXpert MTB/RIF技術(shù)對(duì)MDR-TB的檢出率為87.50%。表明GeneXpert MTB/RIF技術(shù)應(yīng)用于MDR-TB及RIF耐藥性檢測(cè)的效果較好，敏感性與特異性均較高，且檢測(cè)速度快[8]。

綜上所述，GeneXpert MTB/RIF技術(shù)在MDR-TB及RIF耐藥性診斷中的應(yīng)用效果確切，可作為MDR-TB檢測(cè)的主要方法。