臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠急性肝損傷修復(fù)作用的研究 ①

王 琪，柳朝陽(yáng)，張鵬霞，紀(jì)洪兵，殷佳輝，趙德陽(yáng)，岳 淵，張 濤

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯市傳染病醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有可塑性及自我更新和分化能力，目前對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞研究較多的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但骨髓獲取具有創(chuàng)傷性，經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MSCs具有多種不同來(lái)源，幾乎可以在所有的組織中找到，臍帶是一種容易獲得的組織資源，取材簡(jiǎn)便沒(méi)有創(chuàng)傷性，易于擴(kuò)增與分離培養(yǎng)[1]。長(zhǎng)期保存也具有穩(wěn)定性，在炎癥組織損傷和某些癌癥疾病中作為組織再生的主要基質(zhì)[2]。經(jīng)證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌大量具有免疫抑制作用的生物活性因子，這為異基因間充質(zhì)干細(xì)胞的治療提供了理論基礎(chǔ)[3]。本研究對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定，并通過(guò)對(duì)小鼠腹腔注射脂多糖造急性肝損傷模型，隨后腹腔注射MSCs對(duì)急性肝損傷小鼠進(jìn)行治療，從而對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)肝功能的能力進(jìn)行全面研究。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物為6周齡雄性小鼠(北京華阜康生物有限公司)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)所用的試驗(yàn)動(dòng)物由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所昌平試驗(yàn)基地提供，取3月胎齡的流產(chǎn)胎牛，選取臍帶組織放置于含雙抗的無(wú)菌PBS磷酸鹽緩沖液中待用。

1.2 主要試劑

DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，自制PBS，胎牛血清和山羊血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，雙抗(青霉素、鏈霉素)均購(gòu)買(mǎi)于北京中杉金橋。一抗購(gòu)自北京博奧森公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記兔抗小鼠，購(gòu)自北京康為試劑公司。Trizol試劑購(gòu)買(mǎi)于Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)。

1.3 方法

1.3.1 全培

DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(按說(shuō)明書(shū)配置)，胎牛血清10ng/mL，bFGF10ng/mL，EGF10ng/mL，1%丙酮酸那，1%非必須氨基酸，1%青鏈霉素(雙抗)，混勻后除菌(濾膜)放冰箱待用。

1.3.2 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

組織貼壁法培養(yǎng)胎牛臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞75%乙醇噴灑流產(chǎn)胎牛胎盤(pán)消毒，無(wú)菌條件下用高壓滅菌后的眼科鑷子和眼科剪將胎盤(pán)解剖選取臍帶組織，放入到含1%雙抗的無(wú)菌預(yù)冷PBS中,隨后轉(zhuǎn)移至紫外照射15min的無(wú)菌超凈工作臺(tái)上，將血管和其他組織剔除干凈，于PBS中反復(fù)漂洗8～10遍去除血細(xì)胞。將臍帶剪為2mm×2mm左右的組織塊, 均勻的貼在培養(yǎng)皿底面, 加入1mL的胎牛血清保持臍帶組織濕潤(rùn)與貼壁, 將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中, 放置1h后，加入3mL全培，靜止3d后每隔兩天換液一次，當(dāng)細(xì)胞爬滿皿底2/3即消化傳代。

1.3.3 免疫熒光堅(jiān)鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞

取第5代純化后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種到六孔板中，PBS沖洗兩遍后用4%多聚甲醛固定，經(jīng)TritonX-100通透山羊血清封閉后加入一抗，4℃冰箱避光孵育過(guò)夜，次日取出六孔板加入FITC標(biāo)記二抗，表面標(biāo)記物為VIM、NES、CD44、CD70、CD90和CD105。PBS洗滌,激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.3.4 動(dòng)物模型制備

準(zhǔn)備54只小鼠分為3組，每組18只小鼠隨機(jī)分為細(xì)胞移植組，對(duì)照組和損傷組，對(duì)小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)15d。腹腔注射途徑給小鼠注射10mg/kg礦物油(對(duì)照組)和10mg/kg脂多糖(損傷組和細(xì)胞移植組)。隨后給細(xì)胞移植組小鼠腹腔注射4.6×106/皿臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，選取時(shí)間節(jié)點(diǎn)為6h，24h，48h處理小鼠。

1.3.5 小鼠血清學(xué)和肝組織分析

抽取小鼠全血，低速離心機(jī)離心小鼠血液取上層血清，通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)對(duì)小鼠酶水平進(jìn)行分析，分別檢測(cè)肝功能生化指標(biāo)ALT、AST、ALP、GGT。通過(guò)蘇木精 - 伊紅(HE)染色法評(píng)估肝損傷與細(xì)胞修復(fù)作用。

2 結(jié)果

2.1 組織塊貼壁法MSCs的形態(tài)學(xué)觀察

通過(guò)顯微鏡觀察臍帶組織塊貼壁法,在第3天組織塊周?chē)坞x出細(xì)胞見(jiàn)圖1A,在分離培養(yǎng)的第10天組織塊周?chē)罎M細(xì)胞, 細(xì)胞形態(tài)多為梭形或長(zhǎng)梭形，見(jiàn)圖1B ,當(dāng)細(xì)胞貼壁率達(dá)到80%時(shí)可以消化傳代，傳代后細(xì)胞為梭形或長(zhǎng)梭形,見(jiàn)圖1C～1F。

A 、B分別為為P0第3天和第10天C、D、E、F為P1～P4

2.2 免疫熒光鑒定

通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物VIM，NES、CD44、CD73和CD105，見(jiàn)圖2，結(jié)果顯示均為陽(yáng)性表達(dá)，證明分離培養(yǎng)出的細(xì)胞確實(shí)是MSCs，可用于下一步小鼠損傷后的細(xì)胞移植治療實(shí)驗(yàn)。

(A、D、G、J為綠色熒光(FITC)胞質(zhì)染色； B、E、H、K 為 DAPI胞核染色； C、F、I、L為FITC與DAPI的疊加圖)

2.3 小鼠蘇木精 - 伊紅(HE)染色法評(píng)估和血清學(xué)檢測(cè)

2.3.1 細(xì)胞移植后小鼠肝臟切片的免疫組織化學(xué)分析：細(xì)胞移植后48h，做小鼠肝臟切片，用10%福爾馬林固定并用石蠟包埋，做肝臟的組織學(xué)分析，用蘇木精-伊紅(HE)染色評(píng)估，見(jiàn)圖3。

A為L(zhǎng)PS注射48h肝組織切片；B為細(xì)胞移植后48h肝組織切片

2.3.2 注射LPS后48h，小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的肝損傷。與未受傷的小鼠(對(duì)照組)相比，LPS腹腔注射發(fā)生肝損傷的小鼠(損傷組)對(duì)比，ALT、AST、ALP、GGT增加，急性時(shí)相反應(yīng)蛋白CRP升高。隨后將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞腹腔注射到急性肝損傷模型小鼠體內(nèi)，細(xì)胞移植后48h ALT、AST、顯著降低，ALP、GGT水平降低，CRP下降，證明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)急性肝損傷小鼠有治療能力。

3 討論

肝臟暴露于許多因素下，例如藥物、病毒，這些因素可能會(huì)導(dǎo)致肝臟病變包括慢性肝炎和肝硬化，肝硬化已成為常見(jiàn)病[4]。在大多數(shù)情況下，這些疾病會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞癌，最后導(dǎo)致器官衰竭，出現(xiàn)慢性炎癥，纖維化，并且不再具有任何再生能力,肝癌的死亡率居腫瘤第二位[5]。迄今為止，唯一有效的治療方法是肝移植，但由于供體數(shù)量有限和器官排斥，因此不能被廣泛應(yīng)用。另一種治療肝衰竭的方法是干細(xì)胞。治療肝損傷的主要干細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，可以從不同來(lái)源獲得，例如骨髓[6]、臍帶血[7]、羊水[8]、頭皮組織[9]、胎盤(pán)[10]和脂肪組織[11,12]。經(jīng)統(tǒng)計(jì)每年因肝臟疾病死亡的患者被低估，病毒性肝炎和肝膽癌引起的與肝臟有關(guān)的發(fā)病率和死亡率增加，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植后可以改善肝臟功能，這一點(diǎn)已經(jīng)通過(guò)肝臟組織切片及血清學(xué)檢測(cè)數(shù)值的變化得到證實(shí)。證明臍帶間存在干細(xì)胞移植可能在肝病動(dòng)物模型和肝病治療的臨床環(huán)境中具有廣泛的治療功效，對(duì)建立干細(xì)胞移植具有重要意義。