L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs對(duì)ANFH兔骨陷窩與血管和骨密度影響的實(shí)驗(yàn)研究 ①

季慶輝,薛 宇,顏 玉,薛 勇,喬曉峰,喬建民

(佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154003)

股骨頭(caput femoris)是上部覆蓋關(guān)節(jié)軟骨2/3圓球的圓形，股骨頭上部稍后有一圓形窩稱(chēng)為股骨頭凹，其內(nèi)附著股骨頭韌帶，股骨頭可以從此處韌帶動(dòng)脈血管(股內(nèi)側(cè)、旋股外側(cè)、閉孔、臀上、臀下、髂腰)獲得血供[1]。股骨頭由于外傷及應(yīng)用皮質(zhì)類(lèi)固醇和酗酒引起血供不足或中斷形成股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head，ANFH)，它是骨外科致殘率很高常見(jiàn)病，常用治療包括：①人工關(guān)節(jié)置換術(shù)、②非手術(shù)治療、③保髖手術(shù)治療、④介入治療四種常用方法進(jìn)行治療股骨頭缺血性壞死(ANFH)[2]。

富白細(xì)胞-富血小板纖維蛋白 (Leukocyte-and platelet-rich fibrin，L-PRF) 凝膠是靜脈采集自體全血，通過(guò)無(wú)外源性添加劑離心濃縮制備而成[3]。富血小板含有大量生長(zhǎng)因子，當(dāng)激活時(shí)可以釋放出來(lái)，生長(zhǎng)因子具有促進(jìn)骨和成骨細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化和組織形成作用。L-PRF凝膠是富含兩種自體(白細(xì)胞和富血小板)物質(zhì)纖維生物材料，可以避免三種(免疫排斥、交叉感染、凝血功能障礙)風(fēng)險(xiǎn)出現(xiàn)，激活血小板與纖維蛋白生理性聚合，纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)富有彈性，細(xì)胞因子可以相對(duì)持久的釋放，因?yàn)長(zhǎng)-PRF凝膠與生物體生理狀態(tài)相似，所以能最大限度發(fā)揮組織促進(jìn)再生、愈合、修復(fù)作用[4]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)是骨髓成體干細(xì)胞參與造血微環(huán)境構(gòu)成，具有①多向分化、②低免疫原性、③取材方便、④擴(kuò)增迅速、⑤遺傳穩(wěn)定等五方面主要特點(diǎn)[5]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)可以在①組織工程、②細(xì)胞、③基因治療等方面進(jìn)行應(yīng)用，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCS)結(jié)合纖維蛋白可以促進(jìn)骨再生修復(fù)骨缺損[6]。

L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs對(duì)ANFH兔骨陷窩與血管和骨密度影響實(shí)驗(yàn)研究，主要研究探索L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs對(duì)ANFH兔骨陷窩與血管和骨密度影響，L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs的臨床治療ANFH提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大白兔正常健康24只, 1/2雌雄，4 月齡，體重(2600±200)g,佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供新西蘭大白兔[7]。

1．2 試劑與實(shí)驗(yàn)儀器

1．2．1 主要試劑。無(wú)水乙醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，25%戊二醛(山東富山東浩中化工科技有限公司)，乙酸異戊酯(天津市南金化工有限公司)，20%甲酸溶液(上海樊克生物科技有限公司)，DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基(上海源葉生物科技有限公司)，四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)，胰蛋白酶(上海第一生化藥業(yè)有限公司)，牛凝血酶(上海欣百諾生物科技有限公司)，脂多糖/LPS(大腸桿菌內(nèi)毒素(lipopolysaccharides)，美國(guó) SIGMA)，甲基強(qiáng)的松龍(Methylprednisolone)(普強(qiáng)蘇州制藥有限公司)[8]。

1．2．2 實(shí)驗(yàn)儀器。常溫高速離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)，低溫高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，SJ-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)(蘇潔醫(yī)療器械(蘇州)有限公司)，-15～-50℃HX-SD6急速冷凍冰箱(東莞市昊昕?jī)x器設(shè)備有限公司)，NIKON科研顯微鏡 Eclipse Ci-E/Ci-L/Ci-S(日本，NIKON)，12號(hào)骨髓穿刺針(深圳豐都金屬材料有限公司[9]。

1．3 L-PRF凝膠制備

正常健康新西蘭大白兔后肢脛部皮下靜脈處采血10mL、置于離心管(無(wú)菌)中、2500rpm/min(978×g)10min離心、靜置10min取淡黃色中間層、無(wú)菌紗布吸取血清、粗制L-PRF 、無(wú)菌容器靜置10min、無(wú)菌紗布包裹輕輕擠壓殘存血清、靜置5min、L-PRF凝膠[10]。

1．4 BMSCs分離培養(yǎng)

在健康正常新西蘭大白兔雙側(cè)髂后上棘處用12號(hào)骨髓穿刺針抽取骨髓5mL、放入DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基制成懸液、收集培養(yǎng)基中細(xì)胞加入2倍PBS(磷酸緩沖鹽溶液)混勻、1500rpm/min,20min離心、離心分層取中間層云霧狀細(xì)胞、10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿、100mL/L胎牛血清培養(yǎng)液、接種2×105云霧狀細(xì)胞、取貼壁純化細(xì)胞、分離純化BMSCS細(xì)胞液、稀釋1×106/mL BMSCS細(xì)胞液備用[11]。

1．5 ANFH兔模型制備

健康新西蘭大白兔、第一次經(jīng)兔耳緣靜脈注射10μg/kg大腸桿菌內(nèi)毒素(lipopolysaccharides)、間隔24h、第二次經(jīng)兔耳緣靜脈注射10ug/kg大腸桿菌內(nèi)毒素(lipopolysaccharides)、然后兔部臀肌肉注射40mg/kg甲基強(qiáng)的松龍(Methylprednisolone)、共3次、間隔24h/1次、42d X線檢查確定模型制備完成[12]。

1．6 ANFH兔股骨頭檢查

1．6．1 MRI 檢查ANFH兔股骨頭。L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs等各處理兔常規(guī)麻醉、仰臥位，屈曲(上、下)肢且固定、兔股骨頭置MRI檢查線圈中心、各處理分別進(jìn)行MRI掃描檢查、T2 WI出現(xiàn)(點(diǎn)、片、線)狀高信號(hào)、T1 WI 出現(xiàn)(點(diǎn)、片、線)狀低信號(hào)、得出相關(guān)數(shù)據(jù)。

1．6．2 定量CT(QCT)檢查ANFH兔股骨頭。L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs等各處理兔常規(guī)麻醉、仰臥位，屈曲(上、下)肢且固定標(biāo)準(zhǔn)件上、對(duì)其股骨頭中心定位掃描、測(cè)量股骨頭骨質(zhì)疏松CT值、計(jì)算骨密度(BMD[13]。

1．7 組織學(xué)檢查

1．7．1 光學(xué)顯微鏡組織學(xué)檢查

MRI檢查后、L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs等各處理兔常規(guī)處死、雙側(cè)股骨頭取材標(biāo)本、常規(guī)石蠟包埋切片、蘇木精-伊紅染色、光學(xué)顯微鏡高倍鏡(10×40)、5個(gè)高倍視野、計(jì)數(shù)50個(gè)骨陷窩占百分?jǐn)?shù)、計(jì)血管數(shù)目求平均值、數(shù)碼相機(jī)拍照[14]。

1．7．2 掃描電子顯微鏡組織學(xué)檢查

MRI檢查后、L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs等各處理兔常規(guī)處死、雙側(cè)股骨頭取材標(biāo)本、3% 戊二醛固定與脫鈣、環(huán)氧樹(shù)酯包埋切片、觀察骨細(xì)胞。

1．8 L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs對(duì)ANFH兔骨陷窩與血管和骨密度影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及修復(fù)方法

新西蘭大白兔正常健康24只, 1/2雌雄，4 月齡，體重(2600±200)g，均造雙側(cè)ANFH 模型后隨機(jī)分為A、B、C、D 4組(各6只)，然后進(jìn)行移植修復(fù)。A：對(duì)照組，只進(jìn)行髓芯減壓；B：L-PRF組，髓芯減壓結(jié)合50μg L-PRF凝膠移植同時(shí)進(jìn)行；C：BMSCs組，髓芯減壓結(jié)合50μL 1×106/mL BMSCS細(xì)胞液移植同時(shí)進(jìn)行；D：L-PRF+ BMSCs聯(lián)合組，髓芯減壓結(jié)合50 μg L-PRF凝膠+50 μL 1×106/mL BMSCS細(xì)胞液移植同時(shí)進(jìn)行[15]。

1．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2．1 L-PRF凝膠聯(lián)合BMSCs對(duì)ANFH兔各組組織學(xué)觀察

通過(guò)NIKON科研顯微鏡 Eclipse Ci-E/Ci-L/Ci-S進(jìn)行組織學(xué)觀察，L-PRF凝膠聯(lián)合BMSCs對(duì)ANFH兔各組組織學(xué)觀察情況，見(jiàn)表1。

表1 L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs對(duì)ANFH兔各組組織學(xué)觀察

2.2 L-PRF凝膠聯(lián)合BMSCs對(duì)ANFH兔空缺骨陷窩百分比影響

L-PRF凝膠聯(lián)合BMSCs對(duì)ANFH兔各組移植處理28d、56d，空骨陷窩觀察及統(tǒng)計(jì)情況如下：移植處理28d：A組：空骨陷窩較多，B組：空骨陷窩與A組相比要少些，C 組：空骨陷窩較少，D 組：空骨陷窩較C 組更少；移植處理56d：A組：空骨陷窩較多，B組：空骨陷窩較A組少，C 組：空骨陷窩稀少，D 組：空骨陷窩與C 組相比更稀少。

各組移植處理統(tǒng)計(jì)情況如下：移植處理28d、56d，D 組：空缺骨陷窩百分比明顯低于A 、B 和C 組3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。L-PRF凝膠聯(lián)合BMSCs對(duì)ANFH兔空缺骨陷窩百分比影響見(jiàn)表2。

表2 L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs對(duì)ANFH兔空缺骨陷窩百分比影響

2.3 L-PRF凝膠聯(lián)合BMSCs對(duì)ANFH兔血管密度影響

L-PRF凝膠聯(lián)合BMSCs對(duì)ANFH兔各組移植處理28d、56d，股骨頭壞死區(qū)新生血管計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)情況如下：移植處理28d、56d，C、D 組：股骨頭壞死區(qū)新生血管數(shù)明顯高于A、B組，B組：股骨頭壞死區(qū)新生血管數(shù)多于A 組，D 組：股骨頭壞死區(qū)新生血管數(shù)明顯高于C組，各組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs對(duì)ANFH兔血管密度影響見(jiàn)表3。

表3 L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs對(duì)ANFH兔血管密度影響

2.4 L-PRF凝膠聯(lián)合BMSCs對(duì)ANFH兔骨密度影響

L-PRF凝膠聯(lián)合BMSCs對(duì)ANFH兔各組移植處理28d、56d，股骨頭骨密度測(cè)量統(tǒng)計(jì)情況如下：移植處理28d、56d，B 組與A 組和D 組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs對(duì)ANFH兔骨密度影響見(jiàn)表4。

表4 L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs對(duì)ANFH兔骨密度影響

3 討論

股骨是人體骨骼中最重要部分之一，股骨頭作用非常重要，人的股骨頭幾方面作用：①直立、②行走、③活動(dòng)、④勞動(dòng)等方面均需要股骨頭起到的支撐作用。因?yàn)楣晒穷^幾方面起到的支撐作用都要有力度和是支點(diǎn)，所以股骨頭也是骨骼中最容易受傷部位。股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head， ANFH)最常見(jiàn)癥狀：(1)疼痛。部位：①髖關(guān)節(jié)、②大腿近側(cè)、③膝部，可放射至膝部。(2)疼痛分類(lèi)：①持續(xù)痛、②靜息痛。(3)其它疼痛：①骨塌陷致創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎、②髖關(guān)節(jié)肌肉韌帶附著部位慢性損傷性疼痛。(4)髖部活動(dòng)受影響：①旋轉(zhuǎn)活動(dòng)、②痛性、③短縮性跛行。如果發(fā)生股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head， ANFH)也對(duì)人身心影響最大，是骨科的多發(fā)和常見(jiàn)病，相比較骨科其它疾病其致殘率很高。

富白細(xì)胞-富血小板纖維蛋白 (Leukocyte-and platelet-rich fibrin，L-PRF)凝膠是自體富血小板與白細(xì)胞第二代纖維生物濃縮制品。L-PRF凝膠制備過(guò)程沒(méi)有添加任何外源性物，可以避免三種(免疫排斥、交叉感染、凝血功能障礙)風(fēng)險(xiǎn)出現(xiàn)，因?yàn)長(zhǎng)-PRF纖維蛋白具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，所以其含有細(xì)胞因子釋放持久更好滿(mǎn)足臨床需求，L-PRF與生物體生理狀態(tài)相似，使用中具有極高安全性，臨床方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)生物體中骨髓含量極少，主要存在生物體①器官間質(zhì)和結(jié)締組織，數(shù)量與年齡增加呈反比。其培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便，另外體外增殖迅速，因?yàn)锽MSCs可以進(jìn)行冷凍保存，所以現(xiàn)在細(xì)胞及基因治療中已成為種子細(xì)胞，臨床方面具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值[16]。

實(shí)驗(yàn)研究L-PRF凝膠聯(lián)合BMSCs對(duì)ANFH兔各組移植處理28d、56d，D組：空缺骨陷窩百分比明顯低于A 、B和C組3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

實(shí)驗(yàn)研究L-PRF凝膠聯(lián)合BMSCs對(duì)ANFH兔各組移植處理28d、56d，股骨頭壞死區(qū)新生血管計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)情況如下：移植處理28d、56d，C、D組：股骨頭壞死區(qū)新生血管數(shù)明顯高于A、B組，B組：股骨頭壞死區(qū)新生血管數(shù)多于A 組，D組：股骨頭壞死區(qū)新生血管數(shù)明顯高于C組，各組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

實(shí)驗(yàn)研究L-PRF凝膠聯(lián)合BMSCs對(duì)ANFH兔各組移植處理28d、56d，股骨頭骨密度測(cè)量統(tǒng)計(jì)情況如下：移植處理28d、56d，B 組與A 組和D組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)L-PRF凝膠結(jié)合BMSCs對(duì)ANFH兔骨陷窩與血管和骨密度影響實(shí)驗(yàn)研究，B：L-PRF組，髓芯減壓結(jié)合50μg L-PRF凝膠移植同時(shí)進(jìn)行；C：BMSCs組，髓芯減壓結(jié)合50μL 1×106/mL BMSCS細(xì)胞液移植同時(shí)進(jìn)行；D：L-PRF+ BMSCs聯(lián)合組，髓芯減壓結(jié)合50μg L-PRF凝膠+50μL 1×106/mL BMSCS細(xì)胞液移植同時(shí)進(jìn)行均有效果，其中以L-PRF+ BMSCs聯(lián)合效果最佳。