左乙拉西坦對難治性癲癇幼鼠海馬組織中Slit2、srGAP2 和GAP-43動態(tài)表達(dá)的影響 ①

王 影，張 洋，劉潔微，趙塔娜，鄒艷紅，聶 磊

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，黑龍江 佳木斯 154003)

癲癇作為一種常見的大腦功能短暫性障礙慢性疾病，其主要是由于人體大腦神經(jīng)元出現(xiàn)突發(fā)性放電而引起的。該病會導(dǎo)致人體出現(xiàn)發(fā)作性意識喪失，部分患者常合并認(rèn)知功能障礙。目前，臨床上關(guān)于癲癇的具體發(fā)病原因尚未完全明晰[1,2]。雖然傳統(tǒng)的抗癲癇治療方法能夠取得一定的療效，但是其副作用比較大，很容易引起患者出現(xiàn)認(rèn)知功能損傷[3]。對于難治性癲癇而言，一種標(biāo)志性的病理學(xué)改變就是海馬組織硬化[4]。因此，對海馬組織中的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測，能夠為臨床治療療效判定提供一定的依據(jù)。本研究選擇難治性癲癇幼鼠作為研究對象，探討了左乙拉西坦(Levetiracetam，LEV)對難治性癲癇幼鼠海馬組織中神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子2(Axon guidance factor 2，Slit2)、再生修復(fù)關(guān)鍵分子2(Key molecules for regeneration and repair 2，srGAP2)、生長相關(guān)蛋白43(Growth associated protein43，GAP-43)。動態(tài)表達(dá)的影響，旨在為探討左乙拉西坦治療難治性癲癇的效果提供一定的參考依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇我院動物醫(yī)學(xué)中心培養(yǎng)的192只清潔級Wistar大鼠作為研究對象，體重為190～230g，平均(210.09±12.12)g；將其稱重編號之后，隨機分為空白對照組、模型組(IE組)、治療組(LEV治療組)及LEV對照組，各48只。

1.2 癲癇模型構(gòu)造方法

采用氯化鋰-匹羅卡品(Licl-pilo)點燃的難治性癲癇大鼠模型96只，將96只大鼠分為IE組、LEV治療組，首先腹腔注射質(zhì)量濃度為135mg/kg的氯化鋰，18～20h之后與1mg/kg阿托品腹腔注射，30min后再腹腔注射20mg/kg的匹羅卡品，對大鼠行為進(jìn)行觀察。行為學(xué)觀察根據(jù)Racine癲癇行為進(jìn)行分級，即：(1)0級。抽搐癥狀完全停止；(2)1級。嘴與面部發(fā)生節(jié)律性抽動；(3)2級。出現(xiàn)點頭或者甩尾；(4)3級。單側(cè)肢體出現(xiàn)抽動；(5)4級。全面性強制陣攣發(fā)作甚至不自主跌倒。出現(xiàn)4級及以上發(fā)作即可視為造模成功。持續(xù)抽搐30min即可腹腔注射濃度為10%的水合氯醛0.3g/kg止痙，使得死亡率顯著下降。如果發(fā)作程度無法達(dá)到上述等級，于30min之后再次給予未達(dá)到等級的大鼠腹腔注射20mg/kg的匹羅卡品，直至達(dá)到發(fā)作等級。(空白對照組及LEV對照組為正常大鼠、不予處理)。

1.3 給藥處理

將LEV片劑碾碎，然后將其溶于經(jīng)消毒的注射用水之中，給予LEV治療組與LEV對照組每日一次灌胃，劑量為200mg/kg，連續(xù)灌胃4周，同時給予對照組與IE組同等劑量的濃度為0.9%的生理鹽水灌胃。

1.4 組織取材

造模成功后的1周、2周、4周，每組隨機抽取8只大鼠，10%的水合氯醛麻醉之后斷頭，剪開大鼠的顱骨取出大腦，將大腦的海馬組織分離放入濃度為4%的多聚甲醛溶液加以固定。

1.5 組織的石蠟包埋與切片

將大鼠海馬組織從甲醛溶液取出之后，置于20%的蔗糖融合(4℃)中過夜。在模具中加入液態(tài)石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的海馬組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，最后加入少許液體石蠟，進(jìn)行冷凍，使石蠟變成固態(tài)。將包埋好的組織置于石蠟切片機上，切成厚度約為4.0μm的切片進(jìn)行免疫組化染色。

1.6 免疫組化法染色

1.6.1 脫蠟水化: 脫蠟之前將組織置于60℃恒溫箱之中烘烤20min，將石蠟切片放入二甲苯I與II中10min進(jìn)行脫蠟，脫蠟之后放入100%的乙醇5min，95%乙醇5min，90%乙醇5min，85%乙醇5min，80%乙醇5min，75%乙醇5min，60%乙醇5min，50%乙醇5min，30%乙醇5min，自來水1min，雙氧水1min。

1.6.2 抗原修復(fù): 加入3%的H2O2浸泡10min，從而除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫。

1.6.3 血清封閉: 滴加正常善養(yǎng)血清封閉液室溫20min，甩去多余液體，吸水紙吸取多余水分。

1.6.4 滴加一抗: 滴入稀釋的一抗，于4℃下過夜。

1.6.5 滴加二抗: 將載玻片放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS溶液后加上二抗，然后置于37℃溫箱中保存30min。

1.6.6 加顯示劑: 擦干組織周圍的PBS之后加入DAB顯色劑顯色5min，于顯微鏡下觀察掌握染色的程度，若存在棕黃色的沉淀，則使用流水沖洗。

1.6.7 復(fù)染: 將顯色后的片子使用清水沖洗一段時間之后，浸泡于蘇木精中進(jìn)行染色，約為0.5min，清水沖洗2min。

1.6.8 脫水: 將復(fù)染之后的片子置于水中進(jìn)行沖洗之后，依次將載玻片放入95%酒精5min，95%酒精5min，100%酒精5min，100%酒精5min，100%酒精5min，二甲苯中5min。充分晾干之后中性樹膠封片。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 臨床療效[5](1)完全控制：無癲癇發(fā)作；(2)顯效：與治療前比較，癲癇發(fā)作頻次減少程度在75%以上；(3)有效：與治療前比較，癲癇發(fā)作頻次減少范圍在50%～74%；(4)無效：與治療前比較，癲癇發(fā)作頻次降低范圍在49%以內(nèi)。

1.7.2 免疫指標(biāo)變化： 比較LEV治療組與LEV對照組免疫指標(biāo)(IgA、IgG及IgM)水平，均采用ELISA法進(jìn)行檢測分析。

1.7.3 比較各組海馬組織Slit2陽性細(xì)胞數(shù)、srGAP2、GAP-43表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LEV治療組與LEV對照組臨床療效對比

LEV治療組總有效率為89.58%，顯著高于對照組72.92%(P<0.05)，見表1。

表1 LEV治療組與LEV對照組臨床療效比較[n=48,n(%)]

2.2 LEV治療組與LEV對照組免疫指標(biāo)水平對比

兩組大鼠治療后免疫指標(biāo)(IgA、IgG及IgM)水平較治療前均顯著升高，且LEV治療組上述指標(biāo)水平也均分別顯著高于LEV對照組治療后(P均<0.05)，見表2。

表2 LEV治療組與LEV對照組免疫指標(biāo)水平比較

2.3 各組大鼠海馬組織Slit2陽性細(xì)胞數(shù)對比

LEV對照組與對照組各個時間點的Slit2陽性細(xì)胞數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，但I(xiàn)E組及LEV治療組各個時間點的Slit2陽性細(xì)胞數(shù)均分別顯著低于對照組(P均<0.05)，LEV治療組各個時間點的Slit2陽性細(xì)胞數(shù)均分別顯著高于IE組(P均<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠海馬組織Slit2陽性細(xì)胞數(shù)比較個/高倍視野×100)

2.4 各組大鼠海馬組織srGAP2蛋白相對表達(dá)量對比

LEV對照組與對照組各個時間點的srGAP2蛋白相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，但I(xiàn)E組及LEV治療組各個時間點的srGAP2蛋白相對表達(dá)量均分別顯著低于對照組(P均<0.05)，LEV治療組各個時間點的srGAP2蛋白相對表達(dá)量均分別顯著高于IE組(P均<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠海馬組織srGAP2蛋白相對表達(dá)量比較

2.5 各組大鼠海馬組織GAP-43免疫組化染色強度對比

LEV對照組與對照組各個時間點的GAP-43免疫組化染色強度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，但I(xiàn)E組及LEV治療組各個時間點的GAP-43免疫組化染色強度均分別顯著低于對照組(P均<0.05)，LEV治療組各個時間點的GAP-43免疫組化染色強度均分別顯著高于IE組(P均<0.05)，見表5。

表5 各組大鼠海馬組織GAP-43免疫組化染色強度比較

3 討論

癲癇是兒童時期非常常見的一種神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，對兒童身心健康造成十分嚴(yán)重的影響。如果發(fā)展為難治性癲癇(Refractory status epilepticus，RSE)，那么其病死率可高達(dá)16%以上[6,7]，對患兒自身、家庭乃至整個社會均會造成非常嚴(yán)重的后果。Slits家族在神經(jīng)軸突導(dǎo)向以及神經(jīng)細(xì)胞線，甚至還存在一些軸突連接會反復(fù)跨越中線。在對小鼠、雞體外培養(yǎng)試驗研究表明：Slits會排斥神經(jīng)元軸突，有效確保神經(jīng)元軸突僅跨越中線1次，準(zhǔn)確無誤地達(dá)到既定的位置，對軸突反復(fù)跨越中線產(chǎn)生異常的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有有效地阻止效果。Fang[8]等通過基礎(chǔ)試驗研究證實：在動物造模1d～2周，大鼠海馬組織中的Slit2的陽性細(xì)胞數(shù)會持續(xù)性下降，并認(rèn)為：Slit2的表達(dá)變化主要是對神經(jīng)元癇性放電的一種適應(yīng)性改變，而且也表明Slit2表達(dá)水平下降后可能會加快游走性局灶性發(fā)作(Migrating focal seizures,MFS)的發(fā)作，對神經(jīng)的正常連接產(chǎn)生較大的干擾作用，參與了難治性癲癇的發(fā)病過程。

LEV屬于吡咯烷類衍生物的一種常見藥物，患者在服用之后，其吸收快速、生物利用效率高、血漿蛋白結(jié)合率低[9]。相關(guān)文獻(xiàn)報道稱[10,11]，LEV治療癲癇的主要作用機制在于其與中樞神經(jīng)內(nèi)突觸囊泡蛋白(Synaptic vesicle protein in central nervous system，SV2A)相結(jié)合，從而對突觸內(nèi)囊泡的胞外分泌功能以及突出前神經(jīng)遞質(zhì)釋放具有調(diào)節(jié)作用。大量臨床研究證實[12,13]：左乙拉西坦能夠有效治療難治性癲癇。本研究結(jié)果顯示：LEV治療組與IE組比較，Slit2的陽性細(xì)胞數(shù)顯著上升，結(jié)合Slit2與難治性癲癇發(fā)病之間的密切聯(lián)系，由此可以推斷LEV治療難治性癲癇的可能機制為：其可通過升高Slit2表達(dá)水平，對大鼠海馬組織苔蘚纖維化過程具有逆轉(zhuǎn)或阻止效果，從而可有效抑制異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成過程，使得難治性癲癇發(fā)作的敏感度有效降低，進(jìn)而有效防范難治性癲癇的發(fā)生、進(jìn)展。聶磊等[14]研究發(fā)現(xiàn)：左乙拉西坦治療難治性癲癇大鼠療效顯著，且可有效改善大鼠海馬組織中的Slit2表達(dá)水平。

臨床關(guān)于srGAP2表達(dá)水平與難治性癲癇疾病的發(fā)生之間的研究較少，但有研究者通過分析面神經(jīng)橫斷后初期srGAP2mRNA可以得知，其在3d～4周之內(nèi)表達(dá)水平會迅速升高，表明srGAP2在軸突再生過程中扮演著十分重要的角色[15]。此外，還有研究表明：srGAP2在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)展過程中起到十分重要的作用[16,17]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)：GAP-43參與了軸突損傷后的再生過程[18]。既往研究結(jié)果顯示：GAP-43在Wistar大鼠大腦海馬組織中的表達(dá)水平會上升，原因可能為該組織突觸結(jié)構(gòu)的可塑性處于高位水平[19]。Caprini[20]研究結(jié)果顯示：GAP-43可以誘導(dǎo)人后根神經(jīng)內(nèi)Ca2+濃度升高，而臨床上常將細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升作為癲癇大鼠模型細(xì)胞凋亡的一個重要標(biāo)志性指標(biāo)，因此，認(rèn)為GAP-43可能會對癲癇的發(fā)作具有促進(jìn)效果。

綜上所述，LEV對難治性癲癇幼鼠療效較為理想，可能是通過調(diào)節(jié)鼠馬組織中Slit2 、srGAP2 和GAP-43動態(tài)表達(dá)水平而發(fā)揮效果。