腎靶向黃芩苷-溶菌酶的制備及對糖尿病腎病大鼠的藥效學(xué)初步研究 ①

王耀坤，王芳芳，張慧明，鄭小鵬，陳 光，楊克科

(1.佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)部，黑龍江 佳木斯 154007；2. 臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 臺州 318000；3. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是DM常見且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，無特效療法[2,3]，尋找有效的治療策略迫在眉睫。中藥具有潛在的DN治療優(yōu)勢[4,5]，黃芩苷(baicalin, BAI)是中藥黃芩的生物活性提取物，對免疫、心血管、泌尿和神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，并且具有清除各種自由基、抗氧化和抗炎的生理效能，可用于治療DN[6,7]。靶向制劑又叫做靶向給藥系統(tǒng)(Targeting drug delivery sstem,TDDS)，其主要作用是通過合適的載體攜帶藥物集中于目的病變部位(靶部位)，靶部位包括靶器官、靶組織、靶細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的某個靶點(diǎn)。溶菌酶是一種堿性球蛋白，因其分子量低、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)受到人們的重視。在腎靶向前體藥物載體選擇過程中，又發(fā)現(xiàn)溶菌酶合成容易、無毒、抗菌，尤其是成本低則成為最佳的選擇[8,9]。因此本課題選取黃芩苷為模型藥，溶菌酶為載體，設(shè)計(jì)并合成了黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物，以腎近端小管細(xì)胞為靶部位，目標(biāo)是改變原藥體內(nèi)分布特點(diǎn)，以提高原藥在腎臟的濃度，同時減小原藥全身毒副作用，尤其對生殖系統(tǒng)和肝臟毒性的目的，以期為糖尿病腎病的有效治療提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和試劑

黃芩苷由中藥標(biāo)準(zhǔn)對照品研究所提供；溶菌酶由山東康勤生物有限公司提供；乙腈、硼酸、四硼酸鈉、均購于天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；葡聚糖凝膠G-25購于上海生化試劑撫生有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)由上海共價化學(xué)科技有限公司提供；1-羥基苯并三唑(HOBT)由無錫邁拓生物科技有限公司提供；鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)購于美國Sigma公司；檸檬酸鈉和檸檬酸購于武漢博士德生物技術(shù)公司；紫外-可見分光光度計(jì)(UV-2550)；傅立葉紅外光譜儀(VERTEX 70)；血糖儀和血糖試紙。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物的制備

精密稱量溶菌酶 0.1001g，將其溶解于5mL 0.1mol/L的冷硼酸鹽緩沖液中(pH=7.99)。稱取黃芩苷 0.0999 g，EDC·HCl 0.1000 g和1-羥基苯并三唑(HOBT) 0.0501g分散在2.2mL乙腈中，快速攪拌，使之分散均勻。將該渾濁液加入到溶菌酶的硼酸鹽緩沖液中，快速攪拌，0℃反應(yīng)18 h后，過濾。葡聚糖凝膠G-25過濾所得澄清溶液除去未反應(yīng)的黃芩苷。溶液冷凍干燥后可見黃色疏松粉末，低溫保存。

1.2.2 黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物的表征

1.2.2.1 紫外-可見吸收光譜

將溶菌酶、黃芩苷和黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物溶于甲醇中，配成1mg/mL的溶液，放入紫外-可見吸收光譜的專用比色皿中進(jìn)行測試。

1.2.2.2 紅外光譜

將溶菌酶、黃芩苷和黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物分別與紅外光譜專用KBr晶體以 1:100 ～ 1:200的比例進(jìn)行混合研磨，最后分別壓成透明薄片進(jìn)行紅外光譜測試。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動物分組、造模和藥物處理

雄性的清潔級SD大鼠(180～220g)50只，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(動物許可證號SYXK(黑)2016-014)提供。本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分組為：正常對照組(Con，7只)，糖尿病腎病模型組(DN，13只)，糖尿病腎病模型黃芩苷治療組(BAI，14只)和糖尿病腎病模型黃芩苷-溶菌酶治療組(BAI-LZM，13只)。STZ 65mg/kg腹腔注射進(jìn)行造模，72 h后尾靜脈行血糖儀檢測大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下(禁食 ≥ 8h)血糖值，連續(xù)3d檢測大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下血糖值均≥16.7mmol/L確定糖尿病造模成功。

造模成功后，黃芩苷治療組給予黃芩苷160mg/kg·d灌胃，黃芩苷-溶菌酶治療組給予160mg/kg·d黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物灌胃，正常對照組給予腹腔注射等劑量的檸檬酸緩沖溶液，8周后處死。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 一般指標(biāo)監(jiān)測: 正常記錄各組大鼠飲食和飲水量，隨時觀察其精神狀態(tài)及毛色變化，每周固定時間監(jiān)測血糖/體重變化。采用尾靜脈穿刺采血法取血，血糖檢測儀測定大鼠血糖值變化。

1.3.2 腎功能檢測： 大鼠眼球取血，分離血清后全自動生化分析儀檢測血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物反應(yīng)原理

由反應(yīng)機(jī)理(圖1A)我們可知，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和1-羥基苯并三唑(HOBT)先與酸發(fā)生反應(yīng)，隨后胺進(jìn)攻最終生成產(chǎn)物酞胺。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，先加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和1-羥基苯并三唑(HOBT)使其反應(yīng)一段時間后再加溶菌酶合成的效果更好。本文選用的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)作為合成步驟中的水溶性脫水劑既滿足了溶菌酶作為蛋白質(zhì)需要反應(yīng)條件溫和的條件，還使后期工藝處理更為簡單。而1-羥基苯并三唑(HOBT)為該合成過程中的輔助性親核試劑，1-羥基苯并三唑(HOBT)優(yōu)先同藥物分子中的羧酸發(fā)生反應(yīng)生成活性脂，然后再與溶菌酶發(fā)生反應(yīng)，使整個合成過程的反應(yīng)速度加快同時還能夠提高收率。

2.2 紫外-可見吸收光譜對黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物的定性分析

通過低溫?cái)嚢璧姆椒ê铣?圖1B)的黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物進(jìn)行了紫外-可見吸收光譜測試，黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物的甲醇溶液在240～400nm區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)了兩個強(qiáng)吸收峰267nm和303nm，且所產(chǎn)生的吸收峰的峰型與黃芩苷大致相同，這可以初步證明該結(jié)合物中黃酮類的母體結(jié)構(gòu)是存在的。但是兩條強(qiáng)峰的波長整體變短，出現(xiàn)了藍(lán)移，可能原因是溶菌酶與黃芩苷共同作用后，影響了黃芩苷結(jié)構(gòu)電子發(fā)生π→π*躍遷和n→π*躍遷而導(dǎo)致的在276nm處產(chǎn)生一吸收強(qiáng)度較弱的峰，這與溶菌酶在277 nm處出現(xiàn)的n→π*躍遷引起的吸收帶是一致的。因此，本文所合成的黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物從結(jié)構(gòu)上與其反應(yīng)物黃芩苷、溶菌酶的結(jié)構(gòu)中的官能團(tuán)一致，說明該方法可以制備出黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物。

2.3 紅外光譜表征黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物

在3500cm-1～3000cm-1波長范圍內(nèi)，溶菌酶出現(xiàn)寬而強(qiáng)的吸收譜帶，為-OH(多締合的醇或酚)的伸縮振動特殊吸收帶，1500cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰為苯環(huán)骨架振動(圖1C)。在3500cm-1～3000cm-1波長范圍內(nèi)，黃芩苷則出現(xiàn)了尖銳的峰，為游離的-OH的伸縮振動產(chǎn)生的，3000cm-1處附近的多重峰為苯環(huán)上的C-H伸縮振動產(chǎn)生的，2000cm-1～1600cm-1處的泛頻峰主要是指芳環(huán)的不同的取代類型。本文采用化學(xué)方法合成的黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物經(jīng)紅外光譜表征，在3500cm-1～3000cm-1波長范圍內(nèi)出現(xiàn)寬而強(qiáng)的吸收譜帶是締合的醇或酚羥基伸縮振動產(chǎn)生的，在1715cm-1波長處出現(xiàn)吸收峰為C=O伸縮振動產(chǎn)生的，在1000cm-1附近的組頻峰為C-H面內(nèi)彎曲振動。通過將黃芩苷、溶菌酶以及本文制備的黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物等三種化合物的紅外光譜的檢測和比較，得出本文所制備的黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物的結(jié)構(gòu)與其反應(yīng)物質(zhì)黃芩苷、溶菌酶的結(jié)構(gòu)中的官能團(tuán)一致，且含有C=O，說明該方法可以制備出黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物。

圖1 黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物的合成和鑒定

2.4 黃芩苷-溶菌酶對DN大鼠的療效一般情況觀察

Con組SD大鼠動作靈活，皮毛光澤，飲食及尿量正常，模型組大鼠自DM模型構(gòu)建成功后逐漸活動減少、皮毛無光，開始出現(xiàn)三多一少癥狀(多飲、多食、多尿、消瘦)。與DN組相比，治療組多飲、多食、多尿的情況于治療4周時有所好轉(zhuǎn)，治療8周時明顯改善。

2.5 黃芩苷-溶菌酶對DN大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和體重的影響

與Con組相比，DN組血糖明顯升高(P<0.001)，體重明顯降低(P<0.001)；與DN組相比，BAI與BAI-LZM組雖略有不同，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，BAI與BAI-LZM組亦無差異(P>0.05)。結(jié)果表明BAI與腎靶向BAI-LZM對大鼠的體重與血糖并無明顯影響 ,見圖2。

圖2 各組大鼠空腹血糖值和體重變化

2.6 黃芩苷-溶菌酶對DN大鼠腎功能的影響

與Con組大鼠相比，DN組大鼠的血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)水平升高顯著，可達(dá)到正常大鼠的2倍以上(P<0.05)；與DN組大鼠相比，BAI與BAI-LZM組大鼠的BUN和Scr水平均顯著降低；特別需要強(qiáng)調(diào)的是，與BAI組相比，BAI-LZM結(jié)合物給藥治療的大鼠BUN和Scr水平均明顯下降，與正常大鼠BUN和Scr水平相近。

表1 各組大鼠 BUN和Scr 比較

3 討論

DM是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。DN的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，目前認(rèn)為是高血糖、高血壓、腎臟血流動力學(xué)異常等多因素參與，在一定遺傳背景下以及部分危險因素共同作用的結(jié)果。幾項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)表明控制血壓、血脂和血糖對DN的發(fā)展具有作用。然而，盡管嚴(yán)格控制血糖和血壓可能會減慢其進(jìn)展，但許多DN患者仍不幸發(fā)展為ESRD。因此，尋找新的治療藥物和治療策略勢在必行。

中藥提取物具有高效低毒的優(yōu)點(diǎn)，在臨床上用于治療慢性腎臟疾病已有悠久的歷史。BAI是中藥黃芩的生物活性提取物，對免疫、心血管、泌尿和神經(jīng)系統(tǒng)都具有保護(hù)作用[3]。研究表明，BAI可以通過降低炎癥反應(yīng)用于DN的臨床治療[3, 4]。因此本研究目的是通過制備黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物，檢測其對糖尿病腎病腎損傷的干預(yù)作用，旨在為糖尿病腎病的有效治療提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)為水溶性脫水劑，以1-羥基苯并三唑(HOBT)為輔助性親核試劑制得黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物，并通過紫外-可見分光光度法與紅外光譜法進(jìn)行了黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物的定性分析，通過紫外光譜圖、紅外光譜圖中黃芩苷、溶菌酶、以及黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物的比較分析，得出本文制備的黃芩苷-溶菌酶其結(jié)構(gòu)中含有黃芩苷、溶菌酶的結(jié)構(gòu)中的官能團(tuán)以及目標(biāo)產(chǎn)物所具備的C=O、-NH2，基本上可以證明此方法可以將黃芩苷和溶菌酶進(jìn)行合成，但若想進(jìn)一步對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究還需通過其他的檢測方法更深層的分析。

所有慢性腎臟疾病發(fā)展的必然結(jié)局就是腎間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致終末期腎功能衰竭[10,11]。然而，相關(guān)文獻(xiàn)報道，黃芩苷能抑制不同組織器官纖維化的發(fā)生和發(fā)展，主要作用機(jī)制包括夠抑制促纖維因子表達(dá)、抑制纖維化信號通路、抗炎、抗氧化等，是一種具有開發(fā)潛力的多組織器官抗纖維化藥物[12,13]。

本實(shí)驗(yàn)合成的黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物，處理DN大鼠后對比了各組大鼠的一般狀態(tài)、空腹血糖值、血尿氮素(BUN)水平以及血肌酐(Scr)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，與模型組大鼠相比，黃芩苷與黃芩苷-溶菌酶治療組大鼠一般狀況、空腹血糖、BUN和Scr水平均明顯下降；與黃芩苷治療組相比，黃芩苷-溶菌酶結(jié)合物治療組能更好的調(diào)控DN大鼠的BUN和Scr水平。本實(shí)驗(yàn)采用黃芩苷為模型藥物，選用溶菌酶為載體，設(shè)計(jì)并合成了黃芩苷-溶菌酶結(jié)合藥物，能夠提高藥物在腎臟的濃度，減小藥物的毒副作用，明顯改善DN大鼠的腎功能，并為糖尿病腎病的有效治療提供新的方法。