納米流式檢測技術(shù)的研發(fā)、應(yīng)用及前景

吳麗娜，薛乘風(fēng)，田 野，洪歆怡，章苗苗，顏曉梅

(廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,譜學(xué)分析與儀器教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建省化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361005)

納米顆粒無處不在，對細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)、病毒、細(xì)菌、亞細(xì)胞器等天然生物納米顆粒和納米藥物、量子點(diǎn)等人工合成的功能性納米顆粒的物理和生物化學(xué)性狀在單顆粒水平進(jìn)行快速的多參數(shù)綜合表征，對于推動基礎(chǔ)生命科學(xué)研究、生物醫(yī)藥和納米科技的發(fā)展具有重要的意義.然而，納米顆粒尺度微小且單個顆粒攜載的功能分子數(shù)量有限，這使得單個納米顆粒的多參數(shù)定量表征極具挑戰(zhàn)性.2010年Science雜志發(fā)表述評指出：表征技術(shù)的匱乏已嚴(yán)重阻礙納米醫(yī)藥的發(fā)展，納米顆粒的表征是納米醫(yī)藥面臨的最大挑戰(zhàn)[1].納米顆粒具有高度的異質(zhì)性和多樣性，而動態(tài)光散射、排阻色譜等常規(guī)的體相分析方法只能夠揭示納米顆粒各項(xiàng)參數(shù)的平均水平，掩蓋了顆粒間的個體差異.因此，發(fā)展具有高靈敏度、高通量和多參數(shù)檢測功能的單顆粒分析技術(shù)，對揭示納米顆粒的異質(zhì)性、實(shí)現(xiàn)對納米顆粒的各種屬性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析具有十分重要的意義.相較于眾多單顆粒分析技術(shù)，如電子顯微鏡[2]、熒光顯微鏡[3]、原子力顯微鏡[4]和表面等離子共振顯微鏡[5]，流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)是一種對懸液中的單個細(xì)胞或微米級的顆粒進(jìn)行快速、多參數(shù)定量分析的先進(jìn)技術(shù)，具有統(tǒng)計(jì)精確性高和實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn).

然而，傳統(tǒng)的商品化流式細(xì)胞儀是為細(xì)胞檢測而設(shè)計(jì)的，其散射和熒光檢測靈敏度均難以滿足納米顆粒(粒徑<100 nm)的單顆粒水平表征的需求.如果能大幅度提升傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的檢測靈敏度，納米顆粒的檢測將具有FCM的快速、多參數(shù)、定量、天然狀態(tài)懸液檢測等優(yōu)勢.結(jié)合瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測技術(shù)，本課題組成功研發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的納米流式檢測技術(shù)(nano-flow cytometry,nFCM)，在國際上首次實(shí)現(xiàn)了發(fā)光能力低于單分子熒光的單個納米顆粒散射信號的直接檢測，將EVs、病毒、SiO2納米顆粒(silica nanoparticles,SiNPs)、納米金的單顆粒檢測下限分別推進(jìn)到40，27，24和7 nm.如圖1所示，nFCM覆蓋了傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀200 nm以下的粒徑檢測盲區(qū)，這在基礎(chǔ)生命科學(xué)研究、生物醫(yī)藥、納米科技、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景.本文主要綜述nFCM在單個納米顆粒(包括EVs、病毒、細(xì)菌、亞細(xì)胞器、納米藥物、量子點(diǎn)等)分析方面所取得的重要進(jìn)展，并闡明nFCM的檢測原理和應(yīng)用前景.

PMT.光電倍增管；APD.雪崩式二極管單光子計(jì)數(shù)探測器.圖1 nFCM的應(yīng)用領(lǐng)域Fig.1 The application fields of nFCM

1 超靈敏流式檢測技術(shù)研發(fā)的重要性

FCM是一種對單個細(xì)胞或細(xì)胞大小顆粒的理化特性進(jìn)行快速多參數(shù)定量分析的技術(shù)[6-9].其工作原理是：懸液中的細(xì)胞或微粒經(jīng)流體動力學(xué)聚焦后逐一通過激光探測區(qū)，所產(chǎn)生的前向角、側(cè)向角散射以及多色熒光信號經(jīng)分光系統(tǒng)分光后被檢測系統(tǒng)同時檢測.通過散射光信號可對細(xì)胞(顆粒)大小和顆粒度進(jìn)行定性分析；結(jié)合特異的熒光探針，將樣品的生物化學(xué)信息轉(zhuǎn)換為熒光信號，可實(shí)現(xiàn)DNA、RNA、蛋白質(zhì)含量、酶活性、離子濃度、pH值以及膜電位等物理和生物化學(xué)性狀的多參數(shù)同時測定.而將散射和/或熒光信號與背景區(qū)分是實(shí)現(xiàn)上述功能的前提條件.

就散射而言，傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的散射光檢測下限通常為200～500 nm的聚苯乙烯(polystyrene,PS)微球[10-11]，而且生物納米顆粒的折射率較PS微球要小得多(PS微球?yàn)?.59，細(xì)菌為1.38～1.45[12]，病毒為1.45～1.46[13]，EVs為1.40[14]).根據(jù)米氏散射理論，直徑為1 μm的細(xì)胞產(chǎn)生的前向散射光(forward-scattered light, FSC)強(qiáng)度與直徑為0.4 μm的PS微球相當(dāng)[15].而病毒的粒徑為25～350 nm且大多接近或小于100 nm[11,16]，EVs的粒徑介于30～1 000 nm且大多小于150 nm[17-18].根據(jù)瑞利散射定律，當(dāng)球形顆粒的尺寸遠(yuǎn)小于激發(fā)光波長時，散射光強(qiáng)度隨粒徑的6次方衰減，公式如下[19]：

其中，σscatt是散射截面積，d是粒徑，λ是激發(fā)光波長，nmed是顆粒周圍介質(zhì)的折射率，m是顆粒與介質(zhì)的折射率的比值.通過計(jì)算σscatt可知，若要將散射光檢測下限從PS微球的200 nm推進(jìn)至100，40和25 nm，儀器的檢測靈敏度需要分別提升64倍，15 625倍和262 144倍.因此對于生物納米顆粒的散射檢測，F(xiàn)CM面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn).

采用熒光染料對生物納米顆粒進(jìn)行熒光標(biāo)記，是促進(jìn)FCM對生物納米顆粒進(jìn)行單顆粒檢測的重要策略.傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的熒光(以異硫氰酸熒光素(FITC)熒光通道為例)檢測限約為500個FITC分子.隨著粒徑的減小，顆粒的表面積和內(nèi)容物數(shù)量均大幅下降.以來源于細(xì)胞的EVs為例，假設(shè)細(xì)胞和EVs的直徑分別為10 μm和100 nm，且生化分子密度相似，則EVs表面可被熒光標(biāo)記的分子數(shù)量將比細(xì)胞少1萬倍，內(nèi)容物含量則比細(xì)胞少100萬倍.由此可見，傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的熒光檢測能力也無法滿足生物納米顆粒的檢測需求[20].因此，發(fā)展新型的FCM十分必要，將彌補(bǔ)現(xiàn)有FCM在檢測能力方面的不足，極大地?cái)U(kuò)充其應(yīng)用范圍.

2 FCM靈敏度的提升歷程

FCM自20世紀(jì)60年代發(fā)展至今，已經(jīng)成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測等多領(lǐng)域不可或缺的技術(shù).而FCM應(yīng)用于生物納米顆粒檢測可以追溯到1979年，Shapiro課題組通過自行研制具有低流速、小探測體積(100 fL數(shù)量級)和較高激光功率(100 mW)等特點(diǎn)的流式細(xì)胞儀，實(shí)現(xiàn)了T2噬菌體(粒徑約100 nm)與呼腸孤病毒(Reoviridae)空殼的散射光分辨，其中呼腸孤病毒空殼的散射光信號剛好能和背景區(qū)分[21].同年，Steen和Lindmo在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上，發(fā)展了一種新型流式細(xì)胞儀[22]，將水以較小的角度噴射到顯微鏡蓋玻片上后形成層流，在暗場條件下使用顯微鏡檢測蓋玻片上流體內(nèi)的顆粒，該裝置巧妙地解決了弧光燈照明區(qū)域大和散射光收集角度選擇之間的沖突.這種設(shè)計(jì)在小角度(約2°)和大角度(約18°)均可以進(jìn)行散射光檢測，檢測極限均約為200 nm的PS微球[23-24].2004年，Steen對激光作為激發(fā)源的流式細(xì)胞儀進(jìn)行改良，通過增大散射光收集角度(16°～70°)并對鞘液進(jìn)行一系列過膜處理(包括使用孔徑0.1 μm的濾膜)以減少鞘液中的雜質(zhì)顆粒，實(shí)現(xiàn)了74 nm的PS微球與尺寸約為100 nm的病毒的區(qū)分[11].

根據(jù)光散射理論，粒徑大于入射光波長的顆粒主要在前向角方向?qū)膺M(jìn)行散射.隨著顆粒粒徑減小，光散射角度變寬，更多的光沿垂直方向散射，而尺寸小于入射光波長的生物納米顆粒正符合這種情況[10,19,25].因此，收集大角度的散射光甚至側(cè)向散射光(side-scattered light,SSC)可以有效提升生物納米顆粒的散射光檢測靈敏度[26].為了拓展FCM在納米顆粒分析中的應(yīng)用，一些傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀廠商采取了一系列措施以提升靈敏度，包括收集大角度散射光、提高激光器功率、使用高性能PMTs和紫外光激光器等.例如：定制型BD Influx(配備200 mW的488 nm激光器及PMTs)將FSC收集角度范圍從最初的2°～25°更改為15°～25°，以便阻擋對<15°雜散光的收集，從而提高信噪比并實(shí)現(xiàn)100和200 nm的PS微球的區(qū)分[27-29]；Beckman Coulter(BC) Gallios則提供了新的“W2 mask”選項(xiàng)，通過對收集到的8°～19°的FSC進(jìn)行差分放大，使噪聲降至最低[30-31]，可實(shí)現(xiàn)100和300 nm 的Megamix PS微球的基線分辨[31]；BC MoFlo Astrios EQ的散射光和熒光均可以輕松分辨100 nm PS熒光微球[32].值得一提的是，從Steen/Bio-Rad Bryte設(shè)計(jì)[33]演變而來的具有較高散射光檢測靈敏度的Apogee系列A30/40/50/60-Micro流式儀器，可以測到100 nm PS微球，其專為檢測微生物而設(shè)計(jì)，也同樣適用于其他生物納米顆粒的檢測.該設(shè)備最多可對3個非固定角度范圍的散射光進(jìn)行收集，從而可以通過優(yōu)化收集角度以識別尺寸小、信號弱的顆粒[34]，在檢測亞微米尺度生物顆粒方面具有顯著優(yōu)勢[15,35-37].以上科研實(shí)驗(yàn)室和流式生產(chǎn)廠商的努力均為拓展流式細(xì)胞儀在納米顆粒分析中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

3 nFCM的研發(fā)

圖2 TEM、nFCM和NTA對SiNPs粒徑分布表征的比較[17]Fig.2 Comparison of characterization of SiNPs size distribution measured by TEM,nFCM,and NTA,respectively[17]

為了拓展FCM在納米顆粒檢測中的應(yīng)用，尤其是實(shí)現(xiàn)粒徑小于100 nm的病毒、EVs、納米藥物等的檢測，本課題組將瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測技術(shù)[38-40]相結(jié)合，通過四大策略成功研發(fā)了nFCM：1) 使用流體動力學(xué)聚焦技術(shù)壓縮液流直徑，減小探測區(qū)體積至皮升或飛升級；2) 延長單個納米顆粒穿越激光探測區(qū)的時間至毫秒級，納米顆粒被往復(fù)激發(fā)產(chǎn)生“光子爆發(fā)”，光電探測器可有效甄別出單個顆粒的光信號；3) 采用高量子產(chǎn)率的APD；4) 采用精準(zhǔn)的光學(xué)成像系統(tǒng)結(jié)合視場光闌，有效濾除探測區(qū)外的雜散光干擾.自2006年起，經(jīng)過8年3個階段的不懈努力，于2014年將單個SiNP和納米金的散射檢測下限推進(jìn)到24和7 nm，在國際上首次實(shí)現(xiàn)了發(fā)光能力低于單分子熒光的單個納米顆粒散射信號的直接檢測，散射檢測靈敏度較傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀提升4～6個數(shù)量級，可對納米顆粒懸液進(jìn)行粒徑快速表征；熒光檢測靈敏度較傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀提高2～3個數(shù)量級，實(shí)現(xiàn)了單個藻紅蛋白熒光信號的高信噪比檢測[41].如圖1所示，樣品流在鞘液的作用下被壓縮成很細(xì)的流束，確保所有的顆粒以同樣的速率和路徑逐一穿越整個激光探測區(qū)，不僅檢測靈敏度高，而且信號均一.樣品顆粒所發(fā)射的散射光和多色熒光信號經(jīng)由高效能集光系統(tǒng)收集后由APD或PMT檢測，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)同時定量分析.nFCM以每分鐘高達(dá)10 000個顆粒的速率對單個納米顆粒的散射和多色熒光信號進(jìn)行同時檢測，僅需2～3 min即可實(shí)現(xiàn)納米顆粒樣本的粒徑、濃度和多種生化性狀的多參數(shù)定量分析.需要特別指出的是，nFCM對納米顆粒粒徑表征的分辨率可媲美透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM).如圖2所示，nFCM與TEM均可實(shí)現(xiàn)5種不同大小SiNPs的基線分辨，且所得粒徑表征結(jié)果幾乎完全吻合；而納米顆粒追蹤分析技術(shù)(nanoparticle tracking analysis,NTA)不僅因?yàn)檎箤拠?yán)重?zé)o法分辨這5種不同大小的SiNPs，而且其粒徑測定結(jié)果和TEM結(jié)果相比明顯偏大很多.nFCM可以像傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞那樣對細(xì)菌、病毒、亞細(xì)胞器、EVs、納米藥物、功能化納米顆粒等在單顆粒水平進(jìn)行高通量、多參數(shù)定量分析，填補(bǔ)了國際空白，在生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究以及納米科技等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景，并已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化(圖3).

圖3 廈門福流生物科技有限公司生產(chǎn)的納米流式檢測儀Fig.3 The flow nanoanalyzer of NanoFCM Inc.

4 nFCM對天然生物納米顆粒的表征應(yīng)用

4.1 單細(xì)胞水平細(xì)菌檢測

通過單顆粒水平的高通量、多參數(shù)定量分析，F(xiàn)CM已廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)研究，如檢測食物、環(huán)境水樣和臨床樣品中的病原菌和表征細(xì)菌對抗生素的應(yīng)激響應(yīng)等[42-49].然而傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀由于靈敏度的限制以及嚴(yán)重受制于鞘液中雜質(zhì)顆粒的影響，不僅難以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌與背景信號的完全分辨，可檢測的生化參數(shù)也受到很大限制[47,50].利用nFCM裝置，結(jié)合多種熒光標(biāo)記策略，本課題組在單細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌的多種生物化學(xué)參數(shù)測定.

圖4 nFCM在細(xì)菌檢測中的應(yīng)用Fig.4 Applications of nFCM in bacterial analysis

采用抗體、核酸共染法，通過nFCM對致病菌和總菌同時計(jì)數(shù)，本課題組在2010年發(fā)展了高靈敏、高特異性的細(xì)菌絕對定量分析方法，僅通過離心富集操作，即可實(shí)現(xiàn)初始濃度為1.0×102cfu/mL的大腸桿菌(Escherichiacoli)O157:H7的準(zhǔn)確定量分析[51].nFCM的超高靈敏性可以對單個細(xì)菌的綠色自發(fā)熒光進(jìn)行定量檢測.利用FITC亮度已知的熒光納米標(biāo)準(zhǔn)球?qū)?xì)菌的自發(fā)熒光進(jìn)行標(biāo)定，發(fā)現(xiàn)單個細(xì)菌自發(fā)熒光的亮度在80～1 400個FITC分子范圍，這是國際上首次對單個細(xì)菌的自發(fā)熒光進(jìn)行FITC當(dāng)量報(bào)道[52].借助β-半乳糖苷酶(β-gal)這一最常用的基因表達(dá)報(bào)告分子，本課題組采用β-gal的親脂性熒光底物C12FDG對細(xì)菌進(jìn)行染色，通過nFCM對單個細(xì)菌熒光信號的檢測，結(jié)合熒光定量法及nFCM快速細(xì)胞計(jì)數(shù)，實(shí)現(xiàn)了單個細(xì)菌中本底表達(dá)β-gal拷貝數(shù)的定量表征[53]，該方法可應(yīng)用于單細(xì)胞水平低豐度蛋白的定量分析，有效揭示細(xì)菌分子含量和表型的異質(zhì)性.本課題組制備了38種粒徑(180～880 nm)高度均一的SiO2亞微米顆粒標(biāo)準(zhǔn)品，采用nFCM對單個顆粒的散射光強(qiáng)度進(jìn)行高靈敏檢測，在實(shí)驗(yàn)水平高精度地描繪了亞微米顆粒散射光強(qiáng)度與粒徑的關(guān)系曲線(圖4(a))；結(jié)合米氏散射理論，發(fā)展了一種對亞微米顆粒粒徑進(jìn)行快速測定的方法,對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的粒徑測定結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確性和分辨率可媲美TEM[54].通過同源重組技術(shù)對腸出血性大腸桿菌O157:H7的噬菌體PP01進(jìn)行基因改造，重組噬菌體保留其對宿主菌的特異侵染能力，并在宿主菌內(nèi)部快速繁殖，每一個子代噬菌體的外殼蛋白都帶有重組的四半胱氨酸標(biāo)簽，經(jīng)跨膜的雙砷染料特異標(biāo)記，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，可被nFCM高靈敏地檢測[55].進(jìn)而結(jié)合雙砷染料-四半胱氨酸(FlAsH-TC)標(biāo)記體系，發(fā)展了靈敏的毒素與抗毒素(toxin-antitoxin，TA)的單細(xì)菌水平研究方法(圖4(b))，發(fā)現(xiàn)：天然啟動子指導(dǎo)下的TA系統(tǒng)在無環(huán)境壓力時存在高表達(dá)與低表達(dá)MqsA抗毒素蛋白的兩個細(xì)菌亞群；在環(huán)境壓力如膽汁應(yīng)激、熱激和氨基酸饑餓條件下，這兩個細(xì)菌亞群通過不同的反應(yīng)來調(diào)控MqsA的降解或表達(dá).這種分析方法將為TA系統(tǒng)的異質(zhì)性及作用機(jī)理分析提供先進(jìn)的技術(shù)手段[56].

隨著抗生素的大量使用和濫用，細(xì)菌耐藥已嚴(yán)重威脅人類健康.在多種細(xì)菌耐藥機(jī)制中，細(xì)菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是80%病原菌耐藥的主要原因.本課題組與新加坡南洋理工大學(xué)邢本剛教授課題組合作，發(fā)展了針對TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶且具有共價(jià)結(jié)合能力的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)探針LBRL1，利用nFCM實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥性的檢測，可測定混合菌中比率低至5%的耐藥菌[57].本課題組進(jìn)一步使用TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶的單克隆抗體對位于細(xì)菌周質(zhì)空間的β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，同時采用核酸染料對細(xì)菌DNA進(jìn)行染色，采用nFCM對單個細(xì)菌的散射和雙色熒光進(jìn)行同時檢測，可檢測到混合菌中比率低至0.1%的耐藥菌，遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的藥敏紙片法和顯色底物頭孢硝噻吩法10%的檢測限(圖4(c)).該方法成功實(shí)現(xiàn)了抗生素環(huán)境下敏感菌致死、耐藥菌逐漸生長為優(yōu)勢菌的動力學(xué)監(jiān)測以及臨床尿樣中細(xì)菌的無培養(yǎng)直接快速檢測[58].

食品安全是人類健康的首要因素，將nFCM應(yīng)用于各類食品中細(xì)菌的快速檢測是本課題組的重點(diǎn)研究方向之一.利用SYTO 9和碘化丙啶(propidium iodide，PI)核酸染料分別對總菌和死菌進(jìn)行熒光標(biāo)記，本課題組發(fā)展了酸奶和益生菌飲料中益生菌濃度和存活率的快速檢測方法[59].僅僅采用PicoGreen標(biāo)記細(xì)菌核酸，nFCM可以在20 min內(nèi)準(zhǔn)確地定量飲用水和茶飲料中的總細(xì)菌濃度[60].通過建立雞蛋樣品前處理方法，結(jié)合核酸和免疫熒光染色，nFCM可直接對雞蛋中的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)和細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行定量檢測，該方法可在1.5 h內(nèi)完成，細(xì)菌回收率為93%，檢出限低至2×103mL-1，對鼠傷寒沙門氏菌的特異性接近100%[61].盡管通過核酸染色使得細(xì)菌可以通過熒光信號與樣本中的非生物類雜質(zhì)顆粒加以區(qū)分，而且可以檢測所有的細(xì)菌，但是當(dāng)樣本中含有植物細(xì)胞、動物細(xì)胞的碎片或游離核酸時，碎片對染料的吸附作用以及游離核酸的熒光信號均會對檢測結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重干擾.利用nFCM能對細(xì)菌自發(fā)熒光進(jìn)行檢測的性能，通過優(yōu)化樣本前處理方法，本課題組發(fā)展了果汁中細(xì)菌的無標(biāo)記快速檢測方法(圖4(d))，對蘋果汁中細(xì)菌的檢測下限為100 mL-1[62].

4.2 單細(xì)胞器水平線粒體的多參數(shù)檢測

線粒體是細(xì)胞生命活動控制中心，它不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且在多種誘因引發(fā)的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著至關(guān)重要的中樞調(diào)控作用[63-64].由于細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)和功能存在高度的異質(zhì)性，相比于全細(xì)胞分析或蛋白免疫印跡(Western blot)技術(shù)，高通量的單線粒體檢測不僅能揭示因集權(quán)平均而被掩蓋的個體差異，而且可以簡化樣品的復(fù)雜性，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的解析更加簡潔、明確.然而，線粒體個體微小且折射率低，傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀難以對單個線粒體進(jìn)行高靈敏的多參數(shù)檢測.利用nFCM檢測裝置，本課題組建立了單線粒體水平的多參數(shù)、高通量分析方法.

采用線粒體內(nèi)膜心磷脂特異性熒光探針(NAO)和核酸探針(SYTO 62) 對線粒體進(jìn)行標(biāo)記，利用nFCM在單顆粒水平對雙熒光標(biāo)記的線粒體進(jìn)行檢測(圖5(a)).通過散射光通道與兩個熒光通道信號的時間相關(guān)性，可定量分析所提取線粒體的純度和結(jié)構(gòu)完整性，并從單細(xì)胞器水平揭示線粒體的異質(zhì)性[65].采用抗癌藥物直接刺激提純的人宮頸癌HeLa細(xì)胞線粒體，經(jīng)線粒體膜電位熒光探針染色后，利用nFCM分析藥物作用前后單個線粒體形態(tài)(散射光)和膜電位(熒光)的變化，發(fā)展了靶向線粒體抗腫瘤藥物的nFCM快速篩選方法(圖5(b)).通過對8種臨床抗癌藥物的測試發(fā)現(xiàn)，樺木酸、抗霉素A、紫杉醇、姜黃素、雷公藤甲素、ABT-737具有濃度依賴的線粒體膜電位下降趨勢，而放線菌素D和順鉑則不能直接作用于線粒體[66].結(jié)合基于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的線粒體熒光標(biāo)記手段，利用nFCM建立線粒體融合的高通量定量檢測方法，并將其應(yīng)用于線粒體融合與凋亡的關(guān)系研究(圖5(c)).結(jié)果表明凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路負(fù)向地調(diào)節(jié)線粒體融合行為，融合也會協(xié)助癌細(xì)胞抵抗死亡；該方法被進(jìn)一步用于融合抑制劑的識別與篩選[67].此外，為了實(shí)現(xiàn)單線粒體水平細(xì)胞凋亡相關(guān)Bcl-2和Bax蛋白的測定，本課題組采用熒光標(biāo)記的特異性抗體mAb-AF488和核酸染料對HeLa細(xì)胞提純線粒體進(jìn)行熒光標(biāo)記，使用nFCM對單個線粒體的散射和雙色熒光信號進(jìn)行同時檢測，建立了快速、準(zhǔn)確的單線粒體水平蛋白數(shù)量及其分布的測定方法(圖5(d)).研究發(fā)現(xiàn)單個線粒體表面的蛋白分布存在著巨大的差異性，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡藥物刺激9 h后，Bax從胞漿轉(zhuǎn)位到線粒體，線粒體表面的拷貝數(shù)增加4.4倍；該方法為深入研究線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了先進(jìn)的分析手段[68].

4.3 單顆粒水平病毒無標(biāo)記檢測

病毒是自然界中分布最廣、基因多樣性最強(qiáng)的生命形式，是許多致死性疾病的罪魁禍?zhǔn)?，給人類的生命健康和社會安定帶來嚴(yán)重威脅[69].近年來，病毒也被用作醫(yī)學(xué)診斷和治療的試劑、基因傳遞的載體、抗菌劑以及納米材料基元等[70-71].發(fā)展高分辨、高通量的病毒粒徑及其分布表征技術(shù)對于病毒學(xué)研究、疾病診斷和治療等具有重要意義.然而現(xiàn)有的病毒表征方法如TEM和動態(tài)光散射存在檢測速度慢或者分辨率不足等缺點(diǎn).隨著儀器、熒光染料和標(biāo)記策略的進(jìn)步，流式細(xì)胞儀被應(yīng)用于病毒或病毒樣顆粒的單顆粒水平測定，稱為流式病毒術(shù)(flow virometry)[16，72-73].但病毒粒徑微小(25～350 nm)，所含生物化學(xué)成分極其微量，給流式病毒術(shù)的檢測帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn).本課題組通過提高nFCM的激光功率密度和進(jìn)一步降低探測區(qū)體積等策略，發(fā)展了一種無標(biāo)記的病毒顆?？焖佟?zhǔn)確的測定方法[13].該方法實(shí)現(xiàn)了對粒徑只有27 nm的輕小病毒(MS2) 的單顆粒散射檢測(圖6).通過單個病毒顆粒散射光強(qiáng)度的測定實(shí)現(xiàn)病毒顆粒粒徑及其分布的準(zhǔn)確測定，對等效球體粒徑僅相差4 nm 的T7和Lambda噬菌體實(shí)現(xiàn)基線分辨，能分辨PP01噬菌體尾部伸長或收縮的兩種形態(tài).此外，單顆粒檢測使nFCM對雜質(zhì)顆粒的影響不敏感，更適合于分析多分散或者混合物樣品，并成功地應(yīng)用于病毒樣本的純度測定和病毒基因組釋放過程的動態(tài)監(jiān)測.相對于傳統(tǒng)的TEM表征技術(shù)，該方法對病毒懸液進(jìn)行直接檢測，將分析時間從數(shù)小時縮短至幾分鐘，統(tǒng)計(jì)精確性高、實(shí)用性強(qiáng)，為病毒研究提供了一種新型的高效分析手段.

4.4 單顆粒水平EVs檢測

EVs是一種由細(xì)胞釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的納米尺度的膜性小囊泡，主要包括從細(xì)胞膜直接出芽脫落的微囊泡(microvesicles,MVs)和多泡體與細(xì)胞膜融合釋放的外泌體兩大類，參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、血管新生和腫瘤生長等過程，廣泛地存在于各種體液和細(xì)胞上清中，在疾病診斷、預(yù)后和治療中顯示出巨大的應(yīng)用前景[74-78].由于EVs的粒徑及其攜載的蛋白、核酸、脂類等“貨物分子”隨細(xì)胞來源、細(xì)胞狀態(tài)以及分泌途徑的不同而存在高度的異質(zhì)性和多樣性，所以亟需發(fā)展一種單顆粒水平的高通量、多參數(shù)定量分析技術(shù)，以揭示EVs的個體差異，鑒定發(fā)揮重要作用的EVs亞群.然而，絕大多數(shù)EVs的粒徑小于100 nm，特異性蛋白的表達(dá)量極低且異質(zhì)性大，對其在單顆粒水平進(jìn)行多參數(shù)定量檢測一直存在諸多挑戰(zhàn).基于米氏散射模型的散射光與粒徑的關(guān)系，2018年van der Pol等[79]對各種商品化流式細(xì)胞儀可檢測到的EVs的粒徑范圍進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)幾款高靈敏設(shè)備(包括Apogee A50- Micro、BD influx和BD LSR Ⅱ)可以檢測300～600 nm范圍的EVs，其他常規(guī)配置的流式細(xì)胞儀只適用于檢測粒徑范圍在600～1 200 nm和/或1 200～3 000 nm的大尺寸EVs.

針對這一難題，本課題組使用具有極高側(cè)向散射檢測靈敏度的nFCM檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對粒徑低至40 nm 的EVs的單顆粒水平多參數(shù)定量檢測[17].如圖7所示，僅需幾分鐘即可獲得具有高度統(tǒng)計(jì)代表性的EVs粒徑分布特征，分辨率和準(zhǔn)確性媲美冷凍TEM(Cryo-TEM).在臨床樣本檢測方面，僅需50 μL血漿樣本即可實(shí)現(xiàn)血漿中EVs的顆粒濃度測定；結(jié)合免疫熒光標(biāo)記，通過對血漿中CD147陽性EVs的顆粒濃度測定，實(shí)現(xiàn)了結(jié)直腸癌的早期診斷(p<0.001) 和預(yù)后分析(p<0.05).nFCM使得研究人員能夠像用傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞那樣對EVs進(jìn)行多參數(shù)定量檢測，可為EVs的異質(zhì)性分析、母細(xì)胞的來源鑒定以及基于EVs的診斷標(biāo)志物的探尋和治療制劑的開發(fā)等提供先進(jìn)的分析表征手段.

圖7 單顆粒水平表征EVs的粒徑和表面蛋白[17]Fig.7 Characterization of particle size and surface protein of EVs at the single-particle level[17]

圍繞如何定量評估EVs純化效果這一亟需解決的科學(xué)難題，本課題組基于nFCM高靈敏、高通量以及多參數(shù)的單顆粒表征優(yōu)勢，對目前常用的6種純化方法(超速離心和5種基于聚合物沉淀、尺寸排阻或膜親和吸附等原理的試劑盒)對血漿中EVs的純化效果進(jìn)行了評估[80]：與超速離心法相比，試劑盒將血漿中大量的非囊泡組分一并純化，雖然分離后的樣本顆粒濃度較超速離心樣本高出2～4個數(shù)量級，但是純度卻低得多.結(jié)合免疫熒光染色，nFCM在單顆粒水平實(shí)現(xiàn)了對血漿中來源于紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞的EVs亞群比例和濃度的定量分析.

nFCM在EVs的粒徑分布、濃度等物理參數(shù)以及核酸、特定蛋白等生物化學(xué)性質(zhì)的表征中均展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，由該技術(shù)轉(zhuǎn)化的商品化納米流式檢測儀Flow NanoAnalyzer銷售到全球頂尖科研機(jī)構(gòu)、醫(yī)療單位和高科技企業(yè)，應(yīng)用于EVs的基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā).例如，美國梅奧醫(yī)學(xué)中心(Mayo Clinic)的王海龍教授課題組采用nFCM對不同電刺激條件下大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的AQP4陽性EVs的濃度和粒徑進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)胞外電刺激可調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞EVs的釋放及內(nèi)含物組成，推進(jìn)了EVs在帕金森綜合征等神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域的應(yīng)用[81].2020年9月15日，美國Codiak BioSciences公司宣布其開發(fā)的世界首個工程化外泌體治療候選藥物exoIL-12進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)，其在遞交的專利中明確指出利用nFCM發(fā)現(xiàn)該基因改造外泌體幾乎100%表達(dá)目的蛋白PTGFRN，這對治療效果的提高提供了極大的保障[82].

5 nFCM對人工合成納米粒子的表征應(yīng)用

隨著納米生物技術(shù)的飛速發(fā)展，具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)與功能的人工合成納米顆粒在藥物的靶向傳輸、腫瘤的高分辨成像(核磁和熒光)、疾病診斷、蛋白純化、病原體檢測等生物醫(yī)學(xué)以及食品安全、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域正發(fā)揮著越來越重要的作用.然而，納米顆粒尺度微小且單個粒子攜載功能化試劑的容量有限，使得單個納米顆粒的多參數(shù)定量檢測極具挑戰(zhàn)性.

5.1 單顆粒水平納米藥物多參數(shù)定量表征

針對納米顆粒表征這一國際公認(rèn)的嚴(yán)重阻礙納米藥物從實(shí)驗(yàn)室研究到臨床應(yīng)用的瓶頸問題[1]，本課題組利用nFCM，以阿霉素脂質(zhì)體和攜載小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)的脂質(zhì)納米粒(lipid nanoparticles,LNPs)為模型，建立了納米藥物載藥率、粒徑、載藥量、顆粒濃度等的單顆粒水平多參數(shù)定量表征技術(shù)，不僅能揭示因集權(quán)平均而被掩蓋的個體差異，而且能實(shí)現(xiàn)各種物理化學(xué)和生物化學(xué)參數(shù)之間的高度相關(guān)分析，可為納米藥物的研發(fā)和質(zhì)量控制提供重要的技術(shù)保障.

FL.熒光；PET.正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像；MRI.磁共振成像.圖8 nFCM應(yīng)用于納米藥物的多參數(shù)表征[41]Fig.8 Multi-parameter characterization of nanomedicine by nFCM[41]

阿霉素脂質(zhì)體是美國食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的首個臨床抗腫瘤納米藥物，其粒徑分布和單個顆粒包裹的阿霉素含量的表征需要使用Cryo-TEM結(jié)合復(fù)雜的三維斷層掃描重構(gòu)技術(shù)，花費(fèi)2～3 d 的功夫.如圖8所示，本課題組使用nFCM檢測技術(shù)對阿霉素脂質(zhì)體懸液進(jìn)行單顆粒水平的多參數(shù)測定，借助不同粒徑的標(biāo)準(zhǔn)球，僅需2～3 min即可實(shí)現(xiàn)阿霉素脂質(zhì)體粒徑和阿霉素自發(fā)熒光亮度的定量表征，而且可在單顆粒水平對顆粒粒徑和包裹的阿霉素含量進(jìn)行相關(guān)分析[41].為了實(shí)現(xiàn)阿霉素脂質(zhì)體內(nèi)部阿霉素分子數(shù)量的定量表征，本課題組合成了一系列不同粒徑的阿霉素脂質(zhì)體，采用Cryo-TEM對其進(jìn)行粒徑表征，使用熒光分光光度計(jì)和納米流式檢測儀對其平均阿霉素分子含量進(jìn)行表征，通過建立nFCM散射光強(qiáng)度與粒徑的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以及nFCM熒光強(qiáng)度與阿霉素含量的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，發(fā)展了脂質(zhì)納米藥物的單顆粒水平多參數(shù)定量表征方法，實(shí)現(xiàn)了對商品化阿霉素脂質(zhì)體Doxoves和gDoxil的粒徑和載藥量的快速表征[83].攜載siRNA的LNPs是目前臨床證實(shí)最具潛力的RNA干擾藥物，但是對于其顆粒濃度和siRNA的裝載比率這兩項(xiàng)指標(biāo)，國際上尚缺乏有效的表征手段.由于LNPs的電子密度在裝載siRNA前后并未發(fā)生明顯變化，即便采用Cryo-TEM也無法確認(rèn)LNPs是否裝載了siRNA.本課題組采用跨膜核酸染料SYTO 82對siRNA-LNPs進(jìn)行熒光標(biāo)記，在nFCM上同時檢測單個納米藥物顆粒的散射和熒光信號，結(jié)果表明空白LNPs和siRNA- LNPs在二維散點(diǎn)圖上可以完全區(qū)分[41].本課題組利用nFCM檢測裝置幫助全球基因治療納米藥物的領(lǐng)航者——美國Alnylam Pharmaceuticals對其臨床Ⅱ期siRNA-LNPs的濃度和siRNA裝載比率進(jìn)行測定，為其提供了完美的技術(shù)解決方案.nFCM超高的靈敏度、卓越的分辨率和多參數(shù)同時分析的能力為脂質(zhì)體納米藥物的表征提供了一種快速、高通量的新方法.

5.2 單顆粒水平量子點(diǎn)的定量表征

量子點(diǎn)是一種具有量子限域效應(yīng)的零維熒光納米材料，具有發(fā)射波長窄且對稱、斯托克斯位移較大、光穩(wěn)定性好以及通過調(diào)控尺寸可以調(diào)控發(fā)射波長等優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì).在量子點(diǎn)的生產(chǎn)合成及生物應(yīng)用中，研究人員需要準(zhǔn)確地了解量子點(diǎn)的濃度、發(fā)光性能及其均一性、生物試劑偶聯(lián)之后是否導(dǎo)致量子點(diǎn)聚集等物理、化學(xué)性狀.現(xiàn)有的量子點(diǎn)檢測方法僅能對量子點(diǎn)的濃度進(jìn)行估計(jì)，存在誤差大且難以獲知量子點(diǎn)發(fā)光性能異質(zhì)性等不足.本課題組通過對nFCM光學(xué)系統(tǒng)、液流系統(tǒng)的改進(jìn)，儀器的熒光檢測靈敏度較原有儀器提升2.8倍，單個藻紅蛋白熒光信號的信噪比高達(dá)34，單個Qdot655量子點(diǎn)檢測的信噪比高達(dá)88，由此建立了量子點(diǎn)的單顆粒水平熒光定量表征方法[84].該方法可對量子點(diǎn)的發(fā)光強(qiáng)度及其均一性、顆粒團(tuán)聚程度、顆粒濃度，以及環(huán)境因素對其發(fā)光性能的影響等進(jìn)行快速表征，對于指導(dǎo)量子點(diǎn)的合成優(yōu)化、質(zhì)量控制和生化分析應(yīng)用等具有重要意義.

6 nFCM的前景展望

nFCM的成功研發(fā)和最新進(jìn)展使得人們能夠以更高的靈敏度和準(zhǔn)確性對納米尺度生物顆粒的數(shù)量、大小、組成、表型等物理和生化性狀進(jìn)行多參數(shù)同時定量分析，將為相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展以及診斷、治療和預(yù)防提供全新視角.未來，nFCM的發(fā)展主要包括3個方面：1) 開發(fā)多樣性應(yīng)用，不同領(lǐng)域的研究人員可以利用nFCM來攻克一些當(dāng)前難以解決的納米尺度生物學(xué)及材料學(xué)問題.除了上述討論的細(xì)菌、線粒體、病毒、EVs、納米藥物外，nFCM在染色體、核糖體、溶酶體等生物納米顆粒的分析領(lǐng)域也具有巨大的應(yīng)用前景.2) 進(jìn)一步深入開展nFCM在細(xì)菌、病毒、EVs表征方面的應(yīng)用，建立更多快速、便捷的食品安全、環(huán)境監(jiān)測、生物醫(yī)藥相關(guān)方法和技術(shù)，如血液等復(fù)雜樣品中低豐度細(xì)菌、病毒的快速定量檢測，以及納米藥物、病毒疫苗生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制等.此外，nFCM在EVs分析中的應(yīng)用才剛剛起步，借助nFCM可以揭示EVs在細(xì)胞通訊、疾病尤其是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用.3) 進(jìn)一步提升nFCM儀器性能.如研制納米流式光譜檢測系統(tǒng)，突破濾光片分光面臨的光譜重疊所造成的檢測參數(shù)限制.光柵光譜儀和電子倍增電荷耦合元件(EMCCD)相結(jié)合不僅能對流動狀態(tài)下單細(xì)胞的熒光光譜進(jìn)行快速捕獲，而且能獲得單個細(xì)菌、細(xì)胞器、功能納米顆粒的熒光光譜，實(shí)現(xiàn)無需熒光補(bǔ)償?shù)亩鄥?shù)分析，滿足生命科學(xué)前沿研究、生物醫(yī)學(xué)和納米科技的發(fā)展需求.多參數(shù)檢測意味著數(shù)據(jù)維度的提升，需要開發(fā)高維度流式數(shù)據(jù)處理算法及軟件以自動化處理、分析數(shù)據(jù)，充分挖掘數(shù)據(jù)中的信息，發(fā)揮納米流式光譜檢測技術(shù)的優(yōu)勢.以上3個發(fā)展方向相輔相成，將不斷拓展儀器應(yīng)用領(lǐng)域，為納米顆粒的超高靈敏檢測提供強(qiáng)有力的分析手段.