X射線照射對人臍靜脈內皮細胞焦亡的影響

李 辰，田 梅，齊雪松，王春燕，曲功霖，邵 帥，王成芳，茍 巧

(中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫(yī)學所，輻射防護與核應急中國疾病預防控制中心重點實驗室，北京 100088)

流行病學研究顯示，接受放射治療的病人心血管疾病的發(fā)病風險顯著增加。血管內皮細胞是介導輻射誘導的心血管疾病的關鍵細胞。血管內皮細胞的損傷和細胞因子分泌是輻射損傷的主要急性效應，這些現(xiàn)象改變了受照機體的內部環(huán)境，使其出現(xiàn)慢性炎癥狀態(tài)，從而導致動脈粥樣硬化、纖維化等慢性疾病，嚴重影響接受放射治療的病人的預后及生活質量。因此，了解X 射線誘導血管內皮細胞損傷的分子機制，對于降低放射治療的副作用，提高治療和預后效果，改善接受放射治療病人的生活質量具有重要意義。

細胞焦亡(pyroptosis)又稱細胞炎性壞死，是一種程序性細胞死亡過程，由細菌、病毒、毒性物質或者損傷刺激引起的程序化細胞死亡過程。相比其他形式的細胞死亡，細胞焦亡具有其特有的細胞死亡形態(tài)和機制。然而，這種形式的死亡從細胞形態(tài)上類似于壞死，細胞在接受外源性危險信號后，主要表現(xiàn)為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致細胞內容物的釋放，進而激活強烈的炎癥反應，最后導致細胞死亡。這一過程的關鍵分子是Caspase-1，它能夠被炎癥小體激活，激活的Caspase-1又會激活下游的分子，導致炎癥因子的釋放和打孔蛋白的作用，最終導致細胞破裂。細胞發(fā)生焦亡時，由于細胞膜的裂解，導致大量危險相關模式分子如ATP、DNA 以及IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-18 等細胞因子釋放到細胞外基質中，這又會導致眾多免疫細胞的聚集，從而延長組織內的炎癥級聯(lián)反應。在前期研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)，不同于細胞凋亡的典型表現(xiàn)(如細胞皺縮、凋亡小體的形成)， 人 臍 靜 脈 內 皮 細 胞 (human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)在受照后出現(xiàn)類似“細胞焦亡”的細胞脹大現(xiàn)象。此外，許多研究表明受電離輻射作用的細胞或組織通常會釋放出大量炎癥因子。由此推測，X射線照射的HUVEC在受照后可能發(fā)生細胞焦亡過程。本研究探討單次大劑量X 射線照射對HUVEC焦亡和炎性因子分泌的影響，并分析單次大劑量和多次小劑量X 射線照射對細胞焦亡影響的差異性。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)液均購自美國GIBCO公司；IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-18 ELISA試劑盒購自博士德生物公司，cleaved Caspase-1抗體，β-tublin抗體購自美國Cell Signaling 公司，Western blot 蛋白裂解液購自美國Pierce 公司、發(fā)光檢測試劑盒購自美國Millipore 公司，蛋白定量試劑盒、硝酸纖維素膜均購自北京普利萊公司，牛血清白蛋白購自美國Amresco 公司，戊二醛購自美國SPI Supplies 公司，OsO-PBS 購自美國Ted Pella 公司，乙醇、丙酮均購自美國Sigma-Aldrich 公司，發(fā)光檢測成像系統(tǒng)ChemiDoc XRC+為美國Bio-Rad 公司產品，F(xiàn)ACS Calibur 型流式細胞儀購自美國BD 公司，透射電子顯微鏡為日本電子公司產品，醫(yī)用直線加速器Precise購自瑞典Eleckta公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

實驗采用的HUVEC 由本實驗室保存。細胞用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、CO體積分數(shù)為5%、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中。

1.3 細胞照射條件

細胞實驗采用火箭軍總醫(yī)院醫(yī)用直線加速器Precise 進行X 線照射。劑量率為5 Gy/min，源靶距100 cm。單次大劑量照射10 Gy 后ELISA 檢測細胞分泌的4種炎癥細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-18)的情況，Western blot 檢測Caspase-1 蛋白活化水平及透射電鏡觀察細胞焦亡形態(tài)；采用流式細胞術檢測單次大劑量照射10 Gy 和多次小劑量照射(2.5 Gy/d，連續(xù)照射4 d)細胞焦亡率的差異。

1.4 ELISA法檢測細胞因子

細胞焦亡是一種炎癥性細胞程序性死亡過程，因此為證明X 射線誘導細胞焦亡的發(fā)生，采用ELISA 方法檢測了X 射線照射后0、6、12、24、48 和72 h HUVEC 分泌4 種炎癥細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-18)的情況。按ELISA 試劑盒說明書進行操作。將標準品和待測樣品各100 μL 依次加入孔中。酶標板加上封板膜，37 ℃反應90 min。反應后洗去酶標板內的液體。將準備好的生物素抗人相應抗體工作液按每孔100 μL依次加入(TMB空白顯色孔除外)。酶標板加上封板膜，37 ℃反應60 min。1×洗滌緩沖液洗滌3 次，每次浸泡1 min 左右。將準備好的ABC 工作液按每孔100 μL依次加入(TMB空白顯色孔除外)。酶標板加上封板膜，37 ℃反應30 min。1×洗滌緩沖液洗滌5次，每次浸泡1～2 min。按每孔90 μL依次加入已在37 ℃平衡30 min的TMB顯色液，37 ℃避光反應15～20 min。按每孔100 μL依次加入TMB終止液，此時藍色立轉黃色。用酶標儀在 450 nm 處測定吸光度

D

(450)值。再根據(jù)標準品曲線計算細胞因子濃度。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達

細胞焦亡的關鍵執(zhí)行蛋白為Caspase-1，而其被剪切成活化狀態(tài)是細胞焦亡的關鍵步驟，因此本研究采用Western blot 技術檢測了受照細胞中活化的Caspase-1 的表達。提取細胞全蛋白并定量，與5×蛋白上樣緩沖液混勻，置于沸水中加熱5 min 后，迅速放入冰中冷卻。取各組等量蛋白行SDS-PAGE 電泳，并采用硝酸纖維素膜轉膜，5% BSA 封閉后分別用活化的Caspase-1和β-tublin 一抗孵育，4 ℃過夜，二抗孵育，室溫1 h，滴加發(fā)光液，用發(fā)光檢測成像系統(tǒng)拍攝條帶圖像檢測蛋白表達，Western blot圖片灰度分析采用ImageJ圖像處理軟件進行分析。

1.6 透射電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)

采用0.25% Trypsin 消化細胞5 min，終止消化后1 000 r/min 離心3 min，去上清，在加入1 mL 2.5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中固定3 h。之后由北京大學醫(yī)學部電鏡平臺制作樣品，具體步驟為：用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，在1% OsO-PBS(pH=7.0)中固定1 h 后，在PBS 中洗滌3 次。然后，將樣品用梯度系列(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)乙醇脫水，每步脫水10 min，然后轉移到丙酮中15 min。樣品在體積比為1∶1 的丙酮和EPON 樹脂混合物中于室溫放置1 h，再轉入體積比為1∶3 丙酮和EPON 樹脂混合物中過夜。將標本置于包埋介質中，在37 ℃加熱約24 h，60 ℃加熱約48 h，最后用乙酸鈾酰和堿性檸檬酸鉛染色15 min，在透射電子顯微鏡中觀察細胞腫脹等細胞焦亡的形態(tài)變化并拍照。

1.7 流式細胞術檢測細胞焦亡率

FLICA 染料為可通過細胞的、無毒的、熒光標記caspase 的抑制劑，可以與細胞內活性的caspase 結合。羧基熒光素標記肽(Tyr-Val-Ala-Asp)-fluoromethyl ketone(FAM-YVAD-FMK)是FLICA 的成員之一，特異性的肽段序列Tyr-Val-Ala-Asp(YVAD)使得它可以特異的與活化的Caspase-1 共價結合，從而檢測細胞中活性的Caspase-1。

取濃度為 3×10～5×10/mL 的細胞懸液 300 μL制成樣品。取1 支FAM-YVAD-FMK 溶解在50 μL的DMSO 中，制備成150～300 倍的儲備液，分裝置于-20 ℃保存。取1 支儲備液用PBS 按1∶5 稀釋后制成FAM-YVAD-FMK工作液，每290 μL樣品加10 μL的工作液，37 ℃避光孵育1 h，每20 min 混勻1 次。用細胞洗滌緩沖液洗細胞兩次，每次2 mL，200 g離心10 min。

采用流式細胞術檢測時，細胞用300 μL 洗滌液緩沖液重懸置于冰上，過400目尼龍膜。采用488 nm的激光進行激發(fā)，配合530/30(FL-1/FITC channel)發(fā)射濾光片，PI 和FLICA(活化的Caspase-1)雙陽性的細胞(位于第三象限)即為發(fā)生焦亡的細胞，數(shù)據(jù)分析采用Cellquest 3.0軟件(BD公司)。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 單次大劑量X 射線照射HUVEC 后4 種細胞因子分泌水平的改變

10 Gy X 射線照射后 6～72 h，HUVEC 分泌的細胞因子IL-1β濃度明顯上升(圖1A)；照射組細胞分泌的IL-6 濃度在受照后12～48 h 高于對照組，并且在72 h 約升高為對照組的 2 倍(圖 1B)；TNF-α的濃度，照射組在受照后6～72 h 均高于對照組，并且6 h 和12 h 兩個時間點與對照組相比升高顯著；IL-18 的濃度，照射組在受照后12～72 h 與對照組相比均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(

P

＜0.05或

P

＜0.01)。

2.2 單次大劑量X射線照射對HUVEC內Caspase-1蛋白活化水平及細胞形態(tài)的影響

結果如圖2顯示，HUVEC接受單次10 Gy X射線照射后6～48 h，與對照組相比，各時間點6、12、24和48 h 的Cleaved Caspase-1 的表達量分別為對照組的1.43、1.52、2.82、1.47 倍，差異均有統(tǒng)計學意義(

P

＜0.05或

P

＜0.01)。

細胞焦亡的另一特征是，這種形式的死亡從細胞形態(tài)上類似于壞死，細胞在接受外源危險信號后，主要表現(xiàn)為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂。因此本研究采用透射電鏡的方法，檢測了細胞形態(tài)(圖3)。結果顯示，在同樣的標尺下，受照細胞出現(xiàn)腫脹和細胞體積增大的現(xiàn)象，并顯示出類壞死樣的變化，這些都符合焦亡細胞的典型形態(tài)學改變。

2.3 單次大劑量和多次小劑量X 射線照射對HUVEC焦亡的影響

采用單次10 Gy 和多次小劑量(2.5 Gy/d，連續(xù)4 d)的兩種照射形式分別對細胞進行處理，結合PIFLICA雙染的流式細胞術檢測受照后HUVEC的焦亡率(圖4A)。根據(jù)統(tǒng)計顯示(圖4B)，單次大劑量照射組和多次小劑量照射組細胞的焦亡率均明顯高于對照組[對照組焦亡率為(1.52±0.09)%；單次大劑量照射組焦亡率為(31.44±1.81)%；多次小劑量照射組焦亡率為(15.64±0.56)%；三組間比較，差異具有統(tǒng)計學意義(

P

＜0.01)]，說明單次大劑量和多次小劑量X射線照射均會引起HUVEC 焦亡率的增加；此外，單次大劑量(10 Gy)照射細胞的焦亡率明顯高于多次小劑量(2.5 Gy/d，連續(xù)4 d)照射細胞(

P

＜0.01)。

圖1 單次10 Gy X射線照射HUVEC后4種細胞因子分泌水平的變化

圖2 單次10 Gy X射線照射HUVEC對Caspase-1活性蛋白表達的影響

圖3 透射電鏡下觀察單次10 Gy X射線照射后HUVEC形態(tài)的變化

圖4 單次大劑量和多次小劑量X射線照射對HUVEC焦亡的影響

3 討 論

血管內皮細胞損傷是許多心腦血管疾病的病理基礎。流行病學調查結果顯示，電離輻射增加了心腦血管疾病的發(fā)病風險。因此，血管內皮細胞損傷在電離輻射防護領域引起了越來越多的關注。目前研究表明，電離輻射致血管內皮細胞損傷主要表現(xiàn)在細胞凋亡、細胞衰老、細胞因子的產生、血管凝血障礙、細胞代謝途徑的改變和血管黏附分子的改變等方面。電離輻射對血管內皮的損傷可改變促炎和抗炎細胞因子的平衡，從而釋放活性氧，還可以造成血管內皮細胞糖酵解、脂質代謝通路的失調，并破壞血管內皮細胞端粒功能或細胞內的免疫平衡。放射治療后，X 射線照射引起的血管內皮損傷還能導致血小板聚集、炎癥和血管重構，進而引起血管密度降低、缺血和纖維化。電離輻射引起的血管內皮細胞的急性損傷效應如果沒有得到足夠的補償和調節(jié)，就可能觸發(fā)受照機體內長期的血管功能障礙。因此，急需對電離輻射誘導的血管內皮細胞損傷機制進行研究，以期尋找到特定有效的分子靶點，采用藥物進行干預從而減輕電離輻射引起的毒性效應。

目前，在電離輻射領域中對細胞焦亡的研究鮮見報道?，F(xiàn)有報道指出，細胞焦亡是輻射致組織器官損傷的重要通路，并已在一些動物模型中證實，抑制細胞焦亡可達到緩解輻射損傷的作用。如Wu 等發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白A N/C可以抑制10 Gy Coγ射線誘導的活性氧的產生，降低炎癥小體NLRP3的活性，從而減少放射性腸損傷模型小鼠體內小腸細胞焦亡的發(fā)生，并提出鞭毛蛋白A N/C可能是放射性腸損傷的潛在治療手段；Liao 等報道，在接受頭頸部放射治療的患者中，常常發(fā)生放射性腦損傷，這主要與小膠質細胞的焦亡有關，他們進一步構建小鼠頭部放射損傷模型發(fā)現(xiàn)間充質干細胞(MSCs)移植可減輕小膠質細胞焦亡；此外，Liu等也通過實驗證實Coγ射線誘導巨噬細胞的焦亡，通過靶向調控Caspase-1 可以減少輻射引起的損傷。探討X 射線誘發(fā)HUVEC 焦亡的分子機制，將為放射性血管內皮細胞損傷防治方法的研究提供新的思路和潛在的作用靶點。本研究發(fā)現(xiàn)：①在10 Gy X 射線照射后，與細胞焦亡相關的4 種細胞因子(IL-1β、IL-18、IL-6 和 TNF-α)均分泌增高；②HUVEC 中被剪切的 Caspase-1(P20)在 10 Gy X 射線照射后6～48 h的表達高于未照射組；③流式細胞術實驗結果顯示，10 Gy X 射線照射后72 h，發(fā)生焦亡的HUVEC百分率高于未照射組；④透射電子顯微鏡實驗結果顯示，10 Gy X 射線照射后72 h，HUVEC 腫脹和破裂。以上實驗結果說明，X 射線照射能引起HUVEC 焦亡，并可能通過釋放IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α等細胞因子引起炎性反應。

目前，構建放射性細胞損傷的模型主要有單次大劑量照射和多次小劑量照射兩種方法。單次大劑量照射方案具有方便、快捷的優(yōu)點，故被多數(shù)研究者采用。但臨床患者的放射治療多采用多次小劑量照射方案。因此，本研究檢測了單次大劑量照射和多次小劑量照射對HUVEC 焦亡的影響。實驗結果顯示，單次大劑量照射(10 Gy)和多次小劑量照射(2.5 Gy/d，共4 d)組均會引起HUVEC焦亡的發(fā)生；此外，單次大劑量照射組細胞焦亡的比例明顯高于多次小劑量分割照射組。有研究表明，多次小劑量的照射方案對正常組織損傷較小。如陳艷芳發(fā)現(xiàn)，采用X 射線單次大劑量照射大鼠全腦引起的損傷程度高于多次中等劑量照射組；此外，潘純國等也報道，X 射線單次大劑量照射引起的小鼠放射性肺損傷和死亡率均高于多次照射組。本研究說明單次大劑量照射對人血管內皮細胞的損傷作用也強于多次小劑量分割照射。

綜上所述，X射線照射引起HUVEC焦亡；在總劑量相同情況下，單次大劑量照射引起的細胞焦亡損傷水平，明顯高于多次小劑量照射模式。抑制X射線誘導的細胞焦亡通路上的關鍵蛋白(如通路上游的炎癥小體、焦亡執(zhí)行分子Caspase-1 和下游效應分子Gasdermin 蛋白家族)可能減輕X 射線所致人血管內皮細胞損傷，但還需要進一步研究證實。