兩種國產(chǎn)熒光定量PCR試劑與Roche定量試劑的比較*

楊鑫城，單幼蘭

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染病科，重慶400010

乙型肝炎(下稱乙肝)病毒(HBV)感染是一個全球性的公共健康問題，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，2019年全世界約有2.96 億慢性乙肝患者[1]。我國是全球HBV感染率最高的國家，大約有9 000萬HBV感染者[2]。HBV具有高度傳染性，可以通過血液、性接觸或者母嬰傳播，感染后可導(dǎo)致急或慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。還有研究表明HBV感染不僅可以增加肝癌風(fēng)險，還可以增加其他癌癥的發(fā)生率，例如胃癌、胰腺癌等[3]。乙肝核酸(HBV-DNA)定量測定在乙肝患者的臨床治療過程中有著極為重要的參考價值，準(zhǔn)確定量血清中的HBV-DNA對醫(yī)生的診斷和用藥非常重要[4-5]。HBV-DNA還是直接反映HBV復(fù)制狀態(tài)及傳染性的最佳指標(biāo)[6]，HBV-DNA的含量能直接反映病毒在體內(nèi)存在的數(shù)量、是否傳染，傳染性有多強(qiáng)。此外，國外報道稱，較高濃度的HBV-DNA與肝細(xì)胞癌的發(fā)病率和快速進(jìn)展高度相關(guān)[7]。近年來，高靈敏度HBV-DNA技術(shù)因其檢測下限低和線性范圍廣等優(yōu)勢，越來越受到臨床醫(yī)生的關(guān)注，許多專家和指南也將高靈敏度HBV-DNA檢測結(jié)果作為HBV核苷酸藥物治療終點(diǎn)的重要指標(biāo)[8]。國內(nèi)有很多不同廠家生產(chǎn)的HBV-DNA熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒，不同試劑盒的性能存在一定差異，導(dǎo)致不同醫(yī)院之間的結(jié)果難以進(jìn)行比較[9]。因此，本文選用國內(nèi)兩種HBV-DNA RT-qPCR試劑盒及目前國際廣泛應(yīng)用的Roche試劑對71例臨床乙肝患者血清進(jìn)行檢測，并對兩種試劑的一些性能參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，比較檢測結(jié)果之間的差異性和相關(guān)性，探討各方法之間臨床應(yīng)用價值，以選擇更適合本實(shí)驗(yàn)室的試劑，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年10月至2020年3月在本院感染科實(shí)驗(yàn)室做高靈敏度HBV-DNA定量檢測的門診及住院乙肝患者標(biāo)本71例，標(biāo)本以4 000 r/min的速度離心5 min，將血清分裝至無菌EP管中，于-20 ℃冰箱冷凍保存，最長保存時間不超過6個月。HBV-DNA標(biāo)準(zhǔn)品(1.0×108IU/mL，批號300022-201601)購自中國食品藥品檢定研究院，使用陰性血清10倍梯度稀釋至相應(yīng)濃度值備用。

1.2儀器與試劑 核酸擴(kuò)增儀為Applied Biosystem 公司提供的ABI-7500熒光定量分析儀和羅氏公司的Cobas AmpliPrep/Cobas Taqman 48系統(tǒng)；A試劑由上海復(fù)星醫(yī)學(xué)有限公司提供，采用臺灣圓點(diǎn)奈米技術(shù)股份有限公司提供的FD-SLA-32型全核酸自動提取儀提取核酸；B試劑由北京納捷診斷試劑有限公司提供，采用靜態(tài)核酸制備技術(shù)對核酸進(jìn)行提取。

1.3方法 取用Roche定量試劑檢測過的71例血清標(biāo)本，分別用A、B兩種試劑進(jìn)行平行檢測，測定標(biāo)本的HBV-DNA載量，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒和儀器說明書進(jìn)行。

1.3.1A試劑檢測方法 在96孔預(yù)裝板第一列中加入300 μL標(biāo)本，放入核酸提取儀進(jìn)行提取，35 min后取提取結(jié)束的HBV-DNA 20 μL加入含有30 μL反應(yīng)液的反應(yīng)管中，低速離心后置RT-qPCR儀上進(jìn)行檢測。其擴(kuò)增條件為50 ℃反應(yīng)2 min，94 ℃保溫5 min，94 ℃ 10 s、60 ℃ 45 s，5個循環(huán)，再按94 ℃ 10 s、60 ℃ 45 s，循環(huán)40次，擴(kuò)增總時間約為80 min。

1.3.2B試劑檢測方法 將100 μL待測標(biāo)本加入分裝有裂解液的PCR反應(yīng)管中，輕輕吹打混勻，靜置 5 min，移至磁力架靜置3 min，吸棄上清液，加入250 μL漂洗液，靜置2 min，吸棄上清液。加入45 μL PCR反應(yīng)液即可上機(jī)檢測。擴(kuò)增條件為50 ℃反應(yīng)2 min，95 ℃保溫5 min，再按95 ℃ 15 s、62 ℃ 45 s，循環(huán)50次，擴(kuò)增過程需要90 min。

1.3.3Roche定量試劑檢測方法 取750 μL待測標(biāo)本加入樣品管，移至Cobas AmpliPrep儀進(jìn)行核酸提取，一個標(biāo)本大概需要45 min可以提取完成，提取結(jié)束后轉(zhuǎn)移至Cobas Taqman 48儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增過程需要150 min。

2 結(jié) 果

2.13種試劑檢出率及病毒載量分析 在檢測的71例血清標(biāo)本中，A試劑檢出陽性標(biāo)本49例，檢出率為69.01%；B試劑檢出陽性標(biāo)本60例，檢出率為84.51%；Roche試劑檢出陽性標(biāo)本44例，檢出率為61.97%，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.327，P<0.05)。A試劑HBV-DNA病毒載量檢測結(jié)果為(2.73±0.82)Log10IU/mL，B試劑HBV-DNA病毒載量檢測結(jié)果為(3.38±0.84)Log10IU/mL，Roche試劑HBV-DNA病毒載量檢測結(jié)果為(3.10±0.88)Log10IU/mL。A、B試劑分別與Roche試劑定量結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.282、0.611)。而A試劑與B試劑定量結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039)。見表1。

表1 三種試劑檢出率及病毒載量結(jié)果比較

2.2兩種試劑與Roche試劑檢測結(jié)果的陰陽性符合率比較 71例標(biāo)本中，A試劑與Roche試劑的陽性符合率為90.91%(40/44)，陰性符合率為66.67%(18/27)，總符合率為81.69%；B試劑與Roche試劑的陽性符合率為97.72%(43/44)，陰性符合率為37.04%(10/27)，總符合率為74.65%。根據(jù)檢測結(jié)果，A試劑與Roche試劑的Kappa值為0.597，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.267)，兩種試劑一致性中等；B試劑與Roche試劑的Kappa值為0.393，兩種試劑一致性一般，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 A、B兩種試劑與Roche試劑檢測結(jié)果陰陽性符合率檢驗(yàn)

2.3兩種試劑與Roche試劑檢測結(jié)果的相關(guān)性分析 3種試劑對71例血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，其中32例標(biāo)本的3種試劑檢測結(jié)果均有數(shù)值，其余至少有一種試劑未檢測出具體數(shù)值。對A、B試劑和Roche試劑檢測有數(shù)值的結(jié)果取對數(shù)值后進(jìn)行相關(guān)性分析。A試劑與Roche、B試劑與Roche的分別為0.896、0.908(均P<0.05)，A試劑與Roche、B試劑與Roche的相關(guān)線性回歸方程分別為Y=0.763X+0.590(R2=0.803)、Y=0.760X+1.100(R2=0.825)。見表3。

表3 A、B兩種試劑與Roche試劑的相關(guān)性分析

2.4A、B試劑的性能驗(yàn)證

2.4.1最低檢測限及最低定量限 A試劑重復(fù)檢測8次濃度為20 IU/mL的標(biāo)本，檢出率為100.00%，提示該試劑的最低檢測限為20 IU/mL，重復(fù)檢測8次濃度為100 IU/mL的標(biāo)本，檢出率為100.00%且對數(shù)值結(jié)果偏差均在±0.4范圍內(nèi)，提示該試劑的最低定量限為100 IU/mL；B試劑重復(fù)檢測8次濃度為20 IU/mL的標(biāo)本，檢出率為100.00%且87.50%的對數(shù)值結(jié)果偏差在±0.4范圍內(nèi)，提示該試劑的最低檢測限和最低定量限均為 20 IU/mL。

2.4.2線性范圍 A試劑數(shù)據(jù)處理后得到的回歸方程為：Y=-0.996X+8.925，R2=0.999。見圖1。通過最低定量限實(shí)驗(yàn)及此實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可知，A試劑在1.0×102～1.0×108IU/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

圖1 A試劑線性回歸直線

B試劑數(shù)據(jù)處理后得到的回歸方程為：Y=-0.985X+8.575，R2=0.999。見圖2。通過最低定量限實(shí)驗(yàn)及此實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可知，B試劑在2.0×101～1.0×108IU/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

圖2 B試劑線性回歸直線

2.4.4正確度評價 根據(jù)偏倚=(實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果-參比方法結(jié)果)/參比方法結(jié)果×100.00%，A、B兩種試劑檢測均有數(shù)值的結(jié)果剔除離群值后計(jì)算偏倚分別為-6.69%，6.08%。兩種試劑偏倚均在±7.50%內(nèi)，正確度良好，但B試劑與Roche試劑之間的偏倚絕對值更小，可比性更高。

3 討 論

盡管現(xiàn)在有很多有效的抗病毒藥物和疫苗，但是HBV感染仍然是世界范圍內(nèi)一個重大的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。為了判斷HBV感染的階段或者HBV感染者肝臟炎性疾病的發(fā)生進(jìn)展，需要進(jìn)行HBV-DNA定量檢測。HBV-DNA定量檢測在判斷疾病活動性、制訂抗病毒治療方案、治療監(jiān)測以及判斷治療終點(diǎn)中均起到重要作用[14]。目前，定量檢測HBV-DNA的方法有很多種，其中，熒光定量PCR是常用的檢測手段[15]。Roche試劑具有較高的靈敏度、精密度、重復(fù)性，被國際公認(rèn)為是HBV-DNA定量的參比試劑[16]，其最低檢測限為20 IU/mL，但價格昂貴，難以在基層醫(yī)院廣泛使用。A試劑核酸提取采用的是目前國內(nèi)常用的磁珠分離技術(shù)，最低檢出限為20 IU/mL，雖然其最低檢測限與Roche試劑的一致，但其最低定量限為100 IU/mL，高于Roche試劑的最低定量限20 IU/mL，這意味著使用A試劑進(jìn)行檢測時，100 IU/mL以下的病毒載量無法準(zhǔn)確定量，甚至有無法檢出的可能性。而B試劑所采用的是一種簡稱“靜態(tài)核酸制備技術(shù)”的方法，標(biāo)本處理和檢驗(yàn)在一個PCR反應(yīng)管中完成，其最低檢測限和最低定量限均為20 IU/mL，可以達(dá)到和Roche試劑同一個靈敏水平。在此次研究中，有2例標(biāo)本A試劑的檢測結(jié)果偏低，比B試劑和Roche試劑低了3個數(shù)量級以上，原因可能與不同基因型病毒株感染或病毒發(fā)生變異造成的引物探針不能有效結(jié)合有關(guān)。因此，對于實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果與臨床癥狀嚴(yán)重不符的標(biāo)本，有必要采用不同的試劑盒進(jìn)行復(fù)核，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

研究結(jié)果顯示，A、B試劑的檢出率均高于Roche試劑。不同試劑間檢測結(jié)果的差異考慮可能與試劑引物擴(kuò)增序列，或者某些乙肝病毒發(fā)生前區(qū)變異有關(guān)[9]，也可能與試劑的質(zhì)量或操作誤差等有關(guān)[17]。此次結(jié)果與既往的部分報道[18-19]不一致，這些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)試劑的陽性率低于進(jìn)口試劑，而此次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此兩種國產(chǎn)試劑的檢出率均高于Roche試劑。但此種差異是否是由于準(zhǔn)確度或靈敏度所導(dǎo)致的還需要更進(jìn)一步的研究。近年來國內(nèi)也有不少針對國產(chǎn)高靈敏度HBV-DNA定量的方法學(xué)研究報道[20-21]。本實(shí)驗(yàn)還將A、B試劑與Roche試劑病毒載量的結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)A、B試劑與Roche試劑定量結(jié)果之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明兩種試劑定量結(jié)果與Roche試劑無顯著差別。這與周美美等[19]報道有所不同，說明近年來一些國產(chǎn)HBV-DNA試劑定量性能方面逐漸優(yōu)化，可以和Roche試劑相媲美。而且本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)B試劑的定量結(jié)果稍高，這可能與其核酸提取的方式有關(guān)，其核酸提取和擴(kuò)增過程均在一個反應(yīng)管中進(jìn)行，減少了HBV-DNA提取過程的各種損耗。本研究將兩種國產(chǎn)試劑與Roche試劑的檢測結(jié)果在陰陽性符合率方面做了比較，結(jié)果顯示，A、B試劑與Roche試劑的符合率分別為81.69%、74.65%。相比之下，B試劑與Roche試劑的符合率偏低，這是因?yàn)樵赗oche試劑44例陽性標(biāo)本中，B試劑檢出了43例，僅有1例未檢出，而Roche試劑27例陰性標(biāo)本中，B試劑檢出了17例陽性，陽性符合率達(dá)到了97.72%，陰性符合率僅有37.04%。分析認(rèn)為可能是近年來一些國產(chǎn)熒光定量PCR試劑的靈敏度逐漸提高，可以檢測到Roche試劑無法檢測到的低濃度值，導(dǎo)致陰陽性符合率有較大的差異，期待后續(xù)補(bǔ)充完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)。在定量方面，A試劑與Roche試劑的r為0.896，B試劑與Roche試劑的r為0.908。說明兩種試劑的檢測結(jié)果與Roche都有良好的相關(guān)性，B試劑相對更好一些。此外，本研究結(jié)果表明，A、B試劑的最低檢測限均不大于30 IU/mL，符合《乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸定量檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》中限定HBV-DNA注冊試劑的最低檢測限[10]。極低水平的HBV-DNA在部分人群中有著重要的臨床意義[8]，行HBV-DNA 檢測能從HBV表面抗原無反應(yīng)性標(biāo)本中有效發(fā)現(xiàn)低病毒載量的乙肝患者，特別是能有效檢出OBI和HBeAg(-)慢性乙型肝炎患者，防止血清學(xué)漏檢[22]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，A、B試劑檢測值與理論值之間線性良好，分別在1.0×102～1.0×108IU/mL和2.0×101～1.0×108IU/mL濃度范圍內(nèi)成線性，r2≥0.995，符合要求。A、B試劑說明書所述的最高定量限分別1.0×109IU/mL和2.0×109IU/mL，但是本次實(shí)驗(yàn)未取得濃度高于1.0×109IU/mL的標(biāo)本，故僅驗(yàn)證108IU/mL以下的線性。驗(yàn)證的低、高濃度標(biāo)本重復(fù)性、精密度、CV均符合要求，驗(yàn)證通過，具有良好的重復(fù)性。本文還以Roche試劑為參比試劑，A、B試劑為實(shí)驗(yàn)試劑，分別驗(yàn)證了A、B試劑的正確度，平均偏倚均小于±7.5%，可以滿足臨床應(yīng)用的要求。

通過比較可以發(fā)現(xiàn)B試劑的性能相對A試劑更加優(yōu)越，B試劑核酸提取率較高，靈敏度和準(zhǔn)確度也較高，重復(fù)性更好，且具有更寬的線性范圍，但是自動化程度相對較低。總體來說，近年來我國國產(chǎn)的乙肝定量試劑性能逐漸優(yōu)化，定量結(jié)果方面與進(jìn)口試劑有良好的相關(guān)性，可以滿足臨床患者治療監(jiān)測的要求。各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)綜合考慮，在保證檢驗(yàn)質(zhì)量的前提下，選擇符合自己實(shí)驗(yàn)室的試劑。通過進(jìn)行A、B試劑的性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及與Roche試劑對臨床標(biāo)本的檢測結(jié)果比較可知，B試劑更適合本實(shí)驗(yàn)室，選擇B試劑將可以檢測到更低水平的HBV-DNA，核酸獲取率也更高，能為臨床提供更準(zhǔn)確的報告。