頤腦解郁方對卒中后焦慮大鼠炎性因子及p38-MAPK信號蛋白表達的影響

寇 娜，郝 鈺，趙瑞珍，趙子珺，王 丹，唐啟盛

卒中后焦慮(post stroke anxiety，PSA)是發(fā)生于腦卒中后以焦慮為主要表現(xiàn)的情緒障礙，發(fā)病率呈逐年增長趨勢，對病人的生存質量及死亡風險影響較大，故有效控制和治療至關重要[1]。本團隊前期研究證實p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38-MAPK)在腦卒中后病理變化和轉歸的過程中占有重要地位，且對腦神經炎癥應答有一定的影響[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，運用頤腦解郁方治療腦卒中后精神疾病療效顯著[3]。因此，本研究旨在探討炎性因子及p38-MAPK信號蛋白表達與卒中后焦慮的關系及頤腦解郁方的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性Wistar大鼠90只，6周齡，體質量200～220 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[動物許可證：SCXK(京)2016-0006]。大鼠分籠喂養(yǎng)，適應實驗環(huán)境1周，室溫22～25 ℃，相對濕度55%～65%，自由進食、飲水，普通飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

1.2 動物模型建立及分組 大鼠卒中后焦慮模型參考Longa等[4]報道的線栓造模方法，手術過程中室內溫度保持在27～30 ℃，并采用數(shù)字量表評價大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)神經功能，選擇術后24 h評分為7～12分中度損傷大鼠，采用不確定性空瓶飲水應激制備卒中后焦慮大鼠模型。實驗將30只卒中后焦慮大鼠隨機分為模型組、治療組，每組15只。另選取15只MCAO大鼠不予應激干預作為卒中組，15只正常大鼠作為正常組。其中治療組大鼠灌胃中藥頤腦解郁方，正常組、卒中組、模型組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，灌胃生理鹽水，每日劑量10 mL/kg，連續(xù)4周。動物保健及使用經過北京中醫(yī)藥大學倫理委員會實驗協(xié)議批準。

1.3 主要試劑及藥品 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)放免試劑盒由北京華英公司提供；p38-MAPK抗體(單克隆抗體，兔抗鼠)購于上海Abcam公司；BCA蛋白含量檢測試劑盒、50x蛋白酶抑制劑混合物購于北京凱基生物公司；5x SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、PAGE膠促凝劑、過硫酸銨及封閉專用脫脂奶粉購買于北京普利萊公司；細胞裂解液、5x Tris-甘氨酸電泳緩沖液、10x電轉液、10x封閉-洗滌緩沖液、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液及30%雙丙烯酰胺溶液購買于北京Solarbio公司；蛋白免疫印跡(Western Blot)一抗稀釋液購于上海Beyotime公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購于Millipore公司；蛋白質分子量Marker購于Thermo公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG及內參抗體購于北京博奧森公司；化學發(fā)光劑購于美國GE Healthcare公司；戊巴比妥購于國藥集團化學試劑北京有限公司；二甲苯購于天津市進豐化工有限公司；無水乙醇購于北京化工廠等。頤腦解郁方配方顆粒劑(刺五加20 g、梔子10 g、五味子10 g、郁金10 g)由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。灌胃劑量按照成人用量(每天20 mg/60 kg)的7倍計算大鼠用量濃煎，儲存于4 ℃冰箱中備用。灌胃前加熱，大鼠每日劑量為10 mL/kg，早晚各灌胃1次。

1.4 主要儀器 超純水儀(型號D7411)購于美國Barnstead公司；超聲破碎儀(型號YD-6L)購于金華市益迪醫(yī)療設備有限公司；轉移脫色搖床(型號TS-8型)購于海門市其林貝爾公司；電子天平(型號MP5002)購于上海舜宇恒平科學儀器有限公司；微型電動勻漿器(型號AG285)購于美國Sigma公司；電泳儀(型號DYY-8C)購于北京市六一儀器廠；垂直電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、半干轉電轉印儀購于美國Bio-Rad公司等。

1.5 曠場實驗 大鼠于末次灌胃后行曠場實驗，選取大小為100 cm×100 cm×40 cm的敞箱，四壁涂黑，底面平均劃分為25塊方格，實驗時將大鼠朝同一方向放入底部中心方格，安靜狀態(tài)下記錄大鼠中央?yún)^(qū)穿越方格數(shù)。水平次數(shù)以大鼠四肢均進入方格為準；直立次數(shù)以大鼠兩前肢離地1次為準。每只大鼠測定1次，每次3 min。每只大鼠實驗結束后清理糞便，用乙醇擦拭箱底，待酒精揮發(fā)后，進行下一只測試。

1.6 高架十字迷宮實驗 大鼠于曠場實驗后行高架十字迷宮實驗，兩條開放臂(50 cm×10 cm)、兩條閉合臂(50 cm×10 cm)以及連接開放臂和閉合臂的呈十字形的中央?yún)^(qū)(10 cm×10 cm)組成高架十字迷宮。實驗時將大鼠放到中央?yún)^(qū)，使其頭部正對其中一側開放臂，釋放后分別記錄大鼠3 min進入開放臂的次數(shù)、時間。每只大鼠實驗結束后清理糞便，用乙醇擦拭箱底，待乙醇揮發(fā)后，進行下一只測試。

1.7 TNF-α、IL-1α和IL-6的含量檢測 在末次灌胃行為學檢測后，每組隨機選取12只大鼠麻醉并腹主動脈取血，4 ℃離心10 min取血清，并用全自動放免計數(shù)儀按試劑盒說明的放射免疫法測定血清TNF-α、IL-1α和IL-6的含量。

1.8 p38-MAPK蛋白檢測 在末次灌胃行為學檢測后，每組隨機選取6只大鼠麻醉并斷頭取腦皮質和海馬體組織并迅速投入液氮中冷凍，然后轉移到-70 ℃冰箱保存。采用Western Blot法檢測p38-MAPK蛋白表達，其方法為將組織取出，放入預冷的研缽中加入液氮進行快速研磨成粉末，制備蛋白樣品并等量加載到SDS-PAGE凝膠上制膠、電泳、轉膜于PVDF膜、脫脂奶粉封閉，加入一抗(p38-MAPK濃度為1∶2 000；actin濃度為1∶2 000)，封口，4 ℃封閉培養(yǎng)過夜，二抗孵育(濃度為1∶2 000)1 h后曝光掃描，利用Image Pro Plus(Roper Industries，紐約，美國)測定波段的光學密度，結果以相對密度比表示。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用IBM SPSS 20.0統(tǒng)計軟件及Graphpad Prism進行數(shù)據(jù)處理。定量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，檢測數(shù)據(jù)均符合正態(tài)性分布，各組間方差齊，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠行為學測試 與正常組比較，卒中組水平及垂直運動次數(shù)減少(P<0.01)，開放臂次數(shù)減少，開放臂時間增加，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，模型組、治療組的水平及垂直運動次數(shù)、開放臂次數(shù)及時間均明顯減少(P<0.05或P<0.01)；與卒中組比較，模型組水平及垂直運動次數(shù)、開放臂次數(shù)及時間均降低(P<0.01)；與模型組比較，治療組水平及垂直運動次數(shù)、開放臂次數(shù)及時間均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

2.2 炎性因子應答 與正常組比較，卒中組、模型組、治療組大鼠血清TNF-α、IL-1α、IL-6含量均升高(P<0.01)；與卒中組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1α、IL-6含量升高(P<0.05或P<0.01)，與模型組比較，治療組大鼠血清TNF-α、IL-1α、IL-6含量降低(P<0.01)。詳見表2。

表2 頤腦解郁方對血清TNF-α、IL-1α、IL-6含量的影響(x±s) 單位：pg/mL

2.3 p38-MAPK蛋白的表達 與正常組比較，模型組大鼠海馬及皮質p38-MAPK表達顯著升高(P<0.01)；與卒中組比較，模型組大鼠海馬p38-MAPK表達明顯升高(P<0.05)，皮質p38-MAPK表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，治療組大鼠海馬及皮質p38-MAPK表達下降(P<0.01)。詳見表3、圖1。

表3 頤腦解郁方對P38-MAPK蛋白表達的影響 (x±s)

圖1 頤腦解郁方對p38-MAPK蛋白表達的影響

3 討 論

卒中后焦慮與原發(fā)性焦慮障礙相似，屬中醫(yī)學“郁證”“不寐”“臟躁”“百合病”等范疇[5]。唐啟盛教授認為，卒中后焦慮屬本虛標實，腎精虧虛為本，氣機壅滯為標。腎虛精水空虛，水不涵木，肝陽上亢而致氣血上逆，氣血瘀滯而致神竅閉阻，發(fā)為中風；中風病后，腎精虧虛，肝失所養(yǎng)，肝疏泄功能不調，氣機不暢，致肝氣郁結，肝氣郁久化熱，神受其擾，則出現(xiàn)坐立不安、煩躁擔心及汗出、心悸、手抖等一系列自主神經癥狀的焦慮樣表現(xiàn)[3]。其治療當以益腎調氣、解郁安神為治療原則[6]。頤腦解郁方由刺五加、五味子、郁金、梔子組成，方中刺五加益氣健脾、補腎安神，郁金疏肝解郁、行氣活血、清心安神，五味子益氣生津、補腎寧心，梔子瀉火除煩，四味藥物共奏益腎調氣、解郁安神之功效。本課題組前期研究已證實，唐啟盛教授臨床使用頤腦解郁方治療該病證有效率高達86.67%[7]。

本實驗采用不確定性空瓶飲水刺激復合腦缺血建立大鼠卒中后焦慮模型。在動物行為學方法中，高架十字迷宮能夠檢測動物焦慮模型是否建立成功。曠場實驗是利用大鼠懼怕空曠環(huán)境但又喜歡探索的心理沖突，其中大鼠進入中央?yún)^(qū)次數(shù)反映了對新環(huán)境的探究行為及適應度[8-10]。本研究數(shù)據(jù)顯示，模型組大鼠傾向選擇黑暗安全環(huán)境，開放臂停留時間以及次數(shù)明顯縮短，進入曠場中央?yún)^(qū)水平及垂直活動次數(shù)減少，表明不確定性空瓶飲水刺激復合腦缺血建立大鼠卒中后焦慮模型成功。與模型組比較，治療組大鼠開放臂停留時間及次數(shù)、進入曠場中央?yún)^(qū)水平及垂直活動次數(shù)增加，表明頤腦解郁方能夠減輕卒中后焦慮大鼠的焦慮程度。

近年來，大量研究表明炎性因子應答參與腦卒中及精神障礙的發(fā)病過程[11-12]。腦卒中后大量炎癥細胞浸潤和激活，引起強烈的免疫應答，同時激活小神經細胞、白細胞、巨噬細胞等產生炎性細胞因子，如TNF-α、IL-1α、IL-6等參與腦卒中的發(fā)病[13-14]。另有研究表明，TNF-α、IL-1α、IL-6等炎性因子由破壞的血-腦屏障進入中樞系統(tǒng)，促進下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的活化，并引起神經細胞丟失，促進焦慮的發(fā)生[13]。p38-MAPK活化參與多種炎性因子反應，而在下丘腦應激信號傳導系統(tǒng)中，通過外界應激，如促炎因子或細胞應激引起p38-MAPK磷酸化，增加神經元細胞損傷[2]。另外，研究證實在焦慮癥狀行為時，大鼠海馬p38-MAPK表達明顯升高，而抗焦慮藥物可降低p38-MAPK及其通路相關蛋白的表達，改善焦慮癥狀[15]。本實驗結果表明，與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1α、IL-6濃度，海馬及皮質p38-MAPK蛋白表達升高，與先前的研究結果[16]一致。而治療組大鼠TNF-α、IL-1α、IL-6濃度，海馬及皮質p38-MAPK蛋白表達均較模型組降低，表明頤腦解郁方可能通過降低腦卒中引起的p38-MAPK磷酸化水平，減輕炎性因子的應答，改善腦卒中后引起的焦慮障礙。

綜上所述，通過不確定性空瓶飲水刺激復合腦缺血成功建立卒中后抑郁大鼠模型，頤腦解郁方可改善腦卒中后引起的焦慮障礙，其機制可能與抑制下丘腦和皮質p38-MAPK磷酸化水平，減輕炎性因子應答相關，初步驗證p38-MAPK可能是頤腦解郁方發(fā)揮作用的一個靶點。